摘要
根据基因表达的总体差异，乳腺癌被分为预后和治疗反应不同的亚型。管腔乳腺癌的基因表达和增殖是由雌激素受体α驱动的，靶向该转录因子是治疗这一亚型的最有效的方法。相比之下，目前还不清楚是哪些转录因子驱动了基底样三阴性乳腺癌的基因表达，也没有批准有针对性的疗法来治疗这种侵袭性亚型。在这项研究中，我们综合分析了大量的乳腺癌细胞系和患者肿瘤组织的DNA甲基化、染色质可及性、转录因子结合位点和基因表达等基因组学数据，以鉴定与基底样基因表达程序有关的转录因子。我们发现，糖皮质激素受体(GR)和STAT3结合到相同的基因组调控区，这些区域在基底样乳腺癌中是特异开放且非甲基化的。这些转录因子共同调节了数百个基底样基因的表达，且这些基因与预后不良有关。两种转录因子的小分子抑制剂联合治疗导致细胞系和患者衍生的器官模型中的细胞生长协同减少。本研究证实了GR和STAT3协同调节基底样三阴性乳腺癌基因表达的程序，为合理联合STAT3和GR抑制剂改善基底样三阴性乳腺癌的治疗提供了依据。
易基因点评：本研究是一个基于多组学数据进行转化医学研究的典范。作者巧妙运用多种表观遗传转录调控相关的数据，包括DNA甲基化和染色质可及性研究技术，结合转录组图谱研究进行与三阴性乳腺癌治疗及预后相关的转录因子鉴定，证实了GR和STAT3协同激活Basal-Like型三阴性乳腺癌的典型基因表达特征，STAT3和GR抑制剂联合治疗可提供协同治疗效果。对于关注后基因组时代转化医学，特别是精准医学的研究者，该项研究具有重要借鉴意义。
Introduction
根据总体基因表达差异，乳腺癌可分为预后和治疗反应不同的亚型。这些表达差异反映了肿瘤从中产生的正常细胞的转录因子(TF)、表观遗传状态和基因调控网络，以及它们在肿瘤发生过程中积累的变化。
正常乳腺细胞通过激活TF雌激素受体(ER)α和ER下游靶基因，对雌激素作出反应而增殖。表达ER的乳腺癌最常分为管腔亚型。这些管腔ER肿瘤用激素疗法治疗，以阻止ER激活其增殖转录程序。尽管这些肿瘤通常有野生型内质网，但这是一种非常有效的靶向治疗，因为它抑制了这类细胞中基因表达和增殖的主要调节因子。
相比之下，15%至20%的乳腺癌患者被诊断为三阴性乳腺癌(TNBC)，三阴性乳腺癌的定义是指雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受体2均阴性的乳腺癌患者。目前还没有FDA批准的靶向治疗TNBC。即使经过手术、放疗和细胞毒化疗的积极治疗，TNBC患者在3年内的复发率也很高，疾病死亡率也很高(38%)。对于TNBC来说，迫切需要替代的治疗策略。TNBC是一种分子异质性疾病，已有大量研究发现TNBC肿瘤亚群具有明显的分子特征。这些亚型包括具有与上皮向间充质转化相关的特征的肿瘤，通常被称为claudin-low或间质亚型，以及由雄激素受体(AR)而不是ER，现在通常被称为管腔雄激素受体亚型(LAR)，它对抗雄激素治疗有反应。TNBC最广泛的特征是基底样亚型，它区别于ER驱动的管腔乳腺癌。根据PAM50分型，约70%~80%的TNBC肿瘤为基底样型乳腺癌，基底样型和腔型乳腺癌之间存在数千个基因的差异表达，基底样型乳腺癌中表达上调的基因反映了TNBC生长快、预后差的特点。目前还不清楚哪些TF负责调节基底样亚型中的增殖转录程序。本研究的目的是确定在基底样乳腺癌中调节临床相关基因调控程序的因子，并确定抑制这些因子是否可以提供新的治疗策略来改善基底样癌患者的临床结果。
许多TF在基底细胞样乳腺癌中的作用已被研究。许多这样的转录因子调节基底样乳腺癌中的重要通路，而且这些转录因子经常相互调节彼此的表达。其中几种TF可以被小分子药物抑制，是很有希望的治疗靶点。目前尚不清楚的是，哪些TF负责驱动定义基底样亚型的基因表达特征，哪些TF位于主调控因子下游。
这项研究利用DNA甲基化、染色质可及性、TF结合、基因表达和细胞生长的综合分析，在大量乳腺癌细胞系和患者肿瘤中识别驱动基底样基因表达程序的TF。我们试图找出与腔性乳腺癌相比，基底样染色质中特别未甲基化且可获得染色质的调控区域。我们确定了其基序和结合位点在这些碱基特异调控区域高度富集的TF。然后，我们调查了这些TF是否在基底样癌中比管腔性乳腺癌更高表达，这些TF是否调控基底样基因表达程序中的基因，以及这些TF调控的基因是否与患者的预后相关。这种全基因组的方法使我们发现，两个TF[STAT3和糖皮质激素受体(GR)]之间的合作，而不是单一的“主调节器”，推动了基底样基因表达程序中数百个基因的表达。这种TF相互作用为基底样细胞提供了弹性生长能力。此外，在基底样细胞系和患者衍生的器官模型中，同时抑制两种TF导致细胞生长协同减少，这为基底样乳腺癌提供了一种新的治疗策略。
材料和方法 细胞系
本研究使用了以下基底样乳腺癌细胞系：HCC1569、HCC1954、BT-20、HCC1143、HCC1187、HCC1599、HCC1937、HCC70、MDA-MB-468、2-LMP、BT-549、HCC38、MDAMB-157、MDA-MB-231、MDA-MB-436、SUM102、SUM149和SUM159。
本研究以DY36T2、ZR-75-30、MDA-MB-453、SK-BR-3、BT-474、MDAMB-361、MCF-7、MDA-MB-134、T-47D和ZR-75-1为研究对象。
传代超过3个月的细胞系每6个月使用由犹他州大学DNA测序核心设施提供的短串联重复测试服务进行验证。
简并代表性亚硫酸氢盐测序技术（RRBS）
使用前面描述的方法在对细胞系进行简并代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)和CG甲基化的初步分析。在至少80%的细胞系中具有至少10倍覆盖率的CG位点被用于后续分析。为了鉴定在基底样细胞系和管腔细胞系之间差异甲基化的CG，在R软件包版本3.5.0中使用lm函数进行线性回归。使用R中的p值校正函数和Benjamini-Hochberg得方法校正P值以进行多重假设检验。校正后的P值小于0.05的CG使用pheatmap包版本1.0.10在R中可视化。RRBS数据可通过NCBI Gene Expression Omnibus(GEO)登录号GSE152202公开获得。
