“肿瘤新生抗原” 抗癌之战的“利器”

细胞的恶性转化依赖于DNA损伤的积累。在过去的几年里，我们已经了解到，基于T细胞的免疫系统经常对这种DNA损伤所产生的新抗原做出反应。

此外，对新抗原的识别似乎是T细胞检查点阻断和过继T细胞治疗作为癌症免疫治疗的临床活性的重要驱动力。在这里，我们回顾了癌症新抗原与肿瘤控制相关的证据，以及这些抗原的生物学特性。

我们讨论了在个体患者中用于识别新抗原和识别新抗原的T细胞的最新技术进展。最后，我们讨论了在临床干预中可以利用癌症新抗原的策略。

引言

以T细胞为基础的免疫系统作为癌症生长的外部调节剂发挥作用。早期的临床前证据表明，获得性免疫系统在肿瘤控制中的作用来自于研究表明，缺乏免疫系统适应性臂(即缺乏B和T细胞)的小鼠更有可能因接触致癌物而患上肿瘤，甚至是自发的(1，2)。例如，支持T细胞在控制人类癌症中的作用的早期数据是由观察到的IL-2可以诱导一小部分患者的转移性黑色素瘤消退提供的(3)。

然而，基于T细胞的免疫系统在人类癌症中更广泛的相关性一直受到质疑，直到21世纪初。在这一点上，来自两个独立的临床研究的结果开始提供令人信服的证据，证明肿瘤特异性T细胞在人类黑色素瘤和其他人类癌症的消退中所起的作用。具体地说，美国国立卫生研究院的Rosenberg团队展示了注射体外扩增的自体肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)如何在黑色素瘤患者中诱导有临床意义的反应(4)。

这种疗效至少部分是由细胞毒性T细胞介导的(5)，但这些产品中的CD4 T细胞也可能起作用(6)。其次，在Allison和他的同事的开创性工作之后(7)，针对T细胞检查点CTLA-4的抗体被开发出来，并被证明在转移性黑色素瘤患者中显示出临床活性(8)。

此外，随后针对PD-1-PD-L1轴的抗体的临床发展表明，癌症免疫治疗的效果不仅限于黑色素瘤，还可以在非小细胞肺癌(NSCLC)、膀胱癌和微卫星不稳定癌症(9-14)等癌症中观察到。虽然PD-1-PD-L1轴也可能影响其他免疫细胞的活性(15)，但似乎针对这些分子的抗体的临床活性主要反映了它们对T细胞的影响。

具体地说，黑色素瘤对抗PD-1治疗的反应是通过CD8T细胞浸润的存在来预测的(16)。此外，预处理干扰素(IFN)签名(17)的预测潜力以及临床应答者(18)中此类签名的增加也与作为肿瘤消退驱动力的T细胞反应性一致。

总而言之，这些数据表明，在相当一部分癌症患者中，可用的T细胞谱系可以识别主要组织相容性复合体(MHC)(T细胞的工作方式)背景下肿瘤微环境中呈现的表位。了解这些肿瘤表位的性质具有重要意义，原因有很多。

首先，这将使人们了解人类癌症在表达的肿瘤表位的数量或类型上是否有所不同，以及缺乏足够的表位池是否会限制某一亚组患者的癌症免疫治疗的活性。

其次，这将使人们能够确定自发或治疗诱导的免疫压力是否可以通过达尔文式的选择改变肿瘤表位的谱系。

第三，也是最重要的一点，它可以引导免疫反应针对这些决定因素，提供潜在的更好的肿瘤控制前景。

多年来，人类癌症退行性抗原的性质一直是一个重要的争论问题。然而，多年来的研究已经提供了确凿的证据，证明由于DNA改变而产生的T细胞表位，即所谓的新抗原，形成了肿瘤特异性T细胞的主要靶点。

在这里，我们回顾了新抗原的相关性和这些抗原的生物学特性的证据。我们讨论了在个体患者中识别新抗原以及识别新抗原的T细胞的技术进步。最后，我们讨论了在临床干预中利用新抗原、新抗原特异性T细胞和新抗原特异性T细胞受体(TCR)的策略的持续发展。

2.新抗原重要的证据

随着细胞的恶性转化，MHC分子在细胞表面显示的多肽库会发生改变。作为致癌途径激活和表观遗传学改变的结果，肿瘤细胞经常表达蛋白质，例如癌症生殖系(C/G)抗原，其在健康组织中的表达仅限于免疫优势位点(19)。

作为第二个过程，肿瘤细胞积累的DNA改变可能导致形成一段全新的氨基酸序列，根据其特征，这些氨基酸序列可以与MHC分子结合。例如，与基因自身的C/G抗原相反，这种新抗原的遗传密码在健康组织中完全缺失。

从免疫学的角度来看，新抗原对人体确实是外来的，这一事实确保了针对新抗原的可用T细胞谱系的质量不会受到中枢T细胞耐受的影响，中心T细胞耐受通常会消除胸腺中针对自身抗原的(高亲和力)T细胞。此外，新抗原的肿瘤限制性表达确保了针对这些抗原的(治疗性)T细胞反应性的产生不会与正常组织中靶上和肿瘤外的毒性有关。

在这篇综述中，我们认为任何肽的产生都是肿瘤细胞体细胞获得性基因改变的直接结果，是一种潜在的新抗原。这些变化包括单核苷酸变异、导致移码的插入和缺失(Indels)以及结构变异。此外，对于病毒相关的癌症，病毒基因组中任何表达的开放阅读框架也可能被认为是新抗原的潜在来源。

除了这些明确的基因组改变的直接后果的多肽，术语新抗原有时也被用来描述被认为是完全肿瘤特异性的多肽，例如某些磷酸肽或由于RNA异常剪接而产生的多肽。在这些多肽中，新抗原这一术语有时被用来描述被认为是完全肿瘤特异性的多肽，例如某些磷酸多肽或由于RNA异常剪接而产生的多肽。

虽然一些磷酸化或RNA剪接事件可能完全是肿瘤细胞所特有的，但同样事件在健康组织中的低水平发生是很难排除的，似乎更可取的是将新抗原一词限制在那些毫无疑问由肿瘤细胞产生的多肽。

多年来，研究界已经获得了令人信服的证据，证明新抗原在一些恶性肿瘤中形成了肿瘤特异性T细胞反应的重要驱动因素。这些证据可分为三类：(A)针对这些抗原的T细胞反应性的发生；(B)突变负荷与T细胞检查点阻断的临床结局之间的关系；(C)新抗原特异性T细胞反应性的治疗性操作的抗肿瘤效应。

2.1.T细胞对新抗原的识别作用

在具有里程碑意义的研究中，Wlfel等人提供了T细胞识别人类癌症中突变多肽的第一个证据。(20)和Coulie et al.。(21)，现在是20多年前(历史时间线见图1)。在这两项研究中，从肿瘤细胞系制备的cDNA文库被用来鉴定肿瘤相关RNA转录本，这些转录本能使靶细胞致敏，以便被肿瘤特异性T细胞识别。

在接下来的几年里，类似的技术被用来在更多的患者中识别新的抗原，一项对一名黑色素瘤患者T细胞反应性的深入分析导致了Lennerz等人的研究。

结论是，“这些结果证明了细胞抗肿瘤反应的高度个体化，并支持对自体T细胞反应的主要目标的监测和治疗方法个体化的需要，这可能最终导致更有效的癌症免疫治疗。”然而，共同的肿瘤抗原，如黑素细胞分化抗原和C/G抗原(23)的同时鉴定，这可能会被用作大型患者群体的靶点，再加上在特定患者基础上解剖T细胞反应性的技术复杂性，导致人们对癌症新抗原的作用兴趣减弱。

