专利名称：1－苄基四氢异喹啉化合物，制备方法和应用的制作方法。 技术领域： 本发明属药物合成领域，具体涉及新型化合物N-烃基侧链/N-酰基侧链取代的1-苄基四氢异喹啉化合物，及其制备方法和应用。 背景技术： γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳类动物中枢神经系统(CNS)中的主要抑制性神经递质，与兴奋性的神经递质共同协调维持大脑的正常功能。据统计脑内大约有20％～40％的突触以GABA为神经递质，GABA受多种亚型的GABA转运蛋白的精确调控。GAT-1亚型在皮层神经元突触前膜上高表达，是参与GABA重摄取的主要蛋白。位于GABA能神经元附近胶质细胞上的GAT具有终止抑制性突触信号传递，调节GABA能突触的功能。远离GABA能神经元胶质细胞上的GAT具有清除扩散出来的GABA的功能。此外，胶质细胞重摄取GABA对兴奋性末梢突触前的GABAB受体可能起调节作用。GABA被神经元突触前膜上的GAT重摄取，在突触前神经元可以被重复利用，减少了GABA的重新合成。GABA被胶质细胞上的GAT重摄取后，由GABA转氨酶迅速代谢。在中枢神经系统疾病中，常会出现GABA能神经信号传递的降低，尤其是癫痫。据报道，癫痫的发病率在中枢神经系统疾病中约为0.5％～0.7％。美国约有250万人患有癫痫，其中约有80万人为部分性发作，每年癫痫的新发病人有12.5万人，且至少65万人用药后继续发生惊厥。WHO1995年的世界卫生报告估计有0.3亿人患癫痫。中国癫痫发病率也较高，约900万左右，尤其是青少年。研究发现GAT-1目前已成为筛选抗癫痫药物的主要靶点。GAT-1神经性或精神性疾病还涉及如焦虑，慢性疼痛或失眠等症。 近来有研究还发现在人体组织尤其是脑组织中存在四氢异喹啉结构的化合物。如下述结构的Salsolinol不仅能够诱导神经细胞死亡，而且能引起DNA损伤和具有基因毒性作用。Tetrahydropapaveroline(THP)是在帕金森氏病人的脑组织及尿液中发现的1-苄基四氢异喹啉生物碱结构的化合物。Bicuculline是从紫堇科植物中分离而来的2-苯并[C]呋喃酮异喹啉类生物碱。药理研究表明Bicuculline是GABA受体的选择性拮抗剂，目前已作为研究GABA受体作用的一个理想工具药来使用。 在对GABA转运蛋白抑制剂的研究过程中，Krogsgaard-Larsen等将二苯基丁烯基侧链引入到类似gamma-氨基丁酸由分子内环合成哌啶后的稠杂环氮原子上，如将其引入到四氢异噁唑哌啶醇的氮原子上得到的化合物(N-DPB-THPO)，同样具有GABA转运蛋白抑制剂活性。 发明内容 本发明的目的是提供一种具有良好GAT-1抑制作用的新型N-烃基侧链/N-酰基侧链取代1-苄基四氢异喹啉化合物。 本发明根据生物电子等排原理，将N-DPB-THPO结构中的四氢异噁唑环用其生物电子等排体如芳香的苯环来替代，合成N原子上引入亲脂性的二苯(杂)基丁烯基侧链的1-苄基四氢异喹啉化合物，或N原子上引入亲脂性的二苯(杂)基肟醚基侧链的1-苄基四氢异喹啉化合物。 本发明改造了天然1-苄基四氢异喹啉化合物结构，合成N取代的1-苄基四氢异喹啉衍生物。具体包括N-烃基侧链或N-酰基侧链取代的1-苄基四氢异喹啉衍生物。 本发明化合物通过初步GABA转运蛋白(GAT-1)体外竞争性抑制结合实验测试，显示了一定的GAT-1抑制活性，所述化合物可进一步制备新型GAT-1抑制剂药物。 本发明化合物N-烃基侧链/N-酰基侧链取代1-苄基四氢异喹啉化合物具有下述式结构I 其中，R1＝H或CH3或其它烷基；R2＝H或CH3或其它烷基； 或 (其中，Ar1＝苯基或取代苯基或芳杂环或取代芳杂环；Ar2＝苯基或取代苯基或芳杂环或取代芳杂环；R3＝取代的烃基侧链)本发明的优选化合物是具有下述1，2，3结构的化合物， 上述化合物通过GABA转运蛋白(GAT-1)体外竞争性抑制结合实验测试，结果显示具有一定的GAT-1抑制活性。 