本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种用于鉴别流产嗜性衣原体的实时荧光定量pcr检测试剂盒与检测方法。
背景技术：
羊流产嗜性衣原体(chlamydiaabortus，c.abortus)为专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，是一种重要的人畜共患传染病病原，属于衣原体科嗜性衣原体属，能引起猪、牛、羊等多种动物流产、死胎、产弱仔等(siarkouv,lambropoulosaf,chrisafis.subspeciesvariationingreekstrainsofchlamydophilaabortus.vetmicrobiol.2002.85:145-157)。该病广泛分布于世界各地，对畜牧业造成巨大的经济损失，孕妇也可感染而发生流产，其诊断和防控制剂的研究将具有十分重要的公共卫生及经济意义。此外，流产衣原体为世界动物卫生组织(officeinternationaldesépizooties，oie)规定的二类动物疾病，在国际进出口贸易中属于必检的病原。
在衣原体诊断方面，病原分离培养一直是嗜性衣原体检测的金标准，但由于衣原体培养较为困难，分离时间较长且工作量大，在临床检测应用中具有很大的限制。据世界动物卫生组织(oie)陆生动物疫病诊断手册()，动物衣原体血清学最常用的检测方法为补体结合试验(cft)。然而，此技术不但需要大量的劳动力，灵敏度差，而且容易受到衣原体种之间的交叉反应干扰。目前，临床上常用的动物衣原体检测方法主要是基于两个主要交叉反应的抗原，即脂多糖(lps)和主要外膜蛋(momp)，如英国oxoid公司建立的衣原体直接免疫荧光检测试剂盒，以色列研发的以lps作为包被抗原的间接荧光试剂盒savyondiagnostics等(bradeh,bradel,nanof.chemicalandserologicalinvestigationsonthegenus-specificlipopolysaccharideepitopeofchlamydia.procnatlacadsci.1987.84(8):2508-12)。然而，这两个检测标点在所有的衣原体种都存在，诊断动物衣原体时没有种的特异性。流产嗜性衣原体和家畜衣原体感染在临床上较为常见，家畜衣原体感染主要表现为间歇性脑脊髓炎、肺炎、肠炎、多发性关节炎和子宫内膜炎等症状，由于结构和致病机制的相似性，两种衣原体均能感染牛、羊、猪等动物，宿主范围相同，临床上难以区分。基于此，研制更加特异、准确、敏感的新型衣原体检测方法将成为防制该病的重要方向。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种用于鉴别流产嗜性衣原体的实时荧光定量pcr检测试剂盒与检测方法，试剂盒特异性良好，仅能检测流产嗜性衣原体，而不能检测家畜衣原体和其他非流产嗜性衣原体病原，解决了临床上流产嗜性衣原体和家畜衣原体难区分的问题。灵敏度高，最低检测极限达到1拷贝/ul。
本发明是这样实现的：
本发明的目的之一在于提供一种用于鉴别流产嗜性衣原体的实时荧光定量pcr检测引物对和探针，所述引物对包括：上游引物的序列如seqidno.1所示；下游引物的序列如seqidno.2所示；
所述探针的序列如seqidno.3所示，所述探针5’端标记荧光基团，3’端标记荧光淬灭基团。
优选地，所述探针的5’端标记的荧光基团为有机荧光染料或量子点无机染料中的任一种，所述探针3’端标记猝灭基团为有机染料的任一种或者金纳米粒子。
更为优选地，所述荧光基团包括为fam、vic、hex、trt、cy3、cy5、rox、joe和texasred中的一种，所述猝灭基团包括tamra、dabcyl、mgb、bhq-1、bhq-2和bhq-3中的一种。
本发明的目的之二在于提供一种用于鉴别流产嗜性衣原体的实时荧光pcr检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的实时荧光pcr检测引物对和探针。