现在，大约后的今天，技术的进步，特别是在高通量外显子组测序和基于T细胞的分析方面的进步，使得重新审视T细胞对突变抗原的反应性的发生和重要性成为可能(见第4节关于新抗原鉴定管道的技术讨论)。

图1：肿瘤新抗原发展历史概览

癌症新抗原领域的复兴始于Schreiber和Sahin小组的工作，他们利用小鼠模型证明了癌症基因组数据可以用来识别一组潜在的新抗原，然后可以评估这些新抗原的T细胞反应性(24，25)。不久之后，利用同样的方法评估癌症患者T细胞对新抗原的识别的第一批数据被公布(26，27)。

这些和随后的研究表明，在黑色素瘤患者的TIL产物中，经常可以观察到CD8和CD4 T细胞对突变抗原的反应(26-31)。新抗原特异性T细胞反应性随后也在其他一些人类恶性肿瘤中被证实，包括非小细胞肺癌、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌、胆管癌和结直肠癌(6，32-35)。

然而，重要的是，目前还不清楚在这些肿瘤类型中，可检测到新抗原特异性T细胞反应的患者比例是否具有可比性。此外，方法上的差异，加上可能的发表偏见，使这些研究之间的比较变得复杂。

T细胞对新抗原的反应性在黑色素瘤等对T细胞检查点阻断和TIL治疗有较高临床反应率的肿瘤中出现的频率，形成了癌症新抗原在这些治疗中可能作用的第一个简单测试。作为第二个间接测试，一些研究已经检测了T细胞检查点阻断或TIL治疗是否可以改变T细胞对分子定义的新抗原的反应幅度。

在黑色素瘤和非小细胞肺癌的研究中，在抗CTLA-4治疗中检测到新抗原特异性T细胞反应性增加了大约5倍，并且在开始抗PD-1治疗后可以检测到新抗原特异性T细胞反应(27，32)。

同样，在头颈部鳞状细胞癌(33例)和黑色素瘤(31例)的病例研究中，TIL治疗后新抗原特异性T细胞反应分别增加约100倍和1000倍。总而言之，这些数据表明，至少在某些人类癌症中，T细胞对新抗原的识别是常见的，免疫治疗可以增加新抗原特异性T细胞的数量。

2.2.。突变负荷的临床重要性

如果新抗原在T细胞介导的癌症控制中发挥重要作用，那么显示大量T细胞识别新抗原的肿瘤可能对T细胞攻击特别敏感。理想情况下，人们希望能够直接测量肿瘤细胞上MHC呈递的新抗原的数量，以及在大量患者中针对这些抗原的T细胞反应的数量。然而，实现这一点的技术还没有完全开发出来。

作为新抗原形成的指标，一些临床研究已经检验了肿瘤突变负荷(TMB)是否与肿瘤免疫治疗的临床反应性相关。在NSCLC患者中，PD-1阻断的临床益处与TMB(32)相关。在接受抗CTLA-4治疗的黑色素瘤患者中也观察到了类似的相关性，虽然较弱(36，37)。

与这些数据一致的是，在12种肿瘤类型(13，14)中，PD-1阻滞剂在DNA错配修复缺陷的肿瘤中显示出很高的临床活性。值得注意的是，在接受TIL治疗的黑色素瘤患者中，也观察到了TMB和临床反应之间的相关性(38)，因此可能代表了利用内源性肿瘤特异性T细胞反应的癌症免疫疗法的共同特性。

有趣的是，在接受抗PD-1治疗的患者中，突变负担低的非小细胞肺癌患者的无进展存活率似乎低于接受化疗的患者(39例)。在上述数据的基础上，Jaffee和他的同事评估了27种肿瘤类型(40种)的突变负荷与抗PD-1/PD-L1治疗的临床反应性之间的关系。这表明PD-1/PD-L1阻断后的临床反应也与不同类型癌症的TMB相关。

虽然这些研究提供了明确的证据表明，人类肿瘤中突变的数量在一定程度上可以预测对利用自然T细胞库的癌症免疫疗法的反应，但一些问题值得进一步关注。首先，虽然TMB当然可以与新抗原的形成相关，但DNA损伤量也可能通过其他机制与免疫控制相关，例如，通过引起细胞压力，这些压力可能被先天感知机制拾取。

评估突变负担是否影响固定T细胞谱系设置下的肿瘤控制的小鼠模型(因此，额外的突变不会导致T细胞反应性的扩大)可能对检验这一概念是有用的。其次，TMB与免疫治疗反应之间的相关性远不完美，至少有四种机制可以解释这一点。

1.在导致肿瘤中产生新的氨基酸序列的突变中，只有一小部分会产生T细胞识别的新抗原。换句话说，每个突变事件只代表新抗原彩票中的一张额外彩票。在这个彩票中，将会有一些患者，尽管突变负担很低，但偶然产生了强大的T细胞抗原。只有更准确地预测或直接测量肿瘤细胞和/或识别它们的T细胞上的新抗原的技术的发展才能避免这种随机效应。

2.肿瘤细胞团中突变的克隆性分布可能影响其作为免疫治疗反应预测因子的价值。具体地说，Swanton及其同事的工作已经证明，通过对T细胞表位的电子预测所确定的推断新抗原负荷的预测价值，在仅关注预测的新抗原时得到改善，这些新抗原被发现是由接受抗PD-1治疗的肺癌患者的肿瘤克隆表达的(41)。

此外，作者在少数患者中观察到新抗原特异性T细胞对克隆性突变的反应，而不是估计仅由部分肿瘤细胞(即亚克隆抗原)表达的突变。关于这些数据，虽然新抗原的克隆性肯定有助于它们作为肿瘤排斥抗原的质量(24)，但其他因素也可能解释或促成所观察到的肿瘤内异质性与治疗结果之间的关联。具体地说，现在已经描述了许多逃逸途径，这些途径允许肿瘤在免疫检查点阻断后逃避T细胞攻击(42-47)，就像在任何达尔文式的选择过程中一样，选择更合适的肿瘤细胞变体的能力将随着处于选择压力下的细胞群体中存在的遗传多样性而变化。

3.如下面进一步讨论的，关于突变衍生的新抗原作为肿瘤排斥抗原的作用的新数据不排除其他类型的抗原的贡献，并且肿瘤可能在这些非突变抗原的表达上有所不同。肾癌和Merkel细胞癌对PD-1/PD-L1阻断的反应性明显高于TMB基础上的预期，这可能是内源性逆转录病毒(40)和Merkel细胞多瘤病毒作为非突变抗原在这些疾病中的作用。

4.也许最重要的是，虽然抗原的存在是T细胞控制癌症的一个要求，但这只是众多要求中的一个。特别是，诸如全身免疫抑制、允许肿瘤部位的T细胞的能力以及肿瘤细胞对T细胞攻击的敏感性等参数是额外的限制点。因此，联合分析(克隆性)TMB和癌症免疫图谱(48)的其他参数的预测价值应该是有价值的。肿瘤免疫图谱的其他参数的重要性的间接证据是，在小细胞肺癌和错配修复熟练的结直肠癌中，对PD-1/PD-L1阻断的临床反应比基于TMB的预期要小得多这一事实为我们提供了间接证据，这一事实为癌症免疫图谱的其他参数的重要性提供了一个间接证据，即对PD-1/PD-L1阻断的临床反应比基于TMB的预期要小得多。例如，解释结直肠癌这种偏差的工作模型可能是转化生长因子-β作为T细胞排斥因子的作用(49)。

作为一种超越TMB分析的尝试，一些研究小组的目标是在使用癌症外显子组数据对T细胞表位进行电子预测的基础上，推断人类肿瘤的新抗原负荷。虽然这一努力值得称赞，但也应该注意到一些担忧。