ENCODE TF结合位点的富集
从UCSC基因组浏览器下载名为wgEncodeRegTfbsClusteredV2.bed.gz的文件，该文件包含由ENCODE项目在各种细胞系中对149个TF进行的染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)实验中的TF结合位点。使用Bedtools交集来确定RRBS数据集中的哪些CG位置与文件中每个TF的结合位点位置重叠。与基底样CGs和管腔特异性CGs的重叠数归一化为RRBS中所有CGs的重叠数，以计算折叠富集。
肿瘤基因组图谱RNA测序及ATAC-seq分析
癌症基因组图谱(TCGA)乳腺癌样本的RNA测序(RNA-seq)数据文件是从UCSC Xena浏览器下载的。这些文件包含日志数据，因此在R版本3.5.0中将它们转换为可用数据。利用TCGA提供的PAM50亚型分类，DESeq2版本1.20.0用于识别基底样瘤和管腔瘤之间差异表达的基因，并可通过UCSC Xena浏览器下载。使用校正后的P值<0.05和系数小于0来识别基础特异性基因。用P值<0.05和系数大于0来鉴定管腔特异基因。
转座酶可及染色质高通量测序分析(ATAC-seq)来自TCGA乳腺肿瘤的数据以counts文件和bigwig文件的形式从Corces及其同事最近出版的《补充资料》中下载。利用TCGA提供的PAM50亚型分类，DESeq2版本1.20.0用于识别基底样瘤和管腔瘤之间可区别访问的峰，并可通过UCSC Xena浏览器下载。Pheatmap软件包版本1.0.10用于可视化使用校正后的P值<0.05和系数小于0确定的基础特异峰。分析基底样瘤中特异开放的ATAC-seq峰，以富集从JASPAR下载的JUN(MA0491.1)、STAT3(MA0144.1)和GR(MA0113.2)基序。用AME分析ATAC-seq峰中的序列，并与一级序列保守的2-聚体频率进行比较，用Fisher精确检验计算P值。使用具有默认选项的人类HOCOMOCOv11数据库，使用MEME-ChIP在14,094个最重要的峰(DESeq2校正后P < 5×10－11)上执行基序发现，这些峰在基底样瘤中是特异可访问的。
为了分析基底特异性GR和STAT3共享结合位点上的TCGA乳腺肿瘤的ATAC-seq信号，使用UCSC hgLiftOver将GR和STAT3共享位点的文件转换为hg38基因组构建，以与TCGA ATAC-seq比对兼容。Deeptools版本3.1.0 computeMatrix 用于为每个样本生成GR和STAT3共享站点的数据矩阵。使用R版本3.5.0计算每个样本跨区域的平均可及性。我们使用Mann-Whitney检验来确定基底样肿瘤和腔内肿瘤间的平均归一化ATAC-seq跨区域读取深度是否有显著差异。使用GraphPad Prism 7.0c绘制基底样和管腔样本的平均归一化深度的平均值和标准差。使用VIOPLOT_0.3.2创建GR和STAT3共享部位基底样瘤和管腔肿瘤的平均bigwig读数的violin plots，使用默认参数和等面积=T，h=0.04，Wex=0.9。
ChIP-seq
对4株基底样细胞(SUM159、MDA-MB-231、HCC1937、HCC70)和4株管腔细胞(MDA-MB-361、BT-474、MDA-MB-453、MCF-7)进行GR和STAT3的ChIP-seq。ChIP-seq实验中，蛋白质- DNA复合物通过1%甲醛在室温下共价交联10分钟。用0.125 mol/L甘氨酸孵育5分钟，以猝灭交联反应。用PBS (pH 7.4;Lonza)。用含蛋白酶抑制剂(Roche)的Farnham Lysis Buffer (pH 8.05 的5mmol/L PIPES, 85 mmol/L KCl, 0.5% NP40)裂解细胞。细胞裂解液于4℃，2000 rpm离心5min。上清液粗提的细胞核于-80℃保存。使用GR抗体(sc-1003，Santa Cruz Biotechnology)和STAT3抗体(sc-482，Santa Cruz Biotechnology)进行ChIP-seq。这项研究中使用的ChIP-seq协议的完整版本可在ENCODE项目网站上获得：/documents/df9dd0ec-c1cf4391-a745-a933ab1af7a7/@@download/attachment/Myers_Lab_ChIPseq_Protocol_v042211.pdf
STAT3和GR 的ChIP-seq数据已保存在NCBI GEO登录号GSE85579和GSE152203中。将ChIP-seq中的Fastq文件与人类基因组的hg19序列进行比对，参数如下：-m1-t-best-q-S-l32-e80-n2。通过比较dexamethasone诱导的细胞GR ChIP-seq与乙醇处理的GR ChIP-seq，以及输入对照文库的STAT3 ChIP-seq，确定ChIP-seq峰。使用基于模型的CHIP-SEQ-2分析(MACS2)调用峰，P值截止值为1e-10，mfold参数限制在15和100之间。Bedtools Merge用于合并来自每个ChIP-seq实验的MACS2窄峰bed文件。在每个细胞系的每个ChIP-seq实验中，使用Bedtools overageBed来提取每个合并峰值下的读取数据。DESeq2版本1.20.0用于识别阅读深度在基底样细胞系和管腔细胞系之间有显著差异的峰(校正后P值<0.05)，以及GR和STAT3 ChIP-seq实验之间的读取深度有显著差异(校正后P值<0.05)。在GR和STAT3 ChIP-seq实验中，GR和STAT3共有的GR和STAT3峰的读数深度在GR和STAT3 ChIP-seq实验中有显著差异(校正后P值<0.05)，但在同一亚型中GR和STAT3之间没有显著差异(校正后P值>0.05)。Pheatmap package version 1.0.10和Deeptools Version 3.1.0 computeMatrix和plotHeatmap函数用于创建ChIP-seq数据的热图。