优选地，所述试剂盒还包括：阳性对照品：流产嗜衣原体阳性标准质粒的dna；阴性对照品。
本发明的目的之三在于提供所述的实时荧光pcr引物对和探针、以及所述的试剂盒在用于鉴别流产嗜性衣原体上的用途。
本发明的目的之四在于提供一种用于鉴别流产嗜性衣原体的实时荧光pcr检测方法，利用所述的用于鉴别流产嗜性衣原体的实时荧光pcr检测引物对和探针进行实时荧光pcr扩增。
具体地，包括如下步骤：
步骤1、从样品中提取dna为模板；
步骤2、配制扩增反应体系进行实时荧光pcr扩增得到扩增曲线，所述扩增反应体系包括所述模板、以及权利要求1所述的流产嗜性衣原体的实时荧光pcr检测引物对和探针；
步骤3、对所述扩增曲线进行分析，并作出判断。
优选地，所述步骤2中扩增反应体系具体包括：权利要求1所述的流产嗜性衣原体的实时荧光pcr检测引物对和探针、2×premixextaq缓冲液；扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性15s，58℃退火30s，共40个循环。
优选地，所述步骤3中具体判断规则为：
当ct≤35时，判断样品为流产嗜性衣原体阳性；
当35<ct≤40时，重复一次实验，如果ct还是在此范围之内或小于35就判断样品为流产嗜性衣原体阳性，否则判断样品为流产嗜性衣原体阴性；
当ct>40时，判断样品为流产嗜性衣原体阴性。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
1、本发明提供的用于鉴别流产嗜性衣原体的实时荧光pcr检测引物对、探针、试剂盒及检测方法，在对核酸序列分析的基础上，利用生物信息学方法筛选流产嗜性衣原体区别于其他衣原体所特有的核酸序列区域，并针对流产嗜性衣原体特有基因区域l3-b的保守区域设计了一套特异性pcr引物和taqman探针，建立了流产嗜性衣原体和家畜衣原体taqman实时荧光定量pcr鉴别检测试剂盒，试剂盒特异性良好，仅能检测流产嗜性衣原体，而不能检测家畜衣原体和其他非衣原体病原，解决了临床上流产嗜性衣原体和家畜衣原体难区分的问题。
2、本发明提供的用于鉴别流产嗜性衣原体的实时荧光pcr检测试剂盒，灵敏度高，最低检测极限达到1拷贝/ul；快速、高效扩增，检测时间仅50min左右；结果判定简便，通过扩增曲线有无即可进行结果的判定。
附图说明
图1为act可视化展示流产嗜衣原体特异的核酸序列区域；
图2为本发明中荧光定量检测阳性标准质粒pmd19t-l3-b的扩增曲线；图中的曲线从左到右分别表示倍比稀释后的标准品浓度，依次分别为1×107拷贝/ul、1×106拷贝/ul、1×105拷贝/ul、1×104拷贝/ul、1×103拷贝/ul、1×102拷贝/ul、1×101拷贝/ul；
图3为本发明中荧光定量检测阳性标准质粒pmd19t-l3-b的标准曲线；图中横坐标对应标准品起始浓度的对数值，即从左到右依次分别对应标准品浓度1×101拷贝/ul～1×107拷贝/ul；纵坐标为其对应的ct值；
图4为本发明中荧光定量检测方法的特异性试验结果；
图5为本发明中荧光定量检测方法的熔解曲线；
图6为本发明中荧光定量检测方法的灵敏度试验结果。
具体实施方式
实施例1用于鉴别流产嗜性衣原体的实时荧光定量pcr检测引物对和探针的设计及筛选
1、利用blastn本地比对软件，将genbank公布的流产嗜性衣原体(chlamydiaabortus)与家畜衣原体(chlamydiapecorum)、猪衣原体(chlamydiasuis)、肺炎衣原体(chlamydiapneumonia)、沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)、豚鼠衣原体(chlamydiacaviae)、猫衣原体(chlamydiafelis)、鼠型沙眼衣原体(chlamydia_muridarum)等动物衣原体的全基因组核酸序列进行两两比对(显著性为1e-30)。以流产嗜性衣原体菌株s26/3的基因组为靶标，将家畜衣原体、猪衣原体、肺炎衣原体、沙眼衣原体、豚鼠衣原体、猫衣原体、鼠型沙眼衣原体与流产嗜性衣原体菌株同源的序列区域逐个记录，并标记在s26/3的基因组上，s26/3基因组上未标记的区域即为流产嗜性衣原体所特有的区别于其他衣原体的核酸序列，可作为流产嗜性衣原体特异性的诊断靶标。利用act可视化软件，将比对结果进行展示，红色区域代表与其他7种衣原体同源区域，白色区域为流产嗜性衣原体特异的核酸序列(图1)。如图1所示，流产嗜性衣原体s26/3基因组上有5处较大的特异区域，分别标记为：