首先，在预测的新抗原中，只有一小部分能被患者的T细胞识别(见下文和50)。因此，可以假设大约99%的预测表位没有受到T细胞的选择压力，而且在这些预测中有如此高水平的噪声，似乎不太可能有任何比仅仅计数突变事件更好的优势。其次，所有已发表的推断新抗原负荷的努力都缺乏对表位预测管道的特异性和精确度的简单分析。

在未来旨在建立新抗原负荷作为潜在更好的预测标志物的工作中，例如，不仅使用非同义基因变化而且使用同一组肿瘤中的同义基因变化来预测新抗原负荷将是有用的。只有当专注于非同义变化时，预测价值显著提高，才有可能认为该分析是新抗原负荷的有意义的反映，而不是一种复杂的表达突变负荷的方式。同样，预测新抗原不仅适用于患者携带的HLA等位基因，也适用于具有不同结合基序的HLA等位基因。在这种情况下，当使用匹配的HLA等位基因时，更好的预测能力将是理想的结果。

综上所述，人类肿瘤中DNA变化与癌症免疫治疗反应之间的相关性形成了新抗原在肿瘤控制中的作用的合理但仍然间接的证据。然而，基于上述原因，当单独使用时，TMB将始终是一个仅具有温和临床价值的生物标记物。

2.3. 新抗原特异性T细胞反应性的调控

要确定新抗原在肿瘤控制中的作用，最直接的方法是评估新抗原的存在或新抗原特异性T细胞反应性的存在/强度改变的后果。Schreiber和他的同事提供了新抗原特异性T细胞在小鼠模型肿瘤控制中作用的直接证据，他们在工作中展示了在重新引入T细胞识别的新抗原后，逃逸变异体恢复了肿瘤控制(24)。在人类黑色素瘤的案例研究中，T细胞对新抗原的反应性出现之后，随后出现了缺乏这些表位表达的病变，这与基于T细胞的选择是一致的(29)。

支持操纵新抗原特异性T细胞反应性治疗效果的证据来自多项研究。在小鼠模型中，接种新抗原可改善肿瘤控制(25、51、52)。此外，罗森博格的研究为新抗原特异性T细胞在人类环境中诱导肿瘤消退的价值提供了强有力的证据。在第一个病例研究中，用TIL产品治疗胆管癌患者，其中>95%的输注细胞对一种私人肿瘤抗原具有特异性，产生了客观的临床反应(6)。

在随后的研究中，一名结直肠癌患者接受了一种对KRAS突变具有高水平CD8 T细胞反应性(占总TIL的75%)的TIL产品治疗，在9个月的部分反应后复发的病变显示形成这种突变KRAS肽(34)的限制性元件的HLA-C等位基因丢失，这与T细胞介导的选择压力一致。最后，最近的研究表明，在注射具有高水平新抗原特异性T细胞反应性的TIL和PD-1阻滞剂的情况下，晚期乳腺癌完全缓解(53)。这些案例研究一起为新抗原特异性T细胞在人类癌症的肿瘤消退中的作用提供了最令人信服的证据。

2.4.肿瘤控制过程中其他抗原的作用

尽管突变抗原似乎构成了T细胞介导的肿瘤控制的重要成分，正如上面讨论的数据，但重要的是要考虑其他抗原也起作用的可能性。特别是对于临床应答率高于基于突变负荷的预期的肿瘤，非突变抗原的作用似乎是可能的。对于病毒相关的癌症，如默克尔细胞癌、爱泼斯坦-巴尔病毒和人乳头瘤病毒相关的癌症，病毒抗原可能有助于临床应答，从概念上讲，这些抗原可以被视为共同的新抗原。

此外，有证据表明，某些自身抗原在临床有效的肿瘤特异性T细胞反应中起靶点作用。特别是，NY-ESO-1抗原(癌症/生殖系抗原之一)的价值已经在一些研究中得到了令人信服的证明，这些研究测试了NY-ESO-1特异性TCR修饰的T细胞在不同恶性肿瘤中的输注(54-56)。

虽然NY-ESO-1表达足够均匀的患者比例很小，但这些数据确实表明，在没有可检测到的靶向毒性的情况下，自身抗原的治疗靶向可以导致肿瘤消退。其他自身抗原是否也有类似的作用还有待确定，但在肾癌(19)中高水平表达的、可被T细胞(57、58)靶向的人类内源性逆转录病毒可能是有趣的候选。

3.肿瘤新抗原的生物学性质

尽管新抗原在临床成功的免疫治疗中的作用已被广泛接受，但仍存在一些重要问题，例如肿瘤中新抗原库的大小和质量，决定其诱导T细胞反应能力的新抗原的决定因素，以及新抗原库在T细胞压力下的可塑性。近年来，快速积累的数据为这些问题提供了一些初步的见解。

4. 人类肿瘤新抗原的空间

对包含数千个人类肿瘤样本的大规模测序数据集的分析显示，不同癌症类型以及单个肿瘤类型(59，60)的体细胞突变数量存在相当大的差异。突变的数量从儿童和血液病癌症的大约每兆基数0.01到1个，到与黑色素瘤(紫外线)和肺癌(烟草烟雾)接触外部诱变剂相关的癌症的每兆基数超过400个。虽然已知癌基因的反复突变确实存在[如观察到T细胞反应所针对的CDK4和KRAS突变(20，34，57)]，但大多数肿瘤突变是在乘客基因(即，不赋予突变细胞生存优势的基因)中发现的，而且这些突变在患者群体中并不是相当频繁的(61)。

正如上一节所概述的，对于一些癌症类型，现在有足够的数据表明自发性新抗原特异性T细胞反应性(黑色素瘤)的频繁发生，或者TMB与检查点封锁(一些肿瘤类型)之间的关系。随着涵盖多种癌症类型的大型突变数据集的出现，仅根据肿瘤类型的突变负荷，使用这些组合数据来努力预测在哪些肿瘤类型中可以预期形成或诱导新抗原特异性T细胞活性是很有吸引力的。

以黑色素瘤(其中大多数肿瘤的编码序列每兆碱基包含10个以上突变)作为在大多数患者中观察到新抗原特异性T细胞反应性的参考肿瘤类型，第一个粗略的预测是，在肺癌、胃癌和结直肠癌(62)等突变负担接近每兆数据库10个突变的其他癌症中，也应该预期会频繁产生新的抗原特异性T细胞反应。

此外，在乳腺癌和胰腺癌等每兆碱基大约有一个体细胞突变的肿瘤中，偶尔出现的新抗原特异性T细胞反应可能是最低限度的。由于两个部分相关的原因，上述分析可能低估了肿瘤细胞上存在的新抗原库。

首先，并非所有肿瘤表达的新抗原都可能导致可检测到的T细胞反应性的诱导(63)，例如因为无效的T细胞启动，从而导致对可用的新抗原库的低估。其次，特别是对于具有大量突变的肿瘤，T细胞反应之间的竞争可能会限制形成的T细胞反应的数量(64)。为了使用外部参照对人类癌症的新抗原库进行基准测试，我们最近比较了不同人类恶性肿瘤中预测的新抗原的数量和已知可引发临床相关T细胞反应的病毒蛋白中的预测表位的数量。

有趣的是，这项外部基准研究表明，在25种不同组织类型的肿瘤中，高达50%的肿瘤可以被认为比这些病原体基准中最低的更具异质性(65)。这就回避了一个问题，为什么在其他类型中没有更频繁地检测到新抗原特异性T细胞的反应性。下面讨论的可能的解释包括癌症病变缺乏有效的T细胞反应性诱导，以及在肿瘤生长过程中编辑以前识别的新抗原。