本发明所要解决的另一技术问题，是提供上述N-烃基侧链或N-酰基侧链取代1-苄基四氢异喹啉化合物的制备方法。 本发明公开的N-烃基侧链或N-酰基侧链取代1-苄基四氢异喹啉化合物可由下列反应路线获得。 路线1 路线2 本发明实施例1，详细描述了化合物1的制备方法，制备过程如下式 化合物1的制备工艺包括以3，4-二甲氧基苯乙胺和3，4-二甲氧基苯乙酸为原料在180～200℃条件下加热缩合得2-(3，4-二甲氧基苯基)-N-[2-(3，4-二甲氧基苯基)乙基]乙酰胺4，4在脱水剂氧氯化磷等作用下进行Bischler-Napieralski环合反应得化合物5，5被还原剂硼氢化钠等还原的化合物6，6与酸7在EDCI/HOBT作用下缩合得化合物1。 本发明实施例2，详细描述了化合物2的制备方法，制备过程如下式 化合物2的制备工艺包括以3，4-二甲氧基苯乙胺和3，4-二甲氧基苯乙酸为原料在180～200℃条件下加热缩合得2-(3，4-二甲氧基苯基)-N-[2-(3，4-二甲氧基苯基)乙基]乙酰胺4，4在脱水剂氧氯化磷等作用下进行Bischler-Napieralski环合反应得化合物5，5被还原剂硼氢化钠等还原的化合物6，6与酸8在EDCI/HOBT作用下缩合得化合物2。 本发明实施例3，详细描述了化合物3的制备方法，制备过程如下式 化合物3的制备工艺包括以3，4-二甲氧基苯乙胺和3，4-二甲氧基苯乙酸为原料在180～200℃条件下加热缩合得2-(3，4-二甲氧基苯基)-N-[2-(3，4-二甲氧基苯基)乙基]乙酰胺4，4在脱水剂氧氯化磷等作用下进行Bischler-Napieralski环合反应得化合物5，5被还原剂硼氢化钠等还原的化合物6，6与溴代物9在EDCI/HOBT作用下缩合得化合物3。 本发明所要解决的另一技术问题是公开上述新型N-烃基侧链/N-酰基侧链取代1-苄基四氢异喹啉化合物作为GAT-1抑制剂的应用。本发明新型N-烃基侧链/N-酰基侧链取代1-苄基四氢异喹啉化合物通过通过初步GABA转运蛋白(GAT-1)体外竞争性抑制结合实验测试，结果显示活性均明显高于阳性对照(R)-3-哌啶甲酸，表明具有GAT-1抑制活性。可进一步制备GAT-1抑制剂包括治疗神经性或精神性疾病如癫痫，焦虑，慢性疼痛或失眠的药物。 具体实施例方式实施例1合成化合物11-(3，4-二甲氧基)苄基-6，7-二甲氧基-1，2，3，4-四氢异喹啉-N-酰基衍生物(1)1)合成2-(3，4-二甲氧基苯基)-N-[2-(3，4-二甲氧基苯基)乙基]乙酰胺(3)在250ml反应瓶中加入3，4-二甲氧基苯乙胺21.5g(118mmol)和3，4-二甲氧基苯乙酸23.3g(118mmol)，加热到190～200℃反应2小时，冷却，用乙酸乙酯30ml溶剂反应物，用1N盐酸(4×20ml)洗涤，饱和碳酸氢钠液(4×20ml)洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。蒸去部分溶剂，再加入氯仿10ml，此时有固体析出，冷却，抽滤，得白色固体332.9g(收率77.5％)，m.p122-124℃。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ2.68(t，2H，J＝6.9Hz)，3.43(t，2H，J＝6.9Hz)，3.48(s，2H，-CH2CONH-)，3.85(s，4H，-OCH3)，3.86(s，2H，-OCH3)，3.89(s，2H，-OCH3)，6.62～6.74(m，5H，PhH).EIMS(m/z，％)359(M+，9.28)，195(3.56)，164(99.90)，151(100.00)，135(8.75)，107(24.11).FT-IR(KBr)v3326，2915，1716，1642，1519，1229，1144，1027，806，704. 