RNA-seq
细胞系的RNA-seq已在前面描述过，这些数据可通过NCBI GEO登录号GSE58135公开获得。
单独或联合dexamethasone、STAT3 siRNA和SH4-54处理的MDA-MB-231和HCC70细胞株的RNA-seq结果如下：
STAT3 siRNA敲除采用GE Healthcare(L-003544-00-0005)ON-TARGET plus Human STAT3 siRNA kit(L-003544-00-0005)。此SMARTpool siRNA包含四个汇集的siRNA，每个siRNA针对STAT3 RNA序列的一个单独区域。ON-TARGETplus非靶向siRNA#1(D-001810-01-05)是一种非靶向对照。SiRNA SMARTpooll和非靶向siRNA靶序列如下：
ON-TARGETplus SMARTpool siRNA J-003544–07, STAT3:
GAGAUUGACCAGCAGUAUA
ON-TARGETplus SMARTpool siRNA J-003544–08, STAT3:
CAACAUGUCAUUUGCUGAA
ON-TARGETplus SMARTpool siRNA J-003544–09, STAT3:
CCAACAAUCCCAAGAAUGU
ON-TARGETplus SMARTpool siRNA J-003544–10, STAT3:
CAACAGAUUGCCUGCAUUG
ON-TARGETplus Non-targeting siRNA #1: UGGUUUACAUG-
UCGACUAA
siRNA转染实验在6孔板上进行，一式三份。根据说明使用脂质体RNAiMAX转染试剂(Thermo Fisher Science)。每孔含细胞，每孔加入250μLsiRNA-转染试剂混合物，最终浓度为25pmol siRNA，每孔7.5μL脂质体RNAiMAX试剂。
Dexamethasone处理采用6孔板，一式三份。用100nmol/L dexamethasone(D4902，Sigma Aldrich)或等体积100%分子生物级别乙醇载体对照(E7023，Sigma Aldrich)处理细胞4h。细胞用含10%β-巯基乙醇的RL缓冲液(Norgen Biotek)裂解。用动物组织RNA纯化试剂盒(Norgen Biotek)提取总RNA。
通过polyAselection (Dynabead mRNA纯化试剂盒，Invitgen)从250 ng总RNA中制备用于STAT3 siRNA和dexamethasone处理的RNA-seq文库，然后构建转座酶介导的非单链文库。文库在Illumina HiSeq 2000或HiSeq 2500测序仪上使用成对的50bp读数和6bp索引读数进行汇集和测序。Tophat v1.4.1用于将RNA-seq成对读数与GENCODE版本9进行比对。Cufflinks v1.3.0和BEDTools用于计算每个GENCODE转录本的原始数值。
用DESeq2版本1.20.0分别鉴定各细胞系在处理和对照条件下表达差异显著的基因。为了可视化具有不同表达的细胞系之间的基因差异表达，将对照样本中的基因表达除以平均值，并使用Pheatmap package version 1.0.10在R中的热图里显示归一化值。
对于GR和STAT3相互作用的研究，MDA-MB-231细胞被接种在6孔板中，在每孔4mL的培养基中约有30万个细胞，培养24小时。3个重复样本分别用1 μmol/L dexamethasone(DEX)、8 μmol/L SH4-54、不处理或dexamethasone+SH4-54联合处理24h。用350μL Qiagen RLT缓冲液和1%BME裂解细胞。RNA提取采用Norgen动物组织RNA纯化试剂盒。使用Illumina TruSeq Stranded RNA试剂盒和Ribo-Zero Gold制备RNA-seq文库，并在Illumina HiSeq2500上进行测序，作为50个循环的单端读取。使用带有参数-dta-p28-t-q-U的HISAT2版本2.1.0进行读数，并使用Samtools进行排序。使用FeatureCounts版本1.5.1从bam文件生成数据文件。
为了找出受GR和STAT3共同作用和协同调节的基因，我们使用了R中的线性模型(lm)函数。DESeq2归一化计算符合多变量模型，该模型包括GR活性项、STAT3活性项和交互作用项(GR：STAT3)。各基因的系数和P值用于识别受GR和STAT3的可加性和协同正、负调控的基因。协同作用被定义为交互作用项的的P值显著(<0.05)，而单独的GR和STAT3项的P值不显著(>0.05)。可加性被定义为相互作用项的P值非显著，以及同向系数的单独GR和STAT3项的P值显著。线性模型中的系数被用来确定GR和STAT3之间的相互作用导致了基因表达的增加还是减少。
来自STAT3 siRNA处理的RNA-seq数据可以通过NCBI GEO登录号GSE85579公开获得。
dexamethasone和SH4-54处理的RNA-seq数据可以通过NCBI GEO登录号GSE152201和GSE137535公开获得。