3.2. T细胞可以识别哪些预测的新抗原？

除了计算机预测中确定的潜在新抗原的保留范围外，我们对免疫系统看到的新抗原有什么了解？在T细胞方面，很明显，CD4和CD8T细胞都能对新抗原做出反应，并有助于免疫监视。

虽然大多数研究都集中在CD8T细胞(22，27，32，66，67)的新抗原反应性上-因为它们直接杀死(肿瘤)细胞的能力，以及因为许多肿瘤缺乏MHC-II类分子的表达-现在很明显，CD4T细胞的活性也可以被肿瘤突变所激发。在黑色素瘤(30例)、胃肠道癌(68例)和淋巴瘤(69例)中观察到自然产生的CD4 T细胞对新抗原的反应，而CD4 T细胞与肿瘤控制的临床相关性的证据来自于观察到大量新抗原特异性的CD4 T细胞的输注导致转移性胆管癌患者的肿瘤消退(6)。

目前尚不清楚新抗原特异性CD4T细胞对肿瘤控制的作用机制，但先前在小鼠模型中的数据表明，CD4 T细胞反应可通过促进肿瘤特异性CD8T细胞反应而诱导对MHC-II阴性肿瘤的控制(70)。此外，肿瘤部位产生的CD4T细胞因子如干扰素-γ可能有助于肿瘤控制(71)。

虽然针对新抗原的自然产生的T细胞反应并不显示出对CD4或CD8T细胞谱系的严重偏见，但最近一项针对患者特异性肿瘤突变的长肽疫苗的临床研究观察到，尽管疫苗被设计为包括预测的MHC I类表位(72)，但仍经常诱导新抗原特异性的CD4 T细胞反应(见下文)。此外，以前在新抗原疫苗接种的小鼠模型中观察到偏向CD4 T细胞反应性(51)。

CD4T细胞的这种“非靶点”启动背后的分子机制及其对新抗原疫苗临床活性的贡献目前尚不清楚。一种可能的解释是，生长中的肿瘤启动CD4 T细胞的效率可能特别低，因此对自然产生的免疫反应的分析将大大低估MHC-II限制性新抗原池。作为第二个不那么乐观的解释，新抗原疫苗诱导的许多CD4 T细胞反应可能是针对肿瘤部位根本不存在的表位，因此本质上与肿瘤控制无关。显然需要更好地理解自然和治疗诱导的新的抗原特异性T细胞反应的价值。

不管反应的T细胞亚群(即CD4或CD8T细胞)如何，从目前可获得的数据中出现的一个重要观察结果是，绝大多数人类肿瘤中的非同义肿瘤突变不会导致可检测到的T细胞反应。在可能限制检测新抗原特异性T细胞群体的技术因素的限制下--如检测灵敏度、在许多努力中用作过滤器的新抗原预测管道的精确度，以及培养的T细胞群体的频繁使用(其组成可能受到体外扩增的影响)--几种生物学机制可能导致T细胞识别新抗原的稀疏性。

首先，新的抗原特异性T细胞的启动可能相对无效，例如由于肿瘤微环境内缺乏促炎信号(73)。第二，T细胞对所有预测的新抗原的反应可能受到免疫优势的限制，在这个过程中，T细胞的反应只受对一小部分潜在表位的反应所支配。免疫优势的机制尚不清楚，但在抗病毒免疫方面的工作表明，促成因素包括肽-MHC复合物的稳定性及其在抗原提呈细胞表面的密度，HLA基因型，以及现有同源TCR谱系的功能亲和力(74-77)。探索这些因素在多大程度上可以在硅胶中可靠地预测，以及这是否有助于识别真正的免疫原性新抗原，这将是一件有趣的事情。

支持不是所有MHC呈递的新抗原都能诱导可检测到的T细胞反应性的证据是在使用健康的供体淋巴细胞在体外产生新抗原特异性T细胞反应的工作中首次获得的(63)。此外，来自两个个性化新抗原疫苗试验的最新数据表明，可以从无法检测到的预防接种数(72，78)中诱导出强大的新抗原特异性T细胞群体。这三项研究与无效的T细胞启动和免疫优势是一致的，因为这两个因素限制了癌症患者自然产生的新抗原特异性T细胞反应的广度。

作为第三个也是更发人深省的解释，不断进化的肿瘤和基于T细胞的免疫系统之间的持续相互作用可能导致对单个肿瘤表达的新抗原谱系的选择或免疫编辑。在肉瘤小鼠模型中获得了令人信服的证据，表明CD8 T细胞压力导致T细胞识别的新抗原丢失(24)，而在人类黑色素瘤中的数据同样表明，CD8 T细胞识别的新抗原可能会随着时间的推移而丢失(29)。然而，编辑是否会导致大部分可用的新抗原谱系消失，或者形成一种不那么显著的逃逸机制，仍有待确定。

另外，如果新抗原的编辑被证明是常见的，这可能会影响MHC-I和MHC-II限制性新抗原在治疗干预中的相对价值。具体地说，由于CD4 T细胞对肿瘤细胞群体的影响在大多数情况下都是间接的，肿瘤细胞亚群丢失MHC-II限制性新抗原不太可能给这些细胞带来深刻的选择优势。同样，虽然只有一小部分肿瘤细胞表达的肿瘤突变将失去其作为疫苗候选的很大一部分价值，但对于CD4 T细胞表位来说，这种亚克隆性很可能不那么重要。

少数几个真正具有免疫原性的新表位的进一步特征是什么？从临床的角度来看，首选的新抗原是由患者共有的突变编码的表位形成的，为了减少免疫逃逸的风险，将其定位于对肿瘤生存至关重要的驱动基因。事实上，在许多情况下(20、57、68、79、80)已经确定了T细胞对这种“公共”驱动突变的反应性。

然而，纵观T细胞识别的新抗原的整个数据池，司机基因中的这种公共新抗原似乎是例外，而不是规则，大多数已被描述为引发T细胞反应的突变位于乘客基因上，在肿瘤发生中没有明显的作用(62)。

最近的工作表明，这可能部分是由于人群水平的免疫编辑，在肿瘤发生早期消除的免疫原性癌基因突变的概况取决于患者的HLA基因型(81)。为了以严格的方式测试这一模型，确定具有或不具有HLA-A0201等位基因的患者的体细胞CDK4R24C突变的相对频率，或者对其他癌基因衍生的新抗原进行类似的分析，不仅可以预测T细胞的识别，而且已经得到实验验证，这将是有用的。

不管针对乘客突变而不是司机突变的T细胞反应性的频繁检测是编辑的结果，还是仅仅反映了乘客突变的更大优势，上述情况的直接结果是，旨在增强和监测针对肿瘤特异性突变的T细胞反应的临床策略将需要针对患者而定，以便充分利用可用的新抗原。

最近的一些研究提出了免疫原性新抗原与病原体来源的抗原具有结构相似性的概念。这一分子模仿的概念以前已经被认为与自身免疫性疾病的发展有关，在这种疾病中，已经发现针对微生物和环境抗原的TCR与自身抗原发生交叉反应(82，83)。第一项研究报告预测的新抗原中的病原体样序列模体在抗CTLA-4治疗有反应的患者中普遍存在，但在无反应的患者中则不常见(36)。

然而，在对T细胞反应性已被实验验证的新抗原集合的独立分析中，没有观察到所提出的病原体样肽基序(84)，对原始论文的更正表明缺乏对数据的适当验证(85)。此外，在随后对一个独立的黑色素瘤队列进行的分析中，van Allen和他的同事(37)没有观察到任何证据支持CTLA-4阻断的反应者中存在这样的四肽基序。