2)合成1-(3，4-二甲氧基)苄基-6，7-二甲氧基-3，4-二氢-1H-异喹啉(4)化合物31.27g(3.93mmol)溶于无水甲苯30ml，氮气保护下，加热使固体溶解后，再加入三氯氧磷1.8ml(溶于20ml无水甲苯中)，加热回流反应3小时，反应毕减压蒸除溶剂，剩余物溶于二氯甲烷30ml中，用浓氨水调pH值为8～9，合并有机相，用水(1×10ml)洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，滤液蒸除溶剂，得淡黄色固体，用甲醇重结晶，得化合物40.91g(收率75％)，m.p.116～118℃。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ2.82(t，2H，J＝7.5Hz)，3.79(s，2H，-CH2PhH)，3.89～3.92(m，2H)，3.94(s，12H，-OCH3)，6.76～6.91(m，3H，PhH)，7.59～7.68(m，2H，PhH).EIMS(m/z，％)341(M+，1.61)，324(100.00)，312(94.91)，165(75.77)，137(14.47)，77(23.71).FT-IR(KBr)v 2970，1660，1515，1280，1135，1024，867，792，755. 3)合成1-(3，4-二甲氧基)苄基-6，7-二甲氧基-1，2，3，4-四氢异喹啉(5)在50ml反应瓶中加入化合物4 196mg(57.4mmol)，二氯甲烷15ml，甲醇10ml，冰水浴下，加入硼氢化钠65mg(1.72mmol)，逐渐升到室温反应3小时，加入水5ml，用二氯甲烷(2×20ml)萃取，合并有机相，用少量水及饱和食盐水洗涤，无水碳酸钾干燥。蒸去溶剂，得白色固体，用甲醇重结晶，得化合物5162mg(收率82％)，m.p.135～137℃。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ2.56～2.57(m，2H)，2.85～2.88(m，2H)，3.43～3.44(m，1H)，3.74(s，3H，-OCH3)，3.86(s，9H，-OCH3)，5.01～5.02(m，1H)，6.55～6.84(m，5H，PhH).EIMS(m/z，％)343(M+，1.77)，192(100.00)，176(36.64)，167(12.23)，139(26.54)，118(13.02).FT-IR(KBr)v 3299，2939，1609，1642，1516，1322，1257，1024，775. 4)合成1-(3，4-二甲氧基)苄基-6，7-二甲氧基-1，2，3，4-四氢异喹啉-N-酰基衍生物(1)在50ml反应瓶中加入原料酸6 224mg(0.91mmol)，二氯甲烷10ml，再加入DMF 3ml，加入HOBT 138mg(1.00mmol)，冷至-20℃，加入EDCI 196mg(1.00mmol)，保持-20℃反应1小时，再在室温下反应1小时，然后加入化合物5 344mg(1.00mmol)，在室温反应15小时，加入水5ml，分层，用二氯甲烷(2×20ml)萃取，合并有机相，用1N盐酸(1×5ml)，饱和碳酸氢钠溶液(1×5ml)洗涤，再用少量水及饱和食盐水洗涤，无水碳酸钾干燥。蒸去溶剂，硅胶柱层析(洗脱液石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)，得化合物1393mg(收率75.6％)，白色固体，m.p.180～182℃。