导语
大家好，我是北京大学肿瘤医院病理科薛卫成医生。中国临床肿瘤学会(CSCO)指出：所有新诊断的结直肠癌患者都应进行MMR或MSI检测[1]。今天我们就这个议题进行讲述，希望能够给大家带来一些收获。那么有关结直肠肠癌肿瘤标志物的检测方法有几种方法呢？通常最常用的有以下3种—第一种是免疫组化法，第二是基于PCR的方法，第三种是目前比较时新的方法，NGS，也就是二代测序法。
方法１免疫组化（IHC）
免疫组化顾名思义就是利用抗原与抗体相结合的这一特征，将组织中的抗原识别出来。在结直肠癌基因检测中通常需要检测6个基因，但实际操作时只需要检测4个标记物就可以满足诊断的需要，那么是哪4个标记物呢？其实就是MLH1、MSH2、MSH6以及PMS2(图1)[2]。这四种蛋白在正常的组织里应表达为阳性，同时绝大多数结直肠癌患者也应该在其细胞核中发现这四种蛋白的表达。但是，当其中一种及以上蛋白出现缺失时，我们称之为错配修复缺陷(dMMR)或错配修复基因突变。也就是说，免疫组化是一种通过使用相应抗体检测这四种常见错配修复基因在细胞核内表达的情况，明确是否存在错配修复缺陷。
图1 通过IHC检测MMR蛋白状态
当然，免疫组化虽然简便易行，几乎可以在所有的病理科进行实施，但在临床实践过程中，免疫组化检测本身存在主观性，且受检测抗体质量、检测过程(固定、染色)等因素影响，特异性和可重复性较低，且对样本质量要求高，导致各中心的检测准确率高低不一。
方法2 聚合酶链式反应(PCR)
PCR最早用于应用亲子鉴定或葡萄胎的分型上。在进行结直肠癌检测时，通常选择五个微卫星位点，通过PCR来判定是否有片段的长度或峰形出现异常[3]。随着PCR技术的不断完善，在进行一些检测时无需应用正常的组织作为对照，就可以直接测出微卫星的状态[4]。
肿瘤样本和对照样本对比，5个微卫星位点均未出现PCR扩增片段大小改变，称之为微卫星稳定性(MSS)。一般来说大约80%的患者属于微卫星稳定状态，那么对于剩下的20%微卫星不稳定状态如何评估呢？5个MSI检测位点中1个MSI位点出现PCR扩增片段大小的改变，为微卫星低度不稳定性(MSI-L）；5个MSI检测位点中2个或者2个以上的MSI位点均出现PCR扩增片段大小的改变，为微卫星高度不稳定性(MSI-H)[5]。由于MSS和MSI-L之间没有明显的肿瘤生物学特征差异，因此，临床上将MSI-L也归类为MSS；而dMMR则与MSI-H具有较高的生物学一致性(90%以上)。应注意，由于结果判读标准的不统一，以及某些MMR基因错义突变导致MMR蛋白功能缺陷却保留其抗原性等因素，约10%的dMMR患者，PCR结果为MSI-H。
方法3 二代测序法(NGS)
NGS可一次性全面检测多个基因位点和多种基因变异形式——一次性检测高达数十至上千个微卫星位点，远多于传统PCR检测方法的5-7个位点，具有更高的准确性，从而为患者提供更多信息，不仅能够降低成本，同时还能更好地保存有限的样本材料[6]。但NGS也有其自身的局限，这主要体现在基因选择、检测深度以及肿瘤组织所占比例等，而且在最终算法以及最后阈值设定方面也不能做到完全统一。当然，这些限制并不影响NGS检测的准确性。
说了这么多，相信大家已经对基因检测技术有了一定的了解，为了能够更加直观清晰地了解基因检测技术，我们将其主要信息总结如下(表1)[7]，方便大家理解。
表1 MSI状态检测方法学比较
注：MMIR：错配修复；MSI：微卫星不稳定；b-MSI：基于外周血循环肿瘤DNA的MSI； ctDNA：外周血循环肿瘤DNA；AFmax：最大等位基因频率；TMB:肿瘤突变负荷
需要注意的是，由于在技术手段、判断标准以及质控方面的要求不同，上述三种检测方法无法做到结果完全一致。在这种情况下，临床医生及患者会陷入一种两难境地：我们到底应该按照阳性结果进行治疗还是阴性结果进行治疗呢？这三种方法哪一个是金标准呢？其实就目前来看并没有所谓的金标准，对于因检测方法不同而出现结果差异时，我们要做的通常是通过检测方法的特性、多学科会诊以及对现行结果进行质控回顾和核实来进行判断。若某种检测结果仍为阳性，那么我们可以认为此时的病理结果为阳性，应进行相应的免疫治疗。
总结
当前基因测序技术主要为免疫组化、PCR以及NGS，三种检测手段均可比较准确的检测到标记物。但由于检测技术不同、当前对基因检测认知不足，在以后的研究中仍需进一步对基因检测技术进行落实和进一步探索，在可能的情况下以不同的检测方法进行互相印证有其必要性。
参考文献
[1] 中国临床肿瘤学会指南工作委员会,等. 中国临床肿瘤学会(CSCO)结直肠癌诊疗指南.
[2] 康世瑾,等. 免疫组化技术在病理诊断中的应用[J]. 中国医药指南, (14):294.
[3] 方丽,等. 微卫星不稳定性检测方法及临床意义[N]. 中国医药报,-01-07(004).
[4] 王琦,等. 微滴式数字PCR技术进展[J]. 中国医学前沿杂志, , 8(011):15-19.
[5] Gelsomino F, et al. The evolving role of microsatellite instability in colorectal cancer: A review[J]. Cancer Treat Rev. , 51:19-26.
[6] Sabour L, et al. Clinical Applications of Next-Generation Sequencing in Cancer Diagnosis[J]. Pathol Oncol Res. Apr;23(2):225-234.
[7] 中国临床肿瘤学会结直肠癌专家委员会, 等. 结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性检测中国专家共识[J]. 实用肿瘤杂志, , 34(5): 381-389.
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