最近的两项研究报告说，新抗原预测算法的扩展，包括与已知病原体衍生肽序列的相似性，显著提高了分别接受抗CTLA-4和抗PD1治疗的胰腺癌、黑色素瘤和肺癌患者的长期生存预测(86，87)。如上所述，In silo预测管道的精度较低(且通常未知)，似乎很难在假阳性预测的噪声中观察到任何信号，这表明这个问题需要进一步验证。一般说来，T细胞识别的新抗原大数据集的建立可能是更好地确定新抗原免疫原性决定因素的关键一步。

4.预测和识别新抗原的能力

如上所述，人类肿瘤中只有一小部分突变会导致T细胞反应性的诱导。为了更好地理解新抗原在肿瘤控制中的作用，特别是为了促进这些抗原在治疗方法中的开发，需要利用人类肿瘤的基因组信息来有效地确定哪些表位可以被CD4或CD8T细胞识别。

目前识别候选新抗原的过程一般始于使用全外显子组测序绘制肿瘤特异性遗传畸变图谱(图2)。此外，RNA测序数据可用于包括关于可选剪接事件的信息，以确定突变基因是否在肿瘤中表达，以及确定突变等位基因的相对表达频率。克隆或接近克隆的单核苷酸变异体的调用可以预期是有效的。

然而，Indels和结构变体的假阴性可能仍然更常见。此外，基因多样性程度高的肿瘤可以预期包含大量的突变，这些突变只存在于少数肿瘤细胞中，无论是好是坏，这些突变目前都被忽视了。在确定患者肿瘤中的遗传变异后，有三种方法可用于肿瘤特异性新抗原的下游预测或下游湿法实验室鉴定：(A)电子计算预测，(B)m a s s光谱分析，(C)基于T细胞的分析。

4.1. In silico 计算预测管线

突变是否会导致T细胞识别的新抗原的问题可以分解为两个较小的问题：一个特定的突变是否可能编码一种可以由给定患者的MHC分子呈现的肽？如果是这样的话，这个肽-MHC复合物有可能被现有的TCR谱系识别吗(图2)？许多参数决定了含有突变的肽是否可以由MHC I类分子呈递。首先，来自特定蛋白质的潜在多肽的数量与每单位时间降解的分子数量成比例(在稳定状态下，因此也与每单位时间合成的分子数量成比例)。

与此相一致，MHC结合肽库中蛋白质的表达已被证明与RNA表达水平相关(88)。蛋白质降解、转运到内质网(ER)管腔以及与内质网驻留的MHC I类分子结合的每一个后续步骤都构成了多肽库上的一个额外的过滤器，最终可以呈现在细胞表面。在抗原处理途径的这三个步骤中，MHC分子的配体偏好对MHC呈递的肽库的影响最大(89)。利用之前在传染病和自身免疫研究领域中MHC配体预测方面的努力，特别是已经开发出用于电子预测与大量MHC I类等位基因结合亲和力的神经网络工具(90)，可以合理地对抗原处理途径的这一部分进行建模。例如，NetMHC(91)和NetMHCPan(92)允许预测>80个HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因的不同长度的表位，输出的稳健性在一定程度上取决于给定等位基因的训练数据集的大小。

除了预测MHC结合亲和力外，许多计算性新抗原预测管道还将有关正确的蛋白酶体处理和肽运输的可能性的信息纳入ER(Netchop，NetCTL)(93，94)。此外，肽和MHC之间相互作用的稳定性是可以预测的，它与免疫原性的相关性似乎比MHC结合亲和力更强(95)。

虽然有相当程度的共识认为这些不同的参数影响MHC分子上的表位密度，但一个主要问题是如何最好地结合这些参数。对于这些不同的步骤使用二进制截断是简单的，但是忽略了这样一个事实，例如，低效处理可以通过高水平的表达或HLA结合来补偿，反之亦然。利用MHC配体的质谱数据，结合抗原呈递过程中不同步骤的潜在表位分数来训练模型。此外，为了避免将检测到的多肽分配给特定的HLA等位基因时的模糊性，Rooney和他的同事(96)利用了一组单等位基因细胞系，从而训练了一个神经网络，其性能优于在仅涵盖MHC结合亲和力的数据集上训练的网络。为了进一步改进这一方法，开发能够量化MHC结合的不同肽种类的分子数量的策略，而不是简单地测量它们的存在或不存在，可能是有价值的。

图2：T细胞识别的新抗原预测和检测工作流程。对正常和肿瘤DNA的外显子进行测序，以确定肿瘤相关突变，然后使用RNA测序数据分析肿瘤变体的表达。然后，可以使用预测变异肽序列与患者MHC单倍型的结合、预测蛋白酶体产生的肽裂解产物以及分析变异肽序列与自体肽的相似性的算法，在计算机中推断假定的新抗原。这种筛选是可选的，但在肿瘤突变负担高的情况下特别有价值，在这种情况下，现有的患者材料可能不足以对所有已识别的肿瘤变体进行实验验证。此外，在计算机技术中，新抗原的预测可能被MHC相关新抗原的质谱分析所取代，或与之相辅相成。

MHC-II限制性表位的电子预测是一件稍微复杂的事情，因为这些分子的肽结合槽的结合特性不那么严格。在传染病领域的努力已经导致了算法的建立，这些算法足够强大，能够以一定程度的置信度预测病毒病原体的免疫优势CD4 T细胞表位(97)。对于MHC-II限制性的新抗原，一个复杂的问题是，对于MHC-II阳性的肿瘤，CD4 T细胞可能识别多肽-MHC复合物，这些复合物要么是由肿瘤细胞处理内源性抗原产生的，要么是由抗原提呈细胞外源性获得的。对于后一种途径，肿瘤抗原的表达水平被认为是特别重要的，以允许抗原提呈细胞展示足够的抗原密度。在这个概念的基础上，Kreiter等人提出了这一观点。

基于预测的表位结合亲和力和编码基因的RNA表达水平，预测小鼠肿瘤模型中潜在的CD4 T细胞新抗原。在接受基于预测亲和力和抗原表达水平或仅根据抗原表达水平选择的多肽疫苗的小鼠中，肿瘤控制的比较显示，前者的肿瘤控制效果更好，与预期一致。

在接受结合亲和力相同，但在供体蛋白的表达水平和/或细胞内位置不同的疫苗的小鼠中进行肿瘤控制的系统比较，对于更好地理解决定肿瘤微环境中MHC-II限制性抗原呈递的参数将是特别有价值的。此外，为了加深我们对MHCⅡ类抗原表位的生物学理解，并改进现有的预测工具，由一系列MHCⅡ类等位基因呈现的外源性和内源性抗原的质谱数据将是非常必要的。

虽然MHC分子呈现突变肽显然是必要条件，但这并不能保证诱导T细胞的反应性。具体地说，在小鼠模型和人类疫苗中分析针对病毒抗原的T细胞反应的数据表明，在MHC呈现的病毒表位中，只有大约50%观察到T细胞的反应性。此外，针对少数被识别的病毒表位的T细胞反应在病原体特异性T细胞反应中占主导地位(89)。T细胞对MHC呈递的表位缺乏反应性可能是因为反应性TCR很难产生，或者因为反应性TCR也对自身抗原有反应，因此从T细胞库中被移除。后一种缺乏T细胞反应性的原因在新抗原特异性T细胞反应的背景下可能具有额外的重要性，因为单核苷酸变体是潜在新抗原的主要来源，与父母的自身序列只有一个氨基酸不同。