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ2.56～2.57(m，2H)，2.85～2.88(m，2H)，3.43～3.44(m，1H)，3.74(s，3H，-OCH3)，3.86(s，9H，-OCH3)，5.01～5.02(m，1H)，6.55～6.84(m，5H，PhH).ESI-MS571(M+H)+，594(M+Na)+，610(M+K)+.HRMS(ESI)Calcd forC35H41NO6+Na594.2824840，Found 594.2826091.FT-IR(KBr)v 2933，1736，1639，1516，1465，1261，1115，1026，804. 实施例2合成化合物21-(3，4-二甲氧基)苄基-6，7-二甲氧基-1，2，3，4-四氢异喹啉-N-酰基衍生物(2)1)合成2-(3，4-二甲氧基苯基)-N-[2-(3，4-二甲氧基苯基)乙基]乙酰胺(3) 合成化合物3的方法同化合物1中3的合成方法一致。 2)合成1-(3，4-二甲氧基)苄基-6，7-二甲氧基-3，4-二氢-1H-异喹啉(4)合成化合物4的方法同化合物1中4的合成方法一致。 3)合成1-(3，4-二甲氧基)苄基-6，7-二甲氧基-1，2，3，4-四氢异喹啉(5)合成化合物5的方法同化合物1中5的合成方法一致。 4)合成1-(3，4-二甲氧基)苄基-6，7-二甲氧基-1，2，3，4-四氢异喹啉-N-酰基衍生物(2)在50ml反应瓶中加入原料酸7 163mg(0.86mmol)，二氯甲烷10ml，再加入DMF 3ml，加入HOBT 130mg(0.94mmol)，冷至-20℃，加入EDCI 185mg(0.94mmol)，保持-20℃反应1小时，再在室温下反应1小时，然后加入化合物5 323mg(0.94mmol)，在室温反应15小时，加入水5ml，分层，用二氯甲烷(2×20ml)萃取，合并有机相，用1N盐酸(1×5ml)，饱和碳酸氢钠溶液(1×5ml)洗涤，再用少量水及饱和食盐水洗涤，无水碳酸钾干燥。蒸去溶剂，硅胶柱层析(洗脱液石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)，得化合物2316mg(收率71.8％)，白色固体，m.p.105～107℃。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ1.14～1.29(m，3H)，1.41(s，6H，-COOC(CH3)3)，1.43(s，3H，-COOC(CH3)3)，2.57～3.01(m，3H)，3.04～3.12(m，2H)，3.32～3.59(m，1H)，3.71(s，3H，-OCH3)，3.76(s，3H，-OCH3)，3.78(s，3H，-OCH3)，3.84(s，3H，-OCH3)，4.59～4.74(m，1H)，5.53～5.76(m，1H)，6.37～6.42(m，1H)，6.52～6.77(m，4H).ESI-MS515(M+H)+，537(M+Na)+，553(M+K)+.HRMS(ESI)Calcd for C28H38N2O7+Na537.2575640，Found 537.2571227.FT-IR(KBr)v 3425，3319，2935，1708，1642，1517，1452，1260，1160，1028，861. 实施例3合成化合物31-(3，4-二甲氧基)苄基-6，7-二甲氧基-1，2，3，4-四氢异喹啉-N-烃基衍生物(3)1)合成2-(3，4-二甲氧基苯基)-N-[2-(3，4-二甲氧基苯基)乙基]乙酰胺(3)合成化合物3的方法同化合物1中3的合成方法一致。 2)合成1-(3，4-二甲氧基)苄基-6，7-二甲氧基-3，4-二氢-1H-异喹啉(4)合成化合物4的方法同化合物1中4的合成方法一致。 3)合成1-(3，4-二甲氧基)苄基-6，7-二甲氧基-1，2，3，4-四氢异喹啉(5) 合成化合物5的方法同化合物1中5的合成方法一致。 