locus1(l1-a：275726bp-283250bp、l1-b：289077bp-301151bp、l1-c：305141bp-313250bp、l1-d：315166bp-324153bp)
locus2(l2-a：619840bp-628957bp、l2-b：629847bp-635041bp、l2-c：636138bp-638804bp)
locus3(l3-a：670292bp-676300bp、l3-b：682704bp-688728bp、l3-c：696891bp-703724bp)
locus4(l4-a：780939bp-788513bp、l4-b：790880bp-795704bp)
locus5(881221bp-899563bp)
2、利用mega5和dnaman对genbank中不同流产嗜性衣原体菌株(c.abortusstraingn6,1h,caab7,s26/3,s21,tw92-249,1b_cevac,etc.)在locus1-5区域中的保守序列，针对保守序列，采用primerexpress3.0设计软件，设计了5套荧光定量引物和探针，由北京擎科新业生物技术有限公司合成。利用罗氏lightcycler96实时荧光定量pcr仪对定量pcr进程中的实时情况进行监控，对不同引物和探针试验组扩增的熔解曲线、起跳时间、扩增效率、达到平台期所需时间等进行分析，筛选出扩增效率最高、特异性最好的一组荧光定量pcr引物和探针(上游引物l3-b-f、下游引物l3-b-r、探针l3-b-p)，序列如下：
表1
实施例2用于鉴别流产嗜性衣原体的实时荧光pcr试剂盒及检测方法
1、试剂盒的组成
本试剂盒包括流产嗜性衣原体的一对特异性引物(f和r)、一条特异性荧光探针(fp)、阳性对照、阴性对照、5×pcrbuffer和enzymemix；
(1)流产嗜性衣原体的一对特异性引物(上游引物和下游引物如表1所示)
(2)流产嗜性衣原体的一条特异性荧光探针(如表1所示)
本实施例中荧光探针5’端标记荧光报告基团fam，3’端标记荧光淬灭基团bq1；在其他实施例中也可以选择其他荧光报告基团，其他荧光淬灭基团。具体地，所述荧光报告基团也可替换为vic、hex、trt、cy3、cy5、rox、joe和texasred，所述荧光淬灭基团也可替换为tamra、dabcyl、mgb、bhq-2和bhq-3。
(3)阳性对照品
采用1×103拷贝/ul的阳性质粒标准品作为阳性对照品。所示阳性质粒标准品的构建：选取l3-b中2048bp～2347bp的核酸序列(见序列表seqidno：4所示)，由北京擎科新业生物技术有限公司合成，并克隆到pmd-19t载体中，获得阳性质粒标准品(pmd19t-l3-b)，经测序鉴定证实阳性质粒标准品构建正确。为获得大量阳性质粒标准品，将阳性质粒标准品转化dh5α菌，经抗性选择和pcr鉴定，挑选正确菌落进行扩繁，利用天根质粒小提试剂盒提取质粒dna，经测序验证核实序列正确和纯度评估合格后(无碱基错配，分光光度计测定od260/od280在1.8～2.0之间)，实验室保存待用。特有基因l3-b处的部分基因(300bp)的核苷酸序列如序列表seqidno：4所示。
(4)阴性对照品的制备
用试剂盒提取无流产嗜衣原体感染(临床和实验室检测均阴性)的胚胎滋养层细胞的dna，作为阴性对照品。
(5)2×premixextaq缓冲液
2、流产嗜性衣原体的实时荧光pcr检测方法
(1)病毒核酸的提取：按常规方法提取。
(2)实时荧光定量pcr扩增(每份20ul体系)
表2
2、实时荧光定量pcr反应程序为：