在以前的工作中，已经评估了对特定抗原的耐受性对T细胞对相关序列的反应性的影响，揭示了在许多情况下，MHC呈递的自肽中单个氨基酸的变化就足以逃避自我耐受性。在这个数据集中，T细胞对类似自身肽的表位缺乏反应性，偏向于电荷守恒的单一氨基酸替代和N-末端残基的单一氨基酸替代(98)。Calis等人。(99)已开始开发可用于通过将新抗原的序列与野生型对应物进行比较来赋予新抗原“外来值”的模型。

可以想象，这种类型的工具，以及预测多肽免疫原性而不考虑自身相似性(100)的工具，可以帮助提高新抗原预测的准确性。不幸的是，这些算法的质量在很大程度上取决于可用的湿实验室数据集的大小，而且与描述MHC结合的数据集不同，描述新抗原的免疫原性的数据集的大小仍然非常适中。利用目前可用的小数据集，可以解决单核苷酸变异形成的新抗原的相对频率，这些变异被预测会导致MHC结合潜力的改善或TCR暴露表面的改变。在不同的数据集(31,101)中，已经观察到针对这两个新抗原类别的T细胞反应，并且它们的相对出现似乎与它们在被评估的表位集合(31)中的比例大致成正比。

就像新抗原呈递管道的情况一样，在加入预测免疫原性的算法方面没有达成共识。此外，可能影响免疫原性的其他参数的可能作用目前尚不清楚，例如不同HLA等位基因对抗原提呈细胞(102)获得的交叉呈递抗原的能力，以及HLA等位基因(103)之间ER出口率和细胞表面表达水平的差异。

我们对表位呈递和表位免疫原性的不完全理解的一个主要后果是，不同的表位预测管道目前产生的输出有很大的不同。当监测T细胞对新抗原的反应时，这不是一个重要的问题，前提是所使用的监测技术可以处理足够多的假定新抗原。然而，当预测的新抗原被利用来设计患者特异性疫苗时，表位预测管道的低精度将导致真正的新抗原被排除在外，并可能导致T细胞对预测管道输出的假阳性表位的反应性抑制所需的免疫反应。

为了提高我们预测T细胞识别的新抗原的能力，最近成立了T细胞新抗原选择联盟，探索在各个实验室建立的电子计算管道的性能。通过向来自大学、非营利机构和生物技术公司的30个参与小组提供一组测序数据，该联盟可以确定预测输出中的(缺乏)重叠。此外，为了在这一比较中产生金标准，特斯拉联盟的目标是分析T细胞对患者材料中一组预测的新抗原的反应性(104)。随着来自其他学术研究的湿实验室验证的新抗原和T细胞识别的新抗原的数据集越来越大，这一努力应该会增加我们从基因组数据预测免疫原性新抗原的能力。

4.2. 质谱分析法

为了绕过我们在电子预测管道中高精度预测新抗原的能力的限制，质谱可以用来直接分析MHC配体组。目前的质谱技术使得从细胞系和患者材料中识别数千个MHC呈递的肽序列成为可能(105)。为了在获得的质谱中识别新抗原，根据癌症外显子组/RNA测序数据，将这些新抗原与所有可能的新抗原的预期光谱进行比较(即，与也用作计算预测管道输入的DNA改变产生的所有新形成的肽的列表进行比较)。为提高该方法的灵敏度，可参考预测的肿瘤抗原合成肽。此外，通过与电子抗原预测管线(106)相结合来减小搜索空间可潜在地用于改进新抗原的鉴定。

基于质谱的MHC I类配体分析表明，正如预期的那样，在小鼠和人类肿瘤细胞系上获得的肽序列中，只有一小部分是由新抗原形成的(105)。到目前为止，在肿瘤细胞系和肿瘤样本上发现的新抗原的数量(每个样本大约在1到5个之间，无疑有一些发表偏向于成功的鉴定工作)与发现的能够引发T细胞反应的新抗原的数量相当(见上文)。

然而，我们预计这些只是部分重叠的集合，一些MHC显示的新抗原没有被T细胞室看到，一些T细胞识别的新抗原被目前的质谱技术遗漏了。值得注意的是，具有低预测结合亲和力的表位已被发现呈现在足够的水平上，可以被质谱检测到，这可能是由于抗原的高表达和/或在抗原处理途径的其他阶段的高效率。这一观察结果强调了产生相对于影响抗原呈递效率的全套参数的潜在表位综合输出分数的策略的潜在价值。

几个小组已经证明，HLA配基组包括翻译后修饰的产物，如磷酸化、甲基化和糖基化(105)，以及蛋白酶体降解产物的剪接产生的肽序列(107)。对于后一类非规范多肽，先前的数据已经证明T细胞对剪接的非突变肿瘤抗原(108,109)具有反应性。

据我们所知，到目前为止，还没有包含翻译后修饰或通过肽剪接产生的新抗原的报道。然而，这可能是由于所使用的搜索空间中没有相关序列或修饰。虽然我们认为在未来的工作中极有可能发现具有额外修饰的新抗原，但这些肽的最终生物医学相关性在很大程度上将取决于它们是构成整个新抗原谱系的重要部分还是边缘部分。

使用质谱鉴定新抗原的一个潜在限制是，表位的某些特性可能会使其更难检测，例如因为溶解性问题，但这种影响的程度似乎很小(96)。在临床环境中使用质谱鉴定MHC呈递(NEO)抗原的另一个限制是传统的工作流程依赖于使用大量来自已建立的肿瘤细胞系的细胞。

然而，Krackhardt和他的同事最近证明了使用原发患者肿瘤材料来鉴定T细胞识别的新抗原的可行性，只使用了0.1g的肿瘤材料(110)。目前还不清楚这项技术是否已经能够检测到大部分MHC呈递的新抗原。然而，它确实表明，随着技术的持续进步，在临床环境中更广泛地使用质谱鉴定新抗原可能变得可行。

4.3. 基于T细胞的新抗原检测

作为评估MHC分子呈递新抗原的独立策略，可以使用来自癌症患者(26，27)或健康人(63)的T细胞。用于这种基于T细胞的检测系统的肽输入可以是由癌症外显子组/RNA测序(30,111)识别的一整套潜在突变多肽。可替换地，可以利用通过使用计算管道、质谱或两者的组合过滤的经筛选的推定新抗原集合(27、32、41)。与使用质谱法相比，基于T细胞的检测具有直接检测患者的T细胞是否携带了MHC呈递的新抗原的优点。作为一个(相关的)缺点，使用健康供体材料进行的T细胞诱导实验已经证明，MHC呈递的新抗原确实存在，在最初观察到这种突变的癌症患者中不能诱导可测量的T细胞反应(63)。

此外，新抗原特异性T细胞反应随着时间的推移和治疗的结果(29，32)的消长也意味着在给定时间点的T细胞分析将遗漏部分可用的新抗原谱系。基于T细胞的检测系统可能依赖于功能读数，例如干扰素-γ的产生或CD137mRNA的表达。或者，也可以使用装载了多组新抗原的MHC试剂来检测T细胞。当使用多肽的荧光编码(27、112)、镧系元素编码(113)或DNA条形码(114)时，可以非常高的灵敏度和使用少量的材料来测试针对大量假定表位的T细胞反应性。

缺点是，这些技术确实依赖于表位预测，而且仅对人类MHC I类等位基因的一部分(115)，就可以高效地产生必要的MHC试剂。作为提高功能分析灵敏度的一种策略，T细胞群体中可能会富集PD-1(66,116)和CD39(113)等表型标志物。然而，仍然需要更广泛地分析这种富集策略的价值，特别是对于不同人类恶性肿瘤的血腔。作为更广泛适用的策略，响应细胞群体的TCR测序可用于提高检测的灵敏度(117)。