4)1-(3，4-二甲氧基)苄基-6，7-二甲氧基-1，2，3，4-四氢异喹啉-N-烃基衍生物(3)在50ml反应瓶中加入化合物5120mg，DMF 6ml，加入化合物9114mg，再加入丙酮20ml，碘化钾6mg，及碳酸钾48mg，室温搅拌反应50小时，减压蒸去溶剂，残余物中加入二氯甲烷20ml，用少量水及饱和食盐水洗涤，无水碳酸钾干燥。蒸去溶剂，硅胶柱层析(洗脱液石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)，得白色固体，3200mg，m.p.194～196℃，收率90％。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ2.24～2.46(m，1H)，2.73～3.07(m，4H)，3.19～3.24(m，1H)，3.62(s，3H，-OCH3)，3.77(s，3H，-OCH3)，3.80(s，3H，-OCH3)，3.82(s，3H，-OCH3)，3.83～3.92(m，2H)，4.26～4.34(m，2H)，4.61～4.64(m，1H)，6.05～6.07(m，1H，PhH)，6.54～6.94(m，4H，PhH)，7.28～7.44(m，10H，PhH).ESI-MS567(M+H)+. 实施例4.GABA转运蛋白(GAT-1)体外竞争性抑制结合实验1)使用的仪器与试剂所用的仪器液闪记数仪(Beckman LS 5000TA)，恒温水浴锅，电子天平，移液枪，秒表等。 试剂PPO2，5-二苯基噁唑(2，5-diphenyloxazole)；POPOP1，4-双-[5-苯基-2-噁唑基]苯(1，4-Bis-[5-phenyl-2-oxazoyl]-benzene)；含有10％小牛血清的RMPI 1640培养基；[3H]GABA(AmershamPharmacia Biotech)。 试剂配制PBS(磷酸缓冲盐溶液)在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，和0.24g KH2PO4，用HCl调节溶液的pH至7.4，加水定容至1L，在15lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸气灭菌20分钟，保存于室温；HBS(10mM Hepes，100mM NaCl，pH8.0)；闪烁液(PPO 3.6g，POPOP 0.36g，二甲苯600ml，Triton X-100300ml)。 2)测定步骤(1)按已知方法制备GABA转运蛋白基因筛选细胞工程细胞株GABA转运蛋白基因是最早克隆的神经递质转运蛋白基因。到目前为止，已克隆了四种GABA转运蛋白基因，它们属于Na+/Cl-转运蛋白家族。 将GAT-1基因克隆用细胞转染的方法转染到合适的表达载体(pCDNA3)上，将载体转入到真核CHO细胞中，通过大批细胞培养，使GAT-1基因克隆高表达量地表达于CHO(中国仓鼠卵母细胞)细胞中。通过测同位素摄取流量及West blot(抗体反应实验)以确定其表达量以及确定是否为目标蛋白(GAT-1)，从而获得单克隆细胞。将确定的GAT-1单克隆细胞经过传代细胞培养，得到大批的用于实验所需的含有GAT-1转运蛋白基因的筛选细胞工程细胞株。 (2)测定GABA转运蛋白的活性在含有10％小牛血清的RMPI 1640培养基中培养D8细胞于48孔板(Costar)至平板铺满(大约每孔6万细胞)。弃培液，用PBS洗涤一次，吸去PBS溶液，每孔加入90μl HBS，25℃温育10分钟，每孔加入10μl HBS反应液(含50nM[3H]GABA)。25℃温育20分钟，用冰浴的PBS溶液洗涤三遍，用100μl 2N NaOH溶液裂解30分钟，吸取各孔的裂解液加入到1.6ml的闪烁液中，放入液闪记数仪中检测同位素的含量，测定GABA转运蛋白的活性＞10万DPM。 (3)药物筛选实验(SOP)i.将接种培养好的48孔细胞板快速翻转甩去培养孔多余的培养液，并在吸水纸上吸干。 ii.