乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒
【生产厂家】上海克隆生物高技术有限公司
【批准文号】国药准字S0029
【剂 型】检测试剂盒
【规 格】20人份
【医保类型】
【国家基本药物】否
【英文名】HBV DNA PCR-Fluorescence Quantitative Diagnostic Kit
【正文】
【用途】
本试剂盒采用PCR技术、实时荧光探针技术,用于对临床血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒核酸DNA的定量检测,本品可用于对乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察。本品的检测灵敏度为500拷贝/ml,定量测定范围500~108拷贝/ml。
PCR扩增前50℃处理2分钟,利用UNG将PCR反应液中可能存在的前次扩增污染物充分降解,以排除由此引起的假阳性检测结果。
【试剂盒组成】
32人份/盒
类 别
试剂名称
规 格
样品
处理试剂
煮沸法
[样品处理液A]
4 ml × 1瓶
[样品处理液B]
1 ml × 1支
柱提取
[样品处理液A]
4 ml × 1瓶
[去抑制剂]
1支
[核酸提取柱]
32个 × 1袋
[样品处理液B]
14ml × 1瓶
[样品处理液C]
4 ml × 1瓶
[灭菌纯化水]
1.8 ml × 2支
PCR扩增
反应试剂
适用所有
荧光PCR仪
[PCR反应液A]
480μl × 1支 (LightCycler 360μl × 1支)
[PCR反应液B]
480μl × 1支 (LightCycler 360μl× 1支)
[PCR反应液C]
40μl × 1支
LightCycler
专用
[PCR主反应液]
350μl × 1支
[氯化镁]
150μl × 1支
[荧光杂交探针]
1支
对照试剂
[阴性对照]
250μl × 1支
[工作标准品①]
250μl × 1支 (参数见试剂盒内提示)
[工作标准品②]
250μl × 1支 (参数见试剂盒内提示)
[工作标准品③]
250μl × 1支 (参数见试剂盒内提示)
[工作标准品④]
250μl × 1支 (参数见试剂盒内提示)
【适用荧光PCR仪器】
Roche LightCycler、ABI5700、ABI7000、枫岭FTC2000、博日Line-Gene、MJ Opticon等
【自备实验器材】
经高压灭菌(121℃,30分钟)处理的0.5ml离心管及10μl、200μl带滤芯吸嘴;各种规格的加样枪;高速离心机;震荡仪;水浴或干浴设备。
【标本采集】
样品可采用血清或血浆样本,血浆采用3%枸橼酸钠抗凝,抗凝剂:血液为1:9。
【操作步骤】
1.煮沸法——适用LightCycler的操作步骤见【附件1】。
2.煮沸法——适用ABI等荧光PCR仪的操作步骤见【附件2】。
3.柱提取——LightCycler专用的操作步骤见【附件3】。
4.柱抽提——适用ABI等荧光PCR仪的操作步骤见【附件3】。
【注意事项】
1.待检新鲜血清或血浆若不及时检测,应保存于-20℃。
1.试剂盒各组份使用前请充分融化并摇匀,离心管内的试剂需离心数秒后使用。
2.PCR操作各阶段应在不同实验区域进行,包括PCR扩增试剂准备区、标本处理区及PCR扩增检测区。
4.在标本处理阶段建议使用负压超净台。
5.应穿工作服,戴一次性手套(经常替换手套),使用一次性用品。
6.PCR操作人员应具有经验和受过培训。
7.操作过程中用到的超净台、移液器、离心机、扩增仪等仪器设备应经常用10%次氯酸或70%乙醇及紫外灯处理。
8.实验中废弃的吸嘴应弃于含10%次氯酸的废液缸中,以防止污染。
9.阴性对照、工作标准品应和待检标本平行进行操作后方可进行PCR扩增。
10.使用本试剂盒检测,请按传染病实验室检查规程操作。
11.血清标本的测定结果比血浆标本测定结果略低。
【试剂运输及储存条件】
试剂盒运输可在2~8℃环境下进行。储存时,须置-20℃保存。
【有效期】
本试剂盒有效期为12个月,在有效期内使用。
附件1:煮沸法——适用LightCycler的操作步骤
1.核酸提取(在标本处理区进行)
待测样品处理(将[阴性对照]、[工作标准品①]、[工作标准品②]、[工作标准品③]、[工作标准品④]与待测标本同步进行处理)
1.1用带滤芯吸嘴吸取100μl[样品处理液A]于0.5ml离心管中。
1.2加入100μl被测标本。
1.3盖上管盖,振荡混匀,13000rpm离心10分钟(离心时固定离心管方向)。
1.4吸弃上清(沉淀不明显,需在离心管底部沉淀对侧吸上清,应一次吸尽上清,避免搅动或碰到沉淀)。
1.5再加入25μl[样品处理液B]。
1.6振荡混匀,低速(2000rpm)离心数秒后,100℃干浴或沸水浴10分钟。
1.713000rpm离心10分钟,取上清为PCR反应模板。
(上清如不立即使用,须置-20℃保存,重新使用时需13000rpm离心10分钟。)
2.PCR试剂准备(在PCR前准备区进行)
2.1取试剂盒中[PCR反应液A]、[PCR反应液B]、[PCR反应液C]室温融化后,低速(2000rpm)离心数秒。
2.2根据待扩增样品数按[PCR反应液A]:[PCR反应液B]:[PCR反应液C]=9:8:1的比例配制PCR反应液,并分装至PCR毛细反应管中,每管18μl,将装有PCR反应液的反应管转移至标本处理区。
3.加样(在标本处理区进行)
在装有PCR反应液的毛细反应管中用带滤芯吸嘴分别加入2μl已处理好的标本(标本处理步骤1.7的上清)。盖上管盖,离心数秒后转移到扩增检测区。
4.PCR扩增检测(在扩增检测区进行)
4.1将毛细反应管放入LightCycler荧光PCR扩增仪进行扩增检测。
4.2循环参数设定:(荧光检测通道F1)
Program
Cycles
Temperature Target(℃)
Hold Time
(min:sec)
Slope
(℃/sec)
Acquisition
Mode
1
1
50
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