本发明属于分子生物学技术领域，涉及鸡细小病毒与h9亚型禽流感病毒二重pcr检测引物组、试剂盒及方法。
背景技术：
鸡细小病毒(chinckenparvovirus，chpv)是引发鸡群发生肠道疾病的重要病毒之一，临床上以腹泻、呈现精神抑郁和生长迟缓及料肉比增加等为特征。chpv主要侵害雏鸡，主要造成患病鸡腹泻和发育不良，该病毒在某些鸡群中普遍存在，研究发现在发育障碍与矮小综合征鸡群的血清中能检测出chpvdna。流行病学调查表明其在商品肉鸡感染率较高、蛋鸡或种鸡次之。近年来研究表明chpv在全球多个国家的鸡群中普遍存在，且近年来相继在北美的美国和巴西、东欧的波兰和匈牙利、克罗地亚及亚洲的韩国和中国等地区发现报道。
禽流感病毒(avianinfluenzavirus,aiv)是正黏病毒科中a型流感病毒属成员。根据其表面抗原血凝素蛋白(hemagglutinin,ha)和神经氨酸酶蛋白(neuraminidase,na)的差异可以将aiv划分为16种不同的ha亚型(h1～h16)和9种不同的na亚型(n1～n9)。依据aiv对鸡致病性的强弱，aiv还可以分为高致病性aiv(hpaiv)和低致病性aiv(lpaiv)。h9亚型禽流感病毒自1966年在美国首次被发现，随后我国广东地区也于1994年首次在发病鸡体内发现了该亚型aiv。研究表明h9亚型aiv容易与其他病原(病毒和细菌等)混合感染，进而给我国养禽业造成更为严重的损失；其与其它不同亚型aiv混合感染时，毒株之间容易发生基因片段重组，并产生一些不可预知的新型禽流感病毒，进而可能引起新型禽流感病毒的大流行。以来的部分报道还表明其可为h5n6和h7n9等高致病性亚型aiv的提供内部基因。
由上述报道可见，h9亚型aiv与chpv都对家禽养殖业造成了严重的危害。
鸡细小病毒在正常鸡胚和细胞培养中难以大量增殖，因此应用病毒分离及电镜观察等方法对该病进行诊断的难度很大。
传统的禽流感病毒检测方法是将病毒分离培养后再进行血清学方法鉴定，培养周期长，且要用到较多标准阳性血清，但是禽流感病毒不同亚型血清相互之间又存在不同程度的交叉免疫保护反应，其结果的准确性具有局限性，所以目前禽流感病毒较多的采用分子生物学方法进行检测。分子生物学方法特别是rt-pcr检测技术具有快速、简便和准确等优点，在禽流感的诊断及大规模监测过程中应用广泛。由于aiv感染动物后具有相似的临床症状，混合感染的现象也普遍存在，所以在日常诊断中难以及时准确的对其进行鉴别确诊。近年来，随着分子生物学技术的发展，多重pcr技术的应用也越来越多，多重pcr具有可以同时对多种病原体混合感染进行检测的优点，不但克服了常规单一pcr需要对混合感染样品进行逐项检测耗时长的缺点，而且多重pcr诊断技术的不断完善和发展进步，该技术已被成熟应用于多种禽病及其它动物病原混合感染的诊断。
技术实现要素：
本发明的目的是提供鸡细小病毒与h9亚型禽流感病毒二重pcr检测引物组、试剂盒及方法。
为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：本发明提供一种可通过二重pcr检测鸡细小病毒与h9亚型禽流感病毒的引物组，包括引物h9-f、引物h9-r、引物chpv-f和引物chpv-r。
引物h9-f的序列如seqidno.1所示，引物h9-r的序列如seqidno.2所示，引物chpv-f的序列如seqidno.3所示，引物chpv-r的序列如seqidno.4所示。
含有上述引物组的试剂或试剂盒属于本发明的保护范围。
本发明提供了上述引物组用于通过二重pcr检测鸡细小病毒与h9亚型禽流感病毒的方法。
所述的方法，进一步包括以下步骤：
(1)提取待测样品的cdna和dna作为模板；
(2)建立二重pcr反应体系，利用上述引物组进行二重pcr反应；