通过提供对使用不同预测策略可能遗漏的内容的测量，利用这些不同的方法生成的大数据集，并且优选地使用以完全无偏的方式测试T细胞反应性的方法生成的大数据集，对于优化表位预测的计算策略将是有价值的。此外，T细胞检测和质谱鉴定的新抗原的大数据集的比较应该有助于该领域更好地理解新抗原免疫原性的决定因素(表1)。

4.4. 对MIANA的需求

识别癌症测序数据中的DNA变化并从这些数据中预测潜在表位的过程依赖于一些影响结果的软件包/算法。此外，DNA/RNA测序本身的各个方面(新鲜肿瘤或肿瘤株、肿瘤纯度、阅读深度)都会影响结果。

鉴于变数如此之多，存在一个重大风险，即使用的管道(包括我们使用的管道)不够透明，无法让实地的其他团体充分理解或复制这些管道。因此，外地为报告这类工作建立一个协商一致的框架似乎很重要。这样的“关于新抗原分析的最小信息”(MIANA)应该会改善对该领域新工作的审查，增加重复性，并增强我们将数据集结合到荟萃分析中的能力。

下面我们提供一个(可能不完整的)可能影响结果的因素列表，其中标准化报告将是有益的：

测序数据。DNA的来源(新鲜冰冻肿瘤材料与FFPE肿瘤材料与细胞系、肿瘤纯度、病史时间、部位)，以及所采用的测序方案(测序深度、覆盖范围、读数长度)。

基因组畸变的鉴定(变种称)。被分析的DNA改变的类型(单核苷酸变异、插入和缺失、基因融合)。所使用的额外过滤器(如癌细胞比例、变异等位基因频率、对无意义介导的敏感性衰减等)。使用RNA测序数据作为额外的过滤器，如果是这样的话，怎么确定cut-off。以上所有项目中使用的计算软件包以及影响灵敏度与精确度的设置。定制脚本的使用，以及访问此类定制脚本的方法。

潜在新抗原的预测。使用的计算工具(以及这些工具的版本)和已经使用的cut-off。

类似于之前开发的MIATA(关于T细胞分析的最小信息)框架(118)，一个概述如何报告这一不断增长的研究领域的数据的共识框架应该会促进我们利用基因组信息理解被人类T细胞隔间视为非我的能力的进展。

5.新抗原特异性T细胞反应性的治疗操作

到目前为止，最成功的免疫治疗干预措施是T细胞检查点抑制剂，它们要么扩大了肿瘤反应性效应T细胞库，要么允许改善肿瘤反应性效应T细胞库的功能。然而，T细胞检查点阻断没有固有的肿瘤特异性，并且观察到剂量限制性的自身免疫毒性，特别是对于CTLA-4阻断抗体和CTLA-4-和PD-1/PD-L1-阻断抗体的组合(119)。

在某种程度上，这种毒性对于晚期疾病和临床受益可能性很高的患者更容易接受，但在临床受益可能性较低的患者群体中，例如TMB较低的肿瘤类型患者中，这些毒性将成为越来越令人担忧的问题。

此外，随着对复发高危患者(120,121)开发新辅助免疫疗法的兴趣与日俱增，开发有效且毒性低的免疫治疗方案将变得越来越重要。第二个问题是，观察到先前存在的T细胞浸润与PD-1/PD-L1阻断反应之间的关系(16)表明，在许多肿瘤中，PD-1/PD-L1阻断治疗可以作用的新的抗原性T细胞可能太少了。

由于这些原因，特别增加新抗原反应性效应T细胞池数量的方法似乎非常有可能与T细胞检查点阻断疗法协同作用，有可能通过降低检查点抑制程度来减少与治疗相关的毒性，并有可能将当前疗法的效果扩大到更大的患者群体。

新抗原导向疗法可分为两大类：旨在增加体内新抗原特异性T细胞数量的新抗原疫苗和旨在为患者提供新抗原特异性T细胞以实现这一目标的新抗原导向细胞疗法(图3)。大量的学术团体以及生物技术和制药公司已经启动了开发这种基于疫苗和细胞的疗法的计划，在接下来的几年里，应该会有大量的数据来评估基于新抗原的疗法的临床潜力。

我们注意到，在新抗原预测算法等方面缺乏共识，这使得这些研究中的许多(良好的)数量很可能不会显示出实质性的临床活性。与此同时，这一方法背后非常有力的理论基础，加上来自老鼠模型的大量证据和来自人类研究的更多轶事数据(见下文)，使得基于新抗原的有效疗法的开发成为可能。

图3：新抗原疫苗和基于新抗原的细胞疗法的潜在价值。蜘蛛图描绘了新抗原疫苗和基于新抗原的细胞疗法在可扩展性、预期诱导的免疫反应的强度、克服免疫抑制的能力、预期诱导的免疫反应的广度以及开发早期疾病(例如作为新辅助治疗)的可行性方面的相对优势和劣势。

5.1.疫苗策略

根据积累的数据显示，例如黑色素瘤患者的T细胞(62)只识别一小部分潜在的免疫原性新抗原，而T细胞(63)至少可以识别这些新抗原中的一些，基于这些数据的积累，疫苗是扩大新抗原特异性T细胞反应的一种潜在的治疗干预措施。此外，在患者外周血和肿瘤部位观察到的新抗原特异性T细胞反应的幅度一般较低(26，27，32)，用新抗原疫苗提高这些T细胞反应的幅度似乎是有用的。

在过去的几十年里，癌症疫苗的名声特别差，在一系列临床研究中几乎没有表现出临床活性，可能会提出几个原因来解释这一点。首先，到目前为止测试的绝大多数癌症疫苗都集中在诱导对非突变肿瘤抗原的免疫，由于中枢(胸腺)或外周耐受机制，这些疫苗的临床影响可能不大。

作为另一种解释，我们目前的疫苗策略可能不足以诱导足以影响肿瘤控制的T细胞应答，或者(NEO)抗原特异性T细胞应答的幅度根本不是肿瘤控制效率的主要决定因素。这两种解释中的后一种似乎不太可能，因为人类肿瘤的T细胞启动似乎是无效的，并且考虑到在小鼠模型中疫苗诱导的T细胞反应的大小可以合理地很好地预测肿瘤控制(25，52)。

这两种解释中的前一种在这一点上很难排除，但梅里夫小组(122)开发的人乳头状瘤病毒疫苗在癌前病变中的有效性有利于疫苗诱导T细胞对免疫外来肿瘤抗原的反应的潜力，至少在早期疾病背景下是这样。

此外，Schreiber和Sahin小组的研究为新抗原疫苗在临床前模型中的潜在价值提供了证据。在Sahin及其同事的工作中，用覆盖50个突变的长肽(通过外显子组测序鉴定)接种小鼠，可导致T细胞对三分之一用于接种的多肽产生T细胞应答，其中CD4 T细胞应答出人意料地占优势，而这种接种可诱导肿瘤控制(25)。

在一项后续研究中，使用仅编码MHC II类表位的抗原编码RNA也实现了肿瘤控制(51)。Schreiber及其同事的数据显示，接种含有先前识别的T细胞识别的MHC I类新表位的合成长肽疫苗的肿瘤控制效果与T细胞检查点阻断后观察到的结果相当(52)。

已经报道了一些使用基于新抗原的癌症疫苗治疗癌症患者的临床试验，其中许多正在进行中。在Linette及其同事进行的首个人类临床试验中，3名III期黑色素瘤患者接种了一种基于自体树突状细胞的疫苗，疫苗中含有7个电子预测的HLA-A*02：01限制性新表位。接种疫苗后，既观察到先前存在的CD8T细胞反应的增强，也观察到以前检测不到的T细胞反应的出现(123)。