Kaplan-Meier分析
Kaplan-Meier绘图仪工具(参考；32)，分析基因表达与无复发生存率的关系。Kaplan-Meier图是使用公开的基因表达数据生成的，这些数据来自有无复发的生存肿瘤患者。使用Kaplan-Meier绘图仪工具提供的现有的亚型分类来选择基底样病例和管腔病例进行分析。对GR、STAT3和438个由GR和STAT3上调的基底样基因进行了分析。所有的分析都采用了以下选择：每个基因只使用一个JetSet最佳探针，多基因使用所选探针的平均表达，选择无复发生存率进行分析，在随访阈值(60或120个月)对患者进行调查，排除有偏移的数据，并删除多余的样本。根据最显著的数值将患者分成两组(“自动选择最佳截断点”选项)。
细胞生长的实时成像
使用IncuCyte Zoom活细胞成像系统(Essen BioSciences)进行分析。将MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞接种于96孔板中，每孔20,000个细胞。在进行滴定实验时，SH4-54的剂量范围为0~11 μmol/L，dexamethasone的剂量范围为0~2 μmol/L，联合处理时细胞分别加入8 μmol/L的SH4-54和1 μmol/L的dexamethasone。每隔2小时扫描一次平板，连续72小时，用IncuCyte ZOOM软件计算细胞联合度。通过将每个时间点的联合百分比减去第一个时间点的起始联合百分比来计算相对联合百分比。
患者源发性类器官样本培养试验
这项实验使用了两种源自患者的器官培养物，它们来自于原发的基底样TNBC肿瘤(HCI -001和HCI -002)。培养液为Advanced DMEM/F12、(Thermo Fisher 12634028)、5% FBS (Thermo Fisher 26140079)、1×Hepes (Thermo Fisher 15630080)、1×GlutaMAX Supplement (Thermo Fisher 35050061)， 1μg/mL hydrocor-tisone (Sigma Aldrich H0888)，10ng/mL hEGF (Sigma Aldrich E9644)， 50μg/mL gentamicin (Genesee 25-533)，10 μmol/L Y-27632 (Selleckchem S1049)。如前所述，在384孔板的每孔中，将有类器官组织分为50-100种接种在5%Matrigel(康宁354230)中。本实验以MDA-MB-231细胞株为阳性对照，在384孔板中以每孔500个细胞的速度培养。用SH4-54(0、1、2.1、3.2、4.3、5.4、6.5、7.6、8.8、9.9和11 μmol/L)和mifepristone(0、0.1、1.42、2.73、4.05、5.37、6.68和8 μmol/L)的所有可能组合处理细胞。72小时后，使用测量ATP的CellTiter Glo 3D(Promega)测量细胞存活率。应用Loewe加性分析计算协同性。
结果
基底样乳腺癌特异性调控区和候选转录因子的鉴定
我们假设，与管腔型乳腺癌相比，基底样型乳腺癌中特异性未甲基化的基因组调节区将富含参与控制基底特异性基因表达的TF结合位点。为了确定基底样乳腺癌的特异性调控区域，对28个乳腺癌细胞株系进行了RRBS，以测量整个基因组的DNA甲基化。这些细胞系包括18个先前被归类为基底样细胞的细胞系，以及10个先前通过PAM50亚型被归类为管腔的细胞系。这28个基底样细胞和管腔细胞系代表了TNBC内发现的异质性，包括以前被归类为间充质和LAR亚型的细胞系，以及具有BRCA1和BRCA2突变的细胞系(图1A)。在基因组中至少10倍覆盖率的479,746个CG位点中，3,748个CG位点在基底样细胞和管腔细胞系之间存在显著差异甲基化(线性回归Benjamini-Hochberg校正P<0.05)。为了将我们的分析重点放在潜在调节区的差异甲基化上，而不是基因本身体上，我们确定了3093个这些CG位置，它们位于基因组的启动子或基因间隔区(图1A)。DNA甲基化差异在管腔和基底样细胞系中是一致的，尽管它们存在分子异质性。
在腔性乳腺癌中，基因组的基因间隔区或启动子区域有1300个CG是显著未甲基化的。这些CG位点通过ENCODE Project发现在不同细胞系中对149个TF进行的ChIP-seq实验，TF结合位点的位置有相交部分。为了确定哪些TF在管腔乳腺癌细胞中特异性未甲基化的区域富集，将与这些CG相交的每个TF的结合位点数值除以ENCODE数据中每个TF的结合位点的数值(补充表S1)。序列特异性TF结合位点最高的是ER(6.9倍)、FOXA1(8.1倍)和GATA3(10.3倍)。这些结果证实了这种方法是合理的，因为ER、FOXA1和GATA3是已知的管腔基因表达程序的主要调节因子(图1A)。
在基底样乳腺癌中，基因组的基因间隔区或启动子区域有1793个CG是特异性去甲基化的。这些CG位点通过ENCODE Project发现在不同细胞系中对149个TF上进行的ChIP-seq实验，TF结合位点的位置相交的部分。这些区域中富集程度最高的特异性TF是JUN和FOS TF，它们通过异源二聚形成AP-1复合物(6.2倍)、STAT3(4.8倍)和GR(4.2倍；图1A)。这一结果使我们可以假设JUN、STAT3和GR参与调控基底样乳腺癌基因的表达。