95℃预变性5min，95℃变性15s，58℃退火30s，共40个循环；每个循环退火结束时，通过终点模式收集荧光信号并进行检测。仪器自动获得扩增产物的熔解曲线。本发明使用lightcycle480ii荧光定量pcr仪进行检测。
3、得到实时荧光定量pcr扩增结果，对扩增曲线进行分析，并根据如下的判断原则作出判断。
当ct≤35时，判断样品为流产嗜性衣原体阳性；
当35<ct≤40时，重复一次实验，如果ct还是在此范围之内或小于35就判断样品为流产嗜性衣原体阳性，否则判断样品为流产嗜性衣原体阴性；
当ct>40时，判断样品为流产嗜性衣原体阴性。
4、流产嗜衣原体荧光定量pcr扩增标准曲线的构建
将阳性质粒标准品进行10倍倍比稀释，稀释7个梯度，从1×101拷贝/ul～1×107拷贝/ul，使用所建立的实时荧光定量pcr方法分别进行扩增(图2)，以ct值为横坐标，拷贝数的对数值为纵坐标作散点图，建立了实时荧光定量pcr的标准曲线(图3)。方程式为y＝-4.063x+41.38，r＝0.999。结果显示所建立检测体系的荧光曲线与靶基因浓度之间相关性好，准确性高。
实施例3流产嗜衣原体荧光定量pcr扩增的特异性试验
流产嗜性衣原体实时荧光定量pcr检测方法的特异性试验所使用的dna有羊小反刍兽疫、山羊支原体山羊肺炎亚种、猪衣原体、家畜衣原体、猪肺炎支原体、牛支原体、猪鼻支原体、prv、prrsv、链球菌、大肠杆菌等。经过荧光定量pcr扩增后，结果仅流产嗜性衣原体的dna和阳性重组质粒标准品pmd19t-l3-b有扩增曲线，其余均没有扩增曲线(图4)，表明该检测方法特异性良好。
实施例4流产嗜衣原体荧光定量pcr扩增的灵敏性试验
将阳性质粒标准品进行10倍倍比稀释，选取低拷贝数样品1×100拷贝/ul～1×103拷贝/ul进行实时荧光定量pcr扩增，评估检测方法的灵敏性。
图6为本发明中荧光定量检测方法的灵敏度试验结果。由图6可知，流产嗜性衣原体实时荧光定量pcr检测方法的灵敏度为1拷贝/ul，证明方法具有较高的敏感性。
所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
序列表
<120>用于鉴别流产嗜性衣原体的实时荧光定量pcr检测试剂盒与检测方法
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
ggaagatacttcgaaagcagcaa23
<210>2
<211>26
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
aagctgtatcgttgttagcaaatctc26
<210>3
<211>27
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
ctcaccaacctttctctgcctatcggc27
<210>4
<211>300
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
tcgagcttggtgcaactgtgcctatccaaacagaatcttctctcctattcgatatgtact60
cacctttcctgaagtttcaacttgtgcatacgcaccaagatgactttaaggaaaacaata120
gcgatcagggaagatacttcgaaagcagcaatctcaccaacctttctctgcctatcggca180
tcaagtttgagagatttgctaacaacgatacagcttcttatcatgtcactgctgcttatt240
ctcctgatatcgtaagaagtaaccctgactgtactacttctctgttagtaagccccgact300
技术特征：
1.一种用于鉴别流产嗜性衣原体的实时荧光定量pcr检测引物对和探针，其特征在于，所述引物对包括：上游引物的序列如seqidno.1所示；下游引物的序列如seqidno.2所示；
所述探针的序列如seqidno.3所示，所述探针5’端标记荧光基团，3’端标记荧光淬灭基团。