每个培养孔用1×PBS洗一次，然后快速翻转，弃掉PBS，扣干。 iii.依次加HBS，阴性、阳性control每孔90μl，药物组每孔HBS+药物共90μl，室温放置10分钟。 iv.每孔加入预先配制好的10μl[3H]标记的同位素，室温放置20分钟(将1×PBS置于-20℃冰箱)。 v.冰PBS洗三次，并吸干。 vi.每孔加入2N NaOH裂解液100μl，室温放置20分钟。 vii.将裂解液从每个培养孔中吸出并各自转至2ml圆底eppendorf管中，每孔加入1.6ml闪烁液，颠倒混匀，装入5ml管中，放置于液体闪烁仪上测定3HDPM。 (4)制备标准曲线实验分三组总结合组、非特异结合组、标准样品组。每组双复管或三复管。所测得的量分别为总结合量、非特异结合量、测得量。总结合量已转染GABA转运蛋白基因的CHO细胞对[3H]-GABA的结合数(未加药的结合数)；非特异结合量未转染GABA转运蛋白基因的CHO细胞对[3H]-GABA的结合数；测得量加药后的已转染GABA转运蛋白基因的CHO细胞对[3H]-GABA的结合数。总结合量减去非特异结合量得到特异结合量。 可由下式求得标准样品对放射标记配体与GABA转运蛋白特异结合的抑制率抑制率(％)＝log[(测得量-非特异结合量)/(总结合量-非特异结合量)]*100％X＝-logM M浓度；Y＝log特异性结合率；-log(IC50)＝X(当Y＝log50)。 以浓度—效应对数作图法，以特异性结合抑制百分率的log值为纵坐标，以标准样品浓度的负对数为横坐标作图，得浓度与抑制率关系的线性回归方程，计算得到特异性结合抑制一半所需浓度IC50。 表1是本发明化合物的药理活性结果。 结果显示本发明化合物具有GAT-1抑制活性，其中化合物1和2的活性均明显高于阳性对照(R)-3-哌啶甲酸。 表1 权利要求 1.式I的1-苄基四氢异喹啉化合物， 其中，R1＝H或CH3或其它烷基；R2＝H或CH3或其它烷基； 或 其中，Ar1＝苯基或取代苯基或芳杂环或取代芳杂环；Ar2＝苯基或取代苯基或芳杂环或取代芳杂环；R3＝取代的烃基侧链。 2.根据权利要求1所述的1-苄基四氢异喹啉化合物，其特征是具有结构1的化合物， 3.根据权利要求1所述的1-苄基四氢异喹啉化合物，其特征是具有结构2的化合物， 4.根据权利要求1所述的1-苄基四氢异喹啉化合物，其特征是具有结构3的化合物， 5.权利要求1所述的1-苄基四氢异喹啉化合物的制备方法，其特征是对1-苄基四氢异喹啉母核做结构改造，包括N上烃基侧链或N-酰基侧链取代的1-苄基四氢异喹啉化合物，及在其苯环的上引入不同的烷氧基取代的1-苄基四氢异喹啉化合物，制备过程如下式，路线1 路线2 6.权利要求1的1-苄基四氢异喹啉化合物在制备GAT-1抑制剂中的用途。 7.权利要求1的1-苄基四氢异喹啉化合物在制备治疗神经性或精神性疾病药物中的用途。 8.权利要求1的1-苄基四氢异喹啉化合物在制备治疗癫痫，焦虑，慢性疼痛或失眠药物中的用途。 全文摘要 本发明属药物合成领域，涉及式I的新型N－烃基侧链/N－酰基侧链取代1－苄基四氧异喹啉化合物，制备方法和GAT－1抑制活性的应用。本发明改造了天然1－苄基四氢异喹啉化合物结构，合成具有N－烃基侧链/N－酰基侧链取代的1－苄基四氢异喹啉衍生物。通过GABA转运蛋白(GAT－1)体外竞争性抑制结合实验测试，结果显示具有GAT－1抑制活性，活性明显高于阳性对照(R)－3－哌啶甲酸。本发明化合物可进一步制备GAT－1抑制剂包括治疗神经性或精神性疾病如癫痫，焦虑，慢性疼痛或失眠的药物。 文档编号A61P25/20GK1721408SQ10026469 公开日1月18日 申请日期6月3日 优先权日6月3日 发明者闻韧, 张建革, 董肖椿, 林国强, 徐林峰, 郭礼和 申请人:复旦大学。
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