为了进一步研究这一假设，我们试图使用初代人类肿瘤而不是细胞系，通过ATAC-seq直接研究染色质的可及性，而不是从缺乏DNA甲基化来推断它，并使用TF基序富集而不是ENCODE Project ChIP-seq实验，该实验不包括任何基底样乳腺癌细胞系。我们分析了59个原发性乳腺肿瘤的ATAC-seq数据，其中包括15个基底样肿瘤和44个管腔肿瘤，这些肿瘤按照PAM50亚型分类。与腔型肿瘤相比，基底样肿瘤中有110,156个区域特异性地呈现开放染色质(DESeq2校正P<0.05；图1B)。染色质可及性差异在基底样瘤和管腔瘤中是一致的，尽管这些组内的异质性包括以前被归类为间叶性和LAR亚型的肿瘤，有着不同的临床ER、PR和HER2状态，不同的AR表达，以及胚系BRCA1和BRCA2突变(图1B)。基序富集分析发现，JUN/AP-1(E-vaule＝1.59×10－1116)、STAT3(E-vaule＝7.13×10－373)和GR/PR/AR(E-vaule＝4.12×10－6)的典型基序在110,156染色质区域中显著富集，这些染色质区域在基底样瘤中特异开放，而在管腔肿瘤中关闭(图1B)。此外，在基底细胞样肿瘤中最显著的14,094个(DESeq2校正P<5×10－11)染色质区域进行了测序发现，这些TF识别的基序显著富集(补充表S2)。尽管GR基序也有显著富集，但低于STAT3和JUN/AP1的富集程度，这与以前的研究是一致的，即GR可以通过蛋白质相互作用与某些增强子结合，而不是直接与DNA结合。
图1.与管腔型乳腺癌相比，在基底样型和管腔型乳腺癌中，对未甲基化和开放染色质区域富集的候选TF的鉴定。A，基底样型和管腔型乳腺癌细胞系之间显著差异甲基化的CG位置热图(线性回归Benjamini-Hochberg校正P<0.05)。ChIP-seq实验显示在各种细胞系中TF结合位点的富集，这些细胞系重叠了管腔和基底样细胞系中特定未甲基化的CG位点。B，基底样患者肿瘤中ATAC-seq峰的热图显示，与管腔类肿瘤相比，ATAC-seq峰具有明显更多的开放染色质(DESeq2校正P<0.05)。在基本特异的ATAC-seq峰中显示了JUN、STAT3和GR基序的富集。
基底样乳腺癌中GR和STAT3的高表达与患者的不良预后有关
如果JUN、GR和STAT3调控基底样型乳腺癌的基因表达程序，那么人们可以预期这些TF在基底样型乳腺癌中的表达高于管腔性乳腺癌。对用于DNA甲基化分析的28个乳腺癌细胞株系进行RNA-seq分析。GR(基因名称：NR3C1)和STAT3在基底样细胞系中的表达明显高于腔细胞系，而JUN则不表达(图2A)。19个基底样乳腺癌细胞系和21个管腔乳腺癌细胞系的基因表达数据证实，GR和STAT3在基底样乳癌中都有较高的表达(图2B)。GR和STAT3在之前被分类为TNBC亚型的基底样瘤中同样高表达(补充图S1a)，以及具有和不具有BRCA1和BRCA2突变的肿瘤中也同样高表达(补充图S1B)。这些结果证实GR和STAT3在基底样乳腺癌中的表达量高于管腔型乳腺癌。
GR和STAT在一些管腔性乳腺癌确实有低水平的表达，因此我们研究了GR和STAT3表达与预后的关系。对包含乳腺肿瘤基因表达和长期生存数据的分析表明，基底样乳腺癌中GR和STAT3的高表达与较短的无复发生存期相关(图2C)。相反，GR和STAT3高表达的管腔乳腺癌患者更有可能拥有更长的无复发生存期(图2D)。这些结果证实了GR和STAT3在基底样乳腺癌中的独特作用，并表明这些TF可能与疾病的侵袭性特征有关。
GR和STAT3可以结合到基因组中相同的基底样特异性调节区
为了直接验证GR和STAT3与基因组结合的假设，并调控基底样蛋白的基因表达过程，对8个乳腺癌细胞系(4个基底样蛋白，4个管腔蛋白)进行了GR和STAT3的ChIP-seq。GR是一种类固醇激素核受体，它存在于细胞质中，直到它与糖皮质激素配体结合，使其能够同源二聚化并移动到细胞核中，来调节基因的表达。为了评估GR的结合情况，在进行ChIP-seq前，需要使用100nmol/L dexamethasone处理细胞1h。STAT3是一种转运蛋白，其二聚化和转位受Janus激酶(JAK)的磷酸化调控。正常情况下，当细胞激素受体与干扰素、表皮生长因子、白介素5和6等配体结合时，JAK会磷酸化STAT3。STAT3在大多数基底样细胞系和患者肿瘤中具有结构性磷酸化和活性。因此，需要在标准培养基中对细胞进行STAT3的ChIP-seq。
来自ChIP-seq的全基因组GR和STAT3结合位点被用来根据Spearman相关性对细胞系进行等级聚类。这一分析表明，基底样和管腔亚型具有不同的全基因组GR和STAT3结合图谱(图3A)。基底样细胞系在基底样组内形成两个不同的亚群，对应之前的分类为Basal A或Basal-like 1和Basal-like 2(HCC70和HCC1937)和Basal B或间充质干细胞样(SUM159和MDA-MB-231)亚型。尽管有这些差异，但当考虑全基因组GR和STAT3结合时，这四个基底样细胞系之间仍然比它们与腔细胞系更相似。DESeq2用于鉴定基因组中GR亚型特异性结合的区域。基底细胞样乳腺癌基因组中有2,002个区域与GR特异性结合(DESeq2校正P<0.05；图3B)。在基底样乳腺癌中，对STAT3和3,667个与STAT3特异结合的基因组区域进行了同样的分析(DESeq2校正P<0.05；图3C)。结果表明，GR和STAT3在基底样乳腺癌基因组中都结合了数千个它们在管腔乳腺癌中不结合的区域，这支持了这两个TF调控基底样乳腺癌基因表达的假说。
相关热图显示，在四个基底样细胞系中，全基因组的GR结合位点和STAT3结合位点都高度相关。为了进一步研究这一点，DESeq2被用来进行多变量分析，该分析结合了GR和STAT3的ChIP-seq数据，确定了这些TF单独结合或以基底样特异性方式结合在一起的位点。分析表明，单独与GR结合的位点有1773个，单独与STAT3结合的位点有188个，在基底样细胞系中有12712个GR和STAT3特异结合的ChIP-seq峰(图3D)。这一结果表明，GR和STAT3比单独结合更多地结合了相同的基底特异性调节区。
