本发明属于核酸检测技术领域，具体而言，涉及一种荧光假单胞菌荧光定量pcr快速检测方法及试剂盒和应用。
背景技术：
荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)是一种嗜冷微生物，在冷藏的生肉、生牛乳等高蛋白高脂肪的食品中是导致腐败的优势菌种。由于荧光假单胞菌能大量分泌耐热脂肪酶、蛋白酶，经过加热杀菌后，残留的耐热蛋白酶和脂肪酶仍有部分活性，可破坏食品的风味品质，缩短食品的货架期。随着人们生活水平的提高和饮食习惯的变化，荧光假单胞菌对人类健康的潜在威胁日益扩大。建立快速、准确的荧光假单胞菌检测方法对完善食品安全监测体系有重要的意义。
目前荧光假单胞菌的检测仍以传统培养法为“金标准”，包括样品前处理、选择性增菌、选择性平板分离、生理生化特征实验几个步骤，实验周期至少需要4天，不适用于大量快速检测。荧光定量pcr技术检测速度快，特异性和灵敏度高，且实现了定量检测。近年来，荧光定量pcr方法已被广泛应用各类病源菌的快速检测中。但截至目前，尚未有研究者针对荧光假单胞菌开发taqman探针法荧光定量pcr检测体系。
技术实现要素：
本发明的一个目的在于提供荧光假单胞菌荧光定量pcr快速检测方法。
本发明的另一个目的在于提供荧光假单胞菌荧光定量pcr快速检测试剂盒。
本发明的第三个目的在于提供上述检测方法和试剂盒在检测中的应用。
为实现上述第一个目的，本发明提供的荧光假单胞菌荧光定量pcr快速检测方法，包括以下步骤：
(1)应用选择性增菌液中对待检样品进行增菌，并采用苯酚-氯仿-异戊醇法或煮沸法提取细菌基因组dna；
(2)将步骤(1)获得的基因组dna与引物和相应的探针混合，进行荧光定量pcr检测，其中所述引物和探针如下：
以荧光假单胞菌pfsbw25的gyrb基因为模板，使用软件primerexpress3.0设计特异性检测引物和探针，其中检测引物gyrb-f序列为5’tgcggtcaaccaggtgttcc3’，gyrb-r序列为5’cgagataatcgcggtcagg3’，探针gyrb-taqmen序列为5’catccagcgtgaagacggcatcg3’。
在本发明中，待检样品是潜在可能含有荧光假单胞菌的离体样品。由于荧光假单胞菌是食品中的主要腐败菌，因此优选样品来自于食品，如样品是食品，或者样品是食品的细菌平板培养物等。
荧光定量pcr反应体系中探针的浓度对pcr反应效率影响较大，根据本发明的发明人的研究，taqman探针的终浓度为500nmol/l。
荧光定量pcr的反应过程是本领域技术人员所能掌握的，每个循环一般包括在92-96℃的变性、低温退火和72℃左右的延伸过程，其中最多变的是退火的温度。根据本发明人研究，最优选的实时rt-pcr的过程为36个循环，其中每个循环为变性94℃/45s，退火57℃/45s，延伸72℃/45s。
为实现上述第二个目的，本发明提供了荧光假单胞菌荧光定量pcr快速检测试剂盒。所述试剂盒包括pcr反应液，所述pcr反应液包括检测引物和探针，其中检测引物gyrb-f序列为5’tgcggtcaaccaggtgttcc3’，gyrb-r序列为5’cgagataatcgcggtcagg3’，探针gyrb-taqmen序列为5’catccagcgtgaagacggcatcg3’。
为实现上述第三个目的，本发明还提供了上述检测方法和试剂盒在检测样品中荧光假单胞菌的应用。
本发明的发明人经过长期研究，针对gyrb基因设计了一对引物和相应的探针，建立了荧光假单胞菌荧光定量pcr检测体系，其特异性强、灵敏度高、检测适应性广、抗干扰能力强，并可以应用于样品中尤其是食品中荧光假单胞菌的高通量筛检。
附图说明
图1为纯培养物水平检测扩增曲线图(as1.55)。其中，blank:ddh2o；a～g:每个体系中模板终浓度分别为3.0×105，3.0×104，3.0×103，3.0×102，3.0×101，3.0，3.0×10-1，3.0×10-2cfu/ml。
具体实施方式
为了便于理解，以下将通过附图和具体实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》(第三版)(coldspringharborlaboratorypress)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)等实验手册以及本发明所引用的参考文献中所列方法来实施。
1.1主要试剂和仪器
营养肉汤培养基(nb培养基)、营养肉汤琼脂培养基(na培养基)、选择性增菌液(缓冲蛋白胨水)均购自北京陆桥技术股份有限公司；premixextaqtm购自大连宝生物工程有限公司；实验所用荧光假单胞菌种特异性检测引物序列gyrbf/r、taqman探针由大连宝生物工程有限公司合成；appliedbiosystemsstep-onereal-timepcrsystem，美国abi公司；紫外核酸与蛋白质分析仪du800型，美国beckmancoulter有限公司；ms-2涡旋振荡器，德国ika公司；5415d高速离心机，德国eppendorf公司；hz-8211k恒温摇床，太仓市科教器材厂；dhp-9162恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；ca-1480-2垂直层流洁净工作台，上海上净净化设备有限公司；es-315高压蒸汽灭菌器，日本tomy公司。