这项研究没有评估这些T细胞群体是否能够识别自体肿瘤呈递的新抗原，鉴于许多表位预测管道的精确度不高或精度不高，这种分析最好成为未来新抗原疫苗研究的核心部分。随后对黑色素瘤患者进行了两项临床试验，测试了新抗原疫苗作为手术后辅助治疗的效果。在第一个试验中，6名III期黑色素瘤患者接种了覆盖多达20个突变的长肽，并以POL Y：ICLC为佐剂。6名患者中有4名在接种疫苗25个月后没有复发，而2名确实有复发的患者在接受抗PD-1治疗后表现出完全的临床反应(72例)。

在第二次试验中，13名患者注射了涵盖10个突变的RNA。接种时5例转移性疾病患者中2例出现客观临床反应，3例在联合抗PD-1治疗后完全临床反应(78例)。在这两个试验中，接种疫苗增加了所有患者的新抗原特异性T细胞反应的幅度，这反映在以前无法检测到的T细胞反应的出现和先前存在的T细胞反应的增强上。此外，这两项研究都表明，疫苗诱导的T细胞群中的一部分能够对自体肿瘤产生反应，这与这些T细胞群可能的临床相关性是一致的。

为了测试增强卵巢癌新抗原特异性T细胞反应的可行性，Kandalaft和他的同事用一种以树突状细胞为基础的疫苗治疗了25名患者，这种疫苗装载了自体肿瘤细胞裂解物，作为单一疗法或与抗血管内皮生长因子-A+/化疗联合使用。在6例患者中，发现了新抗原特异性的CD8T细胞反应。虽然目前尚不清楚这些CD8T细胞反应是否能识别自体肿瘤细胞上内源性处理的抗原，但这些T细胞反应是在低密度的单个抗原的情况下诱导的，这一事实令人鼓舞，这可能表明新抗原疫苗在突变负荷较低的肿瘤中是可行的。

目前，新抗原疫苗设计的一个主要未知数是，主要针对CD8T细胞反应还是针对CD4 T细胞反应是最好的。CD8T细胞反应似乎与T细胞检查点阻断的反应有更大的相关性，但通过表位丢失逃逸的可能性更大。CD4 T细胞反应似乎更容易诱导，但当肿瘤特异性CD8 T细胞反应也被诱导时，这种CD4反应是否主要有价值目前尚不清楚。第二个考虑是，是否应该更好地以增强先前存在的免疫反应为目标，还是以诱导新的T细胞反应为目标。根据关于T细胞功能障碍的表观遗传印记的新兴数据，先前存在的T细胞群体数量的扩张似乎可能导致功能活性降低的细胞增加(125)。

此外，通过针对多个突变扩大肿瘤特异性T细胞反应，对于减少逃逸的可能性可能很重要，特别是对于具有高度分支遗传结构的肿瘤。另一方面，对先前存在的T细胞反应的关注确保了T细胞谱系的存在，并且该表位可以在肿瘤微环境的背景下导致T细胞的激活。

值得注意的是，新抗原疫苗只能解决阻止T细胞介导的肿瘤控制的其中一个问题，因此成功诱导新抗原特异性T细胞谱系并不一定等同于肿瘤排斥反应。为了进一步提高这些疫苗临床开发成功的可能性，在T细胞浸润较差(126)的肿瘤中，联合使用STING激动剂可能是有用的，而与T细胞检查点抑制剂联合使用，以确保肿瘤部位诱导的T细胞的功能可能非常关键。

与基于新抗原的细胞疗法相比，基于新抗原的疫苗可能在疾病的早期阶段更可取，因为到目前为止进行的研究中没有明显的治疗相关毒性。此外，新抗原疫苗的生产比目前的细胞治疗策略更具可扩展性，新抗原疫苗似乎更适合诱导广泛的T细胞反应。另一方面，晚期疾病的全身性免疫抑制可能会限制新抗原疫苗在这一亚组患者中的活性，与基于细胞的疗法相比，目前可以诱导的疫苗诱导反应的幅度很小(图3)。

5.2. 基于细胞的肿瘤新抗原治疗策略

作为新抗原疫苗的替代品，患者可以使用含有大量新抗原反应性T细胞池的T细胞产品进行治疗。根据支持新抗原特异性T细胞在癌症免疫疗法的临床活动中的重要作用的数据，罗森伯格小组(见第2节)用TIL培养物治疗黑色素瘤和其他恶性肿瘤患者，这些培养物被选为对新抗原具有高反应性。

在一系列病例报告中，有证据表明，在转移性胆管癌(6例)、结直肠癌(34例)和乳腺癌(53例)患者中，通过输注新抗原特异性CD4和CD8T细胞可以控制肿瘤。虽然这些数据表明了新抗原特异性T细胞的潜力，但其他接受类似新抗原特异性TIL产品治疗的患者并没有明显的临床反应(68)。此外，虽然目前使用的方法对揭示新抗原导向的T细胞产品的潜力具有重要价值，但基于TIL的、新抗原特异性的过继T细胞转移的广泛应用是很难想象的。

为了摆脱活的肿瘤材料作为肿瘤特异性T细胞的来源，已经开发了许多方法。首先，外周血T细胞可以被个体患者的新抗原刺激，以增强先前存在的新抗原特异性T细胞反应，或者从单纯的反应体系中诱导出新的反应。这一方法的概念证明是通过诱导新抗原特异性T细胞反应获得的，这种T细胞反应可以识别自体肿瘤株，并且在转移性黑色素瘤患者中确实显示出临床活性(127例)。

此外，开发纯化新抗原反应性(66,116)丰富的T细胞群体的技术可能有助于提高这种努力的效率。使用TIL衍生的新抗原特异性T细胞产品的第二个潜在问题是细胞在最终细胞产品中的适合性。T肿瘤浸润的T细胞可能获得一种功能失调状态，该状态在体外培养期间只能暂时或部分恢复(125,128)。此外，这些细胞在输注后的复制能力可能不大。为了避免这些问题，可以将具有所需反应性的TCR序列引入外周血T细胞(129)。大量数据支持使用针对共享自身抗原的TCR进行TCR基因工程的技术可行性(54,130)。随着用于高通量鉴定新抗原特异性TCR序列的平台的发展，将这种方法应用于患者特异性TCR变得现实(131)。作为使用患者来源的TCR的另一种选择，从供体材料中存在的新抗原特异性T细胞中获得的TCR也可能被利用(63)。

尽管实施这种基于细胞的疗法的努力将比实施新抗原疫苗要复杂得多，但一些潜在的优势也是值得注意的。首先，提供具有高比例新抗原反应性T细胞的细胞产品可能会诱导出当代疫苗无法比拟的T细胞反应。其次，由于T细胞的体外生长阶段和过继细胞移植前患者的淋巴消耗条件，晚期疾病患者的细胞活性受免疫抑制的影响可能较小，特别是在使用外周血源性(TCR修饰的)T细胞时。开发高效和可扩展的程序，将新抗原反应性TCR谱系移植到更合适的T细胞库，将是以标准化方式产生新抗原反应性T细胞产品的重要一步(图3)。

6. 小结

支持新抗原在临床成功的免疫治疗中的相关性的证据是令人信服的，并为这些抗原的治疗靶向提供了强有力的理论基础。鉴于许多表位预测管道的精确度并不理想，而且肿瘤细胞上似乎只有很少的新抗原表达，初步临床研究的一个主要目标应该是使用详细的免疫监测来更好地了解哪些突变事件产生更好的癌症排斥抗原。随着疫苗设计和基因转移技术的进步，这将为该领域提供以高度特异性的方式提高患者肿瘤特异性T细胞反应性的手段。

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