大多数共同的GR和STAT3基底样特异性结合位点距离最近的基因转录起始点有50-500kb，表明它们可能与增强子等末端调控元件结合(图4A)。对共同的GR和STAT3基底样特异结合位点进行基序分析。在5044个峰中发现了典型的STAT3基序，与对照序列相比，其E值为4.97×10﹣425。在1,309个峰中发现典型的GR基序，与对照序列相比，其E值为8.00×10﹣37。这一结果表明，GR和STAT3共同结合位点对两个TF识别的基序都有显著的富集作用。
为了验证共同的GR和STAT3基底样特异性结合位点靠近基底样癌中特异性表达的基因的假设，我们分析了57例原发乳腺肿瘤(15例基底样癌和42例管腔性癌)的RNA-seq数据。基底样肿瘤中有7121个基因显著高表达，管腔型肿瘤中有3464个基因有显著高表达(DESEQ校正P值0.05)。计算每个基因的转录起始点与最近的GR和STAT3结合位点之间的距离。与管腔性肿瘤或无差异表达的基因相比，基底样乳腺肿瘤中显著高表达的基因更接近GR和STAT3共同的碱基特异性结合位点(图4B)。
为了进一步研究在细胞系中发现的GR和STAT3共同的特异性结合位点在患者肿瘤中是否是开放和可获得的，我们分析了59个原发性乳腺肿瘤(15个基底样瘤和44个管腔性瘤)的ATAC-seq数据。基底样瘤中GR和STAT3共同的碱基特异性结合位点比管腔性肿瘤更具有开放性(Mann-Whitney P＝7.375×10﹣231；图4C和D)。
综上所述，这些结果表明GR和STAT3在数千个调控区域能够结合在一起，这些区域在基底样瘤中特异性开放，在管腔肿瘤中关闭，这些结合位点靠近基底样肿瘤中显著高表达的基因。这些数据进一步支持了GR和STAT3调控基底样基因表达的假设。
图2.GR和STAT3在基底样型乳腺癌中的表达较高，且与较短的无复发生存期有关。A，RNA-seq数据显示，GR和STAT3在基底样型(N＝18)细胞系中的表达高于管腔上皮样细胞系(N＝10)，而JUN则不是。显示Mann-Whitney P值。B，一个独立的基因表达数据显示，GR和STAT3在基底样细胞(N＝19)中的表达高于管腔内(N＝21)细胞系。在基底样乳腺癌患者中，GR和STAT3的高表达与较短的无复发生存期相关。相反，当GR和STAT3高表达时，管腔性乳腺癌患者预后较好。
图3.GR和STAT3在基底样细胞系(N＝4)和管腔细胞系(N＝4)中的ChIP-seq。A、跨基底样细胞系和管腔细胞系的全基因组结合的成对相关性显示GR和STAT3表现出全局亚型特异性结合。B、GR在2,002个峰显示亚型特异性结合(DESeq2校正P<0.05)。C、STAT3有3667个亚型特异性结合峰(DESeq2校正P<0.05)。d、基底样细胞系中有12712个GR和STAT3特异性结合位点。
GR和STAT3协同调控基因表达
为了确定哪些基因受GR和STAT3的调控，分别用100nmol/L dexamethasone或等量的100%乙醇载体对照处理HCC70和MDA-MB-231细胞4h，用STAT3 siRNA SMARTpool或非靶向siRNA处理96h，以确定哪些基因受GR和STAT3的调控。dexamethasone诱导GR后，两种细胞中546个基因的表达均发生显著变化(DESeq2校正P<0.05；图5A)。STAT3 siRNA敲除导致两种细胞中1,967个基因的表达发生显著变化(DESeq2校正P<0.05；图5B)。
为了验证改变表达的基因靠近GR和STAT3共同的特异性结合位点的假设，计算了每个基因的转录起始位点与最近的GR和STAT3共同结合位点之间的距离。以前的研究已经报道，这些转录因子更有可能直接激活基因表达，而且相关的抑制更有可能是下游的间接影响。因此，我们分别对每个TF激活和抑制的基因进行了分析。这一分析表明，与被抑制的基因或当这些TF被调节时不改变表达的基因相比，被GR或STAT3激活的基因中有更大一部分接近共同结合的位点(图5C和D)。值得注意的是，80%被dexamethasone诱导的GR激活的基因和60%被STAT3激活的基因都在GR和STAT3共同结合位点的100000 bp以内。
为了进一步阐明GR和STAT3是如何协同调控基因表达的，单独和同时使用dexamethasone(1μmol/L处理24小时)与STAT3抑制剂SH4-54(8μmol/L处理24小时)处理MDA-MB-231细胞。一个具有GR：STAT3相互作用项的多变量线性模型被用来识别当两个TF在细胞核中完全活跃时的差异表达基因。当GR和STAT3在细胞核中都活跃时，有970个基因的表达显著增加(BH校正后的P值<0.05；图6A)。值得注意的是，这些基因中的大多数(769个基因)符合协同激活模型，其中GR和STAT3在细胞核中的存在导致了比GR和STAT3单独表达的总和更高的表达量。此外，201个基因符合加性模型，其中GR和STAT3各自对表达起加性作用。当GR和STAT3在细胞核中都活跃时，也有628个基因的表达显著降低(BH校正后的P值<0.05；图6A)。同样，大多数(515个基因)符合协同模型，在细胞核中GR和STAT3的存在导致了比GR和STAT3单独抑制的总和更强的抑制作用。
为了确定GR和STAT3共同调控的基因是否靠近GR和STAT3共同的特异性结合位点，计算了每个基因的转录起始点与最近的GR和STAT3共同结合位点之间的距离。与之前的观察结果一致，与被抑制的基因或当这些TF被调节时没有改变表达的基因相比，被GR和STAT3协同激活的基因中有更大一部分接近共同结合位点(图6B)。
这些结果表明GR和STAT3协同调节数百个基因的表达。