1.2菌株以及基因组dna的抽提
菌株分别购于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心、中国医学微生物菌种保藏中心、中国工业微生物菌种库、中国检科院食品安全微生物菌种保藏管理中心，菌株编号如表1所示。培养方法可以按照上述菌株提供单位推荐的方法进行，参照厂商说明，采用苯酚-氯仿-异戊醇法或煮沸法提取细菌基因组dna。
表1菌种编号特异性检测结果
tab.1strainsusedinthetestofpcrspecificity
1.3检测引物和taqman探针的设计和合成
以荧光假单胞菌pfsbw25的gyrb基因为模板，使用软件primerexpress3.0设计检测引物和探针，检测引物gyrb-f序列为5’tgcggtcaaccaggtgttcc3’，gyrb-r序列为5’cgagataatcgcggtcagg3’，探针gyrb-taqmen序列为5’catccagcgtgaagacggcatcg3’。
1.4探针浓度优化实验
设置一系列的探针浓度梯度，使每个反应体系中的探针浓度分别为100nmol/l，200nmol/l，300nmol/l，400nmol/l，500nmol/l。分别在这5个梯度上进行pcr扩增(以荧光假单胞菌as1.55基因组dna为模板)，每个浓度三个平行值，根据ct值大小确定最佳的探针浓度。
探针浓度与ct值的关系如表2所示，可见探针浓度为500nmol/l时ct值最小，并且与400nmol/l组和600nmol/l组的数据经excel软件计算发现存在显著差异(p＜0.05)，故选择探针浓度为500nmol/l进行后续实验。
表2探针浓度与ct值关系表
tab.2thecorrelationofprobeconcentrationandctvalue
1.5实时荧光定量pcr反应
pcr反应体系(本发明实施例中pcr体系均参照此)：premixextaqtm10μl，dna模板1～10ng，上下游引物(10μmol/l)各0.5μl，探针(5μm)1μl，ddh2o补足至20μl。在abi7500荧光定量pcr仪上进行pcr扩增和荧光检测，扩增条件为：预变性94℃/2min；变性94℃/45s，退火57℃/45s，延伸72℃/45s，读取荧光值，36次循环。
1.6特异性评价
对表1中所列出的菌株分别进行荧光定量pcr扩增，以灭菌蒸馏水为空白对照。如扩增ct值小于35，则为阳性检测结果。结果显示，以荧光假单胞菌的基因组dna为模板时，扩增ct值均＜35，而以非荧光假单胞菌基因组dna为模板则无法检测出ct值。
1.7灵敏度评价
将培养12h的荧光假单胞菌as1.55进行平板计数，算得起始菌液浓度为3.0×109cfu/ml，接下来，按上述方法评价体系的纯培养物灵敏度。结果如图1所示，在稀释度为10-7时三个平行都能读出ct值，而在稀释度为10-8时三个平行都不能读出ct值，则该荧光定量pcr检测体系的纯培养物灵敏度为3.0×102cfu/ml。
1.8抗干扰能力评价
选取恶臭假单胞菌(as1.1130)、铜绿假单胞菌(iqcc12625)、产碱假单胞菌(iqcc12604)和洋葱假单胞菌(cicc21624)四株干扰菌，与荧光假单胞菌(as1.55)分别培养至稳定期，10倍梯度稀释后，分别进行平板计数。将四种干扰菌混合，设置三个干扰浓度(n×104，n×106，n×108)，与荧光假单胞菌不同梯度稀释液(10-4～10-10)分别混合，在28℃、150r/min条件下培养，于0h和15h(依据人工污染的结果选取)分别取样一次，煮沸法提取基因组dna，分别进行pcr扩增，以不加入荧光假单胞菌的干扰菌混合液为空白对照，检测抗干扰能力。
将荧光假单胞菌和四种干扰菌纯培养物分别培养至稳定期，进行平板计数，计算得到起始菌液浓度分别为1.2×109cfu/ml，2.6×108cfu/ml，6.4×108cfu/ml，1.3×109cfu/ml，1.2×109cfu/ml，再按上述方法进行抗干扰能力实验。结果如表3所示：添加约为104cfu/ml的干扰菌纯培养物时，对上述pcr检测体系的灵敏度几乎没有影响，而添加约为108cfu/ml的干扰菌纯培养物时，经过充分的增菌培养(15h)也能准确的检测出荧光假单胞菌。
表3干扰菌的存在对纯培养物pcr检测灵敏度的影响
tab.3influenceofbackgroundnon-pseudomonasfluorescensbacteriaonthedetectionsensitivityofpseudomonasfluorescensinpureculture
注：nd：notdetection，未检测。
1.9人工污染豆奶样品实验