2.如权利要求1所述的用于鉴别流产嗜性衣原体的实时荧光pcr检测引物对和探针，其特征在于，所述探针的5’端标记的荧光基团为有机荧光染料或量子点无机染料中的任一种，所述探针3’端标记猝灭基团为有机染料的任一种或者金纳米粒子。
3.如权利要求1所述的用于鉴别流产嗜性衣原体的实时荧光pcr检测引物对和探针，其特征在于，所述荧光基团包括为fam、vic、hex、trt、cy3、cy5、rox、joe和texasred中的一种，所述猝灭基团包括tamra、dabcyl、mgb、bhq-1、bhq-2和bhq-3中的一种。
4.一种用于鉴别流产嗜性衣原体的实时荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的实时荧光pcr检测引物对和探针。
5.如权利要求4所述的用于鉴别流产嗜性衣原体的实时荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：阳性对照品：流产嗜衣原体阳性标准质粒的dna；阴性对照品。
6.权利要求1所述的实时荧光pcr引物对和探针、以及权利要求2所述的试剂盒在用于鉴别流产嗜性衣原体上的用途。
7.一种用于鉴别流产嗜性衣原体的实时荧光pcr检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述的用于鉴别流产嗜性衣原体的实时荧光pcr检测引物对和探针进行实时荧光pcr扩增。
8.如权利要求7所述的流产嗜性衣原体的实时荧光pcr检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、从样品中提取dna为模板；
步骤2、配制扩增反应体系进行实时荧光pcr扩增得到扩增曲线，所述扩增反应体系包括所述模板、以及权利要求1所述的流产嗜性衣原体的实时荧光pcr检测引物对和探针；
步骤3、对所述扩增曲线进行分析，并作出判断。
9.如权利要求8所述的流产嗜性衣原体的实时荧光pcr检测方法，其特征在于，所述步骤2中扩增反应体系具体包括：权利要求1所述的流产嗜性衣原体的实时荧光pcr检测引物对和探针、2×premixextaq缓冲液；扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性15s，58℃退火30s，共40个循环。
10.如权利要求8所述的流产嗜性衣原体的实时荧光pcr检测方法，其特征在于，所述步骤3中具体判断规则为：
当ct≤35时，判断样品为流产嗜性衣原体阳性；
当35<ct≤40时，重复一次实验，如果ct还是在此范围之内或小于35就判断样品为流产嗜性衣原体阳性，否则判断样品为流产嗜性衣原体阴性；
当ct>40时，判断样品为流产嗜性衣原体阴性。
技术总结
本发明提供了一种用于鉴别流产嗜性衣原体的实时荧光定量PCR检测引物对和探针，所述引物对的序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.2所示；所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示，所述探针5’端标记荧光基团，3’端标记荧光淬灭基团。本发明还提供了用于鉴别流产嗜性衣原体的实时荧光定量PCR检测试剂盒与检测方法，该试剂盒包括所示引物对和探针。本发明针对特有基因区域L3‑b的保守序列设计了一套特异性PCR引物和TaqMan探针，建立了流产嗜性衣原体TaqMan实时荧光定量PCR鉴别检测试剂盒，特异性良好，灵敏度高，仅能检测流产嗜性衣原体，而不能检测家畜衣原体和其他非流产嗜性衣原体病原。
技术研发人员：刘威;郭锐;田永祥;周丹娜;袁芳艳;刘泽文;杨克礼;段正赢;高婷;梁婉;胡贤旺
受保护的技术使用者：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
技术研发日：.12.12
技术公布日：.02.14
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