图4.A、碱基特异的GR和STAT3共同结合位点通常是在基因转录起始点(TS)的50-500kb。B、与管腔性乳腺癌和亚型间无差异表达的基因相比，基底细胞特异性GR和STAT3共同的结合位点更接近基底样乳腺癌中特异表达的基因。C、在基底样瘤患者(N＝15)的ATAC-seq数据中，GR和STAT3特异性的共同结合位点的染色质比管腔性肿瘤(N＝44)的染色质更具有可及性。描述了患者平均归一化数据的平均值(暗点)和SD(亮带)。D、Violin曲线图显示，基底样瘤中染色质的位置(N＝15)比管腔型肿瘤(N＝44)更容易接近。该图描述了Mann-Whitney P值、中位数(水平线)、四分位数范围(黑框)和范围(垂直线)。
图5.A、dexamethasone诱导GR活性的处理导致两个基底样乳腺癌细胞系(HCC70和MDA-MB-231；DESeq2校正P<0.05)中546个基因的表达发生显著变化。B、siRNA下调STAT3基因可导致两株基底样乳腺癌细胞中1,967个基因表达发生改变(DESeq2校正P<0.05)。C和D、当GR或STAT3被调控时，改变表达的基因比不改变表达的基因更接近GR和STAT3特异性结合位点。
GR和STAT3调节基底样基因表达程序
为了验证GR和STAT3是基底样基因表达程序的关键调控因子的假设，我们分析了28个乳腺癌细胞系(18个基底样细胞和10个管腔细胞株)的RNA-seq数据，以确定具有亚型特异性表达的基因。在基底样乳腺癌中显著高表达的2485个基因中，有438个基因在HCC70和MDA-MB-231中显著上调，在上述实验中，dexamethasone诱导培养基与基础培养基、标准培养基与STAT3 siRNA或SH4-54对STAT3的抑制作用进行了比较。补充表S3列出了这438个由GR和STAT3上调的基底样基因。这些基因与先前认为基底样乳腺癌比腔性乳腺癌高表达的基因有显著重叠(Hypergeometric FDR校正Q值＝2.6×10﹣95)。这一结果证实了本研究中发现的GR和STAT3调控的基因与基底样癌相关。
对GR和STAT3上调的438个基底样癌基因的进一步鉴定揭示了与基底样乳腺癌侵袭性相关的细胞过程和途径的富集。这些基因在一些生物学过程中均有作用，如“细胞增殖的正调控”(Hypergeometric FDR校正Q值＝2.04×10﹣17)、“定义上皮间充质转变的标志”(Hypergeometric FDR校正Q值＝7.22×10﹣15)、“乳腺干细胞”(Hypergeometric FDR校正Q值＝1.04×10﹣22)以及“成体组织干细胞”(Hypergeometric FDR校正Q值＝2.13×10﹣20)。值得注意的是，在GR和STAT3上调的438个基底样癌基因中，有34个是TF，包括那些已知的在基底样乳腺癌生长中涉及的主要信号通路上的基因，这些信号通路包括EGFR信号(ELK3、ETS2、CEBPD、NFIL3、MBNL2、HIVEP2)和TGFb信号(ELK3、ETS2、SNAI1、MAFB)。这些结果表明，GR和STAT3是控制基底样型乳腺癌生长和主要特征的关键转录因子的上游。
这438个基因在HCC70和MDA-MB-231细胞中均受GR和STAT3的影响而上调。为了确定它们是否与基底样乳腺癌患者的预后相关，通过来自360个基底样乳腺癌患者的5年无复发生存数据的公共基因表达数据生成Kaplan-Meier生存曲线图。这些基因在肿瘤中平均表达较高的患者无复发生存期明显短于这些基因表达较低的患者(HR=1.76，logrank P=0.0068；图6C)。这一结果表明，在基底样乳腺癌患者中，由GR和STAT3上调的基因高表达与预后较差相关。
图6.GR和STAT3协同调节1,598个基因的表达。用dexamethasone诱导MDA-MB-231细胞GR和SH4-54抑制STAT3。A、GR和STAT3共同调控的基因热图符合相加或协同的激活或抑制模型(BH校正P<0.05)。+表示在实验中TF在细胞核中是活跃的。B、受GR和STAT3共同调控的基因比不受GR和STAT3调控的基因更接近GR和STAT3共同的结合位点。在基底细胞样乳腺癌患者中，由GR和STAT3上调的基因的平均表达量较高与较短的无复发生存期相关。
同时抑制GR和STAT3可协同抑制细胞生长
通过得到的数据我们观察到了GR和STAT3协同调节了大量与细胞增殖和不良预后相关的基因表达信号中的基因，这促使了我们开始研究调节GR和STAT3的药物是否会影响细胞生长。为了初评GR和STAT3在细胞生长中的独立作用，分别用不同剂量的dexamethasone和STAT3抑制剂SH4-54处理MDA-MB-231细胞，并在Incucyte Zoom活细胞成像仪上监测72小时。随着STAT3抑制剂SH4-54剂量的增加，STAT3活性降低会导致细胞生长减少，并对剂量呈现出依赖性(图7A)。通过减少dexamethasone的量来降低GR活性会导致细胞生长以剂量依赖的形式减少(图7B)。这些结果与以前报道的分别抑制GR和STAT3会分别抑制基底样乳腺癌增殖的报道是一致的。
为了评估同时调节这两种TF是否会导致生长差异，我们用dexamethasone和SH4-54的不同组合处理了MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞。同时用dexamethasone抑制GR和8μmol/L的SH4-54抑制STAT3，细胞生长最慢(图7C和D)。相反，用1μmol/L dexamethasone激活GR再结合STAT3的内源活性，细胞生长最快(图7C和D)。值得注意的是，当GR或STAT3单独活跃时，会导致中等的增长率。这一结果支持了GR和STAT3协同促进细胞生长的假设，同时抑制GR和STAT3会导致比单独抑制使细胞更慢的生长。