将活化的荧光假单胞菌(as1.55)菌液接入nb培养基中摇床培养至稳定期，10倍梯度稀释，进行平板计数来计算原始菌落数。向225ml选择性增菌液中接入25ml豆奶，分别接入0.1～1cfu/ml、1～10cfu/ml、10～100cfu/ml三个梯度的菌液，独立重复三次，在28℃、150r/min条件下培养24h，于0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h和24h各取样一次，煮沸法提取基因组dna，分别进行pcr扩增，以灭菌蒸馏水为空白对照。所选食品样品经培养法证实不含有荧光假单胞菌。
结果如表4所示：当初始接菌量为23cfu/ml时，增菌培养12h可检测到阳性结果；当接菌量为2.3cfu/ml时，增菌培养15h可检测到阳性结果；培养24h后，初始接菌量为0.23cfu/ml的样品检出率为1/3。可见，本体系在样品含菌量低的情况下，经适当时间增菌可准确检测到荧光假单胞菌存在。
表4人工污染样品的pcr检测结果
tab.4detectiveresultsoftheartificialcontamination
注：*增菌24小时时后，初始接菌量为0.23cfu/ml的三组平行中仅有一组检出为阳性。
1.10食品样品检测
采集市面上荧光假单胞菌容易感染的食品样品(共56份，表5)，依据国标gb/t4789.7-处理样品。每份样品取25g(ml)，加入到225ml选择性增菌液中进行摇床培养(28℃，150rpm)，增菌时间依据人工污染结果确定。增菌后使用苯酚-氯仿-异戊醇法或煮沸法提取基因组dna，使用本研究建立的荧光定量pcr检测体系对样品进行检测。选择性增菌培养24h后采用传统培养法检测样品，每份样品平行2份，以防漏检。
培养法检测结果有3份肉类样品和3份水产品中分离出荧光假单胞菌，荧光定量pcr体系则分别在乳类、肉类和水产品中共检测到13份阳性结果。实际样品中荧光定量pcr体系检出率为23.2％，高于培养法的检出率10.7％。
表5食品样品检测结果
tab.5detectiveresultsofallthenaturalfoodsamples
本领域的技术人员在上述实施例的基础上结合公知常识即可实施本发明的试剂盒及其应用。
序列表
<110>武汉轻工大学
<120>荧光假单胞菌荧光定量pcr快速检测的方法和应用
<140>107477654
<141>-08-14
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tgcggtcaaccaggtgttcc20
<210>2
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
cgagataatcgcggtcagg19
<210>3
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
catccagcgtgaagacggcatcg23
技术特征：
1.一种荧光假单胞菌荧光定量pcr快速检测方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
(1)应用选择性增菌液中对待检样品进行增菌，并采用苯酚-氯仿-异戊醇法或煮沸法提取细菌基因组dna；
(2)将步骤(1)获得的基因组dna与引物和相应的探针混合，进行荧光定量pcr检测，其中所述引物和探针如下：
以荧光假单胞菌pfsbw25的gyrb基因为模板，使用软件primerexpress3.0设计特异性检测引物和探针，其中检测引物gyrb-f序列为5’tgcggtcaaccaggtgttcc3’，gyrb-r序列为5’cgagataatcgcggtcagg3’，探针gyrb-taqmen序列为5’catccagcgtgaagacggcatcg3’。
2.根据权利要求1所述的荧光假单胞菌荧光定量pcr快速检测方法，其特征在于：
所述待检样品为食品或者是食品的细菌平板培养物。
3.根据权利要求1或2所述的荧光假单胞菌荧光定量pcr快速检测方法，其特征在于：所述taqman探针的终浓度为500nmol/l。
4.权利要求1至3任一项方法在检测样品中荧光假单胞菌的应用。
5.一种荧光假单胞菌荧光定量pcr快速检测试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒包括pcr反应液，所述pcr反应液包括检测引物和探针，其中检测引物gyrb-f序列为5’tgcggtcaaccaggtgttcc3’，gyrb-r序列为5’cgagataatcgcggtcagg3’，探针gyrb-taqmen序列为5’catccagcgtgaagacggcatcg3’。
6.权利要求5所述的荧光假单胞菌荧光定量pcr快速检测试剂盒在检测样品中荧光假单胞菌的应用。
技术总结
本发明公开了一种荧光假单胞菌荧光定量PCR快速检测方法及试剂盒和应用。该方法及试剂盒通过对待检样品进行增菌获得的基因组DNA与引物和相应的探针混合，对样品中的荧光假单胞菌进行荧光定量PCR检测，检测特异性强，适应性广；检测方法快速、灵敏度高，适用于高通量筛检；可应用于样品中尤其是食品中荧光假单胞菌的高通量筛检。
技术研发人员：周敏;闵可;王宏勋;史贤明;施春雷
受保护的技术使用者：武汉轻工大学
技术研发日：.08.14
技术公布日：.02.28
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