为了将这一分析扩展到细胞系之外，在GR和STAT3抑制的背景下分析了患者源发性类器官样本的生长情况。本实验使用了两种患者来源的器官培养物(HCI-001和HCI-002)，这些培养物来自于原发性基底样TNBC肿瘤(HCI-001和HCI-002)。患者源发性类器官样本培养的标准培养基包括1μg/mL hydrocortisone，hydrocortisone是一种诱导GR活性的糖皮质激素。递增剂量的mifepristone可以用来抑制GR活性。mifepristone也抑制PR和轻微抑制AR活性，但由于这些基底样TNBC样本不表达PR或AR，因此在该实验中这并不是一个干扰因素(补充图S2)。STAT3抑制剂SH4-54以递增的剂量使用来抑制STAT3的活性。以细胞株系MDA-MB-231作为阳性对照，与实验样本生长在相同的培养基中。实验样本的生长速度比细胞系慢得多，这导致了观察生长变化的动态范围较窄。尽管有这一技术有一定的限制，但仍能发现抑制GR和STAT3 72小时时会导致细胞生长显著下降，以ATP水平衡量，呈现出剂量的依赖性(图7e)。对不同药物剂量下的细胞生长相对减少这一现象分析表明，抑制GR和STAT3在MDA-MB-231细胞系以及患者源发性类器官样本培养物中表现协同作用(图7e)。这一结果证实，抑制GR和STAT3的活性会减少基底样型乳腺癌患者源发性类器官样本中的细胞生长。在GR和STAT3抑制剂之间观察到的协同作用表明，可能有一个治疗剂量减少的窗口期，即低剂量的各种药物可以联合使用，以实现与单独使用高剂量的每种药物相同的细胞生长抑制作用(图7e)。因此还需要进一步的实验和分析来确定GR和STAT3抑制剂的协同效力和协同效果。
图7抑制GR和STAT3导致基底样细胞系和患者源发性类器官样本细胞的生长减少。随着STAT3抑制剂SH4-54剂量的增加，MDA-MB-231细胞的生长速度呈剂量依赖性下降。降低dexamethasone剂量对MDA-MB-231细胞生长有抑制作用，且呈剂量依赖性。与单独抑制相比，同时抑制GR和STAT3对MDA-MB-231©和MDA-MB-468(D)细胞的生长均有抑制作用。患者源发性类器官样本细胞培养物(HCI-001和HCI-002)和MDA-MB-231细胞系同时用增加剂量的STAT3抑制剂SH4-54和GR抑制剂mifepristone处理72h后，细胞生长(蓝色)协同下降。
讨论
本研究的目的是确定哪些TF驱动碱基样基因表达程序。对DNA甲基化、染色质可及性、TF结合和基因表达的全基因组分析表明，GR和STAT3会丰富地结合在基底样乳腺癌中特异开放的基因组调节区。这些转录因子与相同的调控区域结合，协同调节数百个基底样表达信号中的基因，包括许多其他转录因子。GR和STAT3协同上调的基因是基底样型乳腺癌生长的主要信号转导通路(EGFR和TGFb)，与基底样型乳腺癌的侵袭特征(增殖、干性和上皮向间质转化)相关，并与患者较短的无复发生存期有关。此外，同时抑制GR和STAT3会导致多种细胞系和患者源发性类器官样本细胞培养中细胞生长的协同减少。总之，这些数据表明，同时抑制GR和STAT3可以减少基底样基因表达信号的表达，并创造出一种可用于治疗的合成致死性。
尽管GR和STAT3分别参与了基底样乳腺癌基因表达的调控，但它们的协同作用尚未被报道。本研究清晰地阐明了，了解这种相互作用对于研究它们在驱动基底样基因表达和表型方面的作用以及研究出更有效的治疗方案至关重要。单独抑制GR是无效的，基底样细胞系在培养基中没有糖皮质激素的情况下增殖并表达基底样基因信号的某些成分。单独抑制STAT3并不是完全有效的；先前的研究表明，SH4-54在培养中会使基底样细胞系致死，但不足以在体内完全阻止肿瘤的生长，因为体内会自然存在糖皮质激素。这些结果表明，单独抑制这两种转录因子中的任何一种都不足以在体内减少基底样癌细胞的增殖基因表达，但本研究表明同时抑制GR和STAT3可能是一种新的有效的治疗策略。
有大量之前的文献可以支持我们的结论，即STAT3是乳腺癌细胞生长、侵袭和存活的关键因素，包括我们之前的研究表明，STAT3结合调节促进侵袭的基因。由于JAK/STAT3途径抑制剂的致癌作用已知，目前已有多项临床试验测试了JAK/STAT3途径抑制剂在乳腺和其他实体肿瘤中的作用，如图3所示。这些试验，以及其他直接针对STAT3的药物的不断开发，为未来的研究提供了很大机会，以确定与GR抑制剂联合治疗是否可以提高疗效，或者联合治疗是否可以以更低、更好的耐受性剂量提供类似的治疗效果。
研究GR在基底细胞样乳腺癌中的作用具有重要的临床意义。GR在癌症中的作用是疾病和亚型特异性的。GR的表达与管腔性乳腺癌的良好预后相关(图2D)，糖皮质激素通常用于治疗血液系统恶性肿瘤，因为它们诱导淋巴细胞凋亡。此外，强力合成糖皮质激素经常被用于接受过化疗的乳腺癌患者，以防止恶心、食欲不振和罕见的严重免疫反应等副作用。我们的初步数据支持其他几项研究结果，即糖皮质激素诱导GR可以促进TNBC的肿瘤生长和治疗耐药性。具体地说，在我们的研究中，糖皮质激素诱导GR导致基底样乳腺癌细胞系和患者源发性类器官样本的细胞生长增加是显而易见的。它还导致受STAT3协同调控的基因表达增加，STAT3是已知的癌症生长和侵袭的促进剂。最近，临床试验已经开始测试直接用mifepristone抑制GR还是通过抑制其伴侣HSP90来提高ER阴性乳腺癌的化疗疗效。虽然糖皮质激素的使用被认为是提高化疗耐受性的必要手段，但mifepristone联合nabpaclitaxel抑制糖皮质激素受体的首次试验表明，使用filgrastim生长因子可以控制主要的毒性，即嗜中性白血球减少症。这项研究发现，标准剂量的nabpaclitaxel与有效剂量的mifepristone联合使用是安全和耐受的，该方案的II期试验已经启动。补充图中提供了GR和Hsp90抑制剂的目前试验列表S4。我们的研究结果支持这一研究方向，并显示同时抑制GR和STAT3的联合治疗在治疗基底细胞样TNBC方面可能更有效。
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