(3)将pcr反应产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，当样品扩增出558bp的条带时说明该样品有鸡细小病毒，当样品扩增出367bp条带时说明该样品有h9亚型禽流感病毒。
其中，步骤(2)中pcr反应体系为：2×pcrmix12.5μl，待测样品cdna和dna混合物模板2μl，引物h9-f和h9-r(25pmol/μl)各加入0.5μl，引物chpv-f和chpv-r(25pmol/μl)则分别加入0.8μl，最后用超纯水补足至25μl。
其中，步骤(2)中二重pcr反应条件为：95℃5min；进入95℃30s，56℃30s，72℃45s，共35个循环；然后再72℃延伸10min。
本发明提供了上述引物组或含有该引物组的试剂盒在检测检测鸡细小病毒与h9亚型禽流感病毒中的应用。
本发明的有益效果
本发明设计针对鸡细小病毒与h9亚型禽流感病毒的特异性引物，经过对不同引物组合进行试验筛选得到扩增效果较好的一个引物组合，然后继续对反应体系中引物浓度、引物之间的比例、退火温度和扩增时间进行优化，最终建立起可同时检测鸡细小病毒与h9亚型禽流感病毒的方法。本发明的引物和检测方法通过一次pcr反应便可同时确定样品中鸡细小病毒与h9亚型禽流感病毒的混合感染及单一感染情况，该方法同时具有特异性强、灵敏度高、快速简便及易于操作等优点，十分适于在基层单位应用推广，为鸡细小病毒与h9亚型禽流感病毒的监测及其防控提供技术支撑。
附图说明
图1为特异性试验结果；
图2为敏感性试验结果；
图3为部分临床样品检测结果。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1引物开发和合成
根据禽流感病毒h9亚型aiv的ha基因序列和chpvns基因的特异性保守区域，设计并通过验证筛选出2对针对h9亚型aivha基因和chpvns基因进行扩增的特异性引物，包括引物h9-f、引物h9-r、引物chpv-f和引物chpv-r。引物h9-f的序列如seqidno.1所示，引物h9-r的序列如seqidno.2所示，引物chpv-f的序列如seqidno.3所示，引物chpv-r的序列如seqidno.4所示。引物由赛默飞广州分公司进行合成。
实施例2二重pcr反应体系的建立及优化和特异性试验
1、毒株：aiv毒株(h1n2、h3n2、h6n2、h9n2、h9n6、ndv、ibv、arv、iltv、chpv、adv4、rtv、ampv、cav、ahev和mdv)均由广西兽医生物技术重点实验室保存；aiv(h7n2)的cdna模板由美国宾夕法尼亚州立大学惠赠；aiv毒株(h5n1)cdna模板由美国康涅狄格州立大学惠赠；其它aiv(h2n3)毒株或cdna模板由香港大学惠赠；
2、主要试剂和仪器：pcr仪购自美国bio-radlaboratories公司；超微量分光光度计购自美国thermo公司；2×pcrmix，dna/rna共提试剂盒、小量质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、感受态细胞、pcr产物快速连接载体和dnamarker购自北京全式金生物技术有限公司；m-mlv、随机引物、dntp及rna抑制剂购自宝生物(北京)有限公司；其它试剂均购自商业公司；
3、病毒rna/dna的提取与cdna合成：参照核酸抽提试剂盒使用说明书对本研究中所用到的aiv、ndv、ibv、arv、iltv、chpv、adv4、rtv、ampv、cav、ahev和mdv的dna/rna进行抽提，抽提后的核酸模板用33μldepc水溶解。rna模板参照反转录试剂盒的说明书进行cdna的合成，所有核酸模板均置-30℃低温保存备用；
4、二重pcr反应体系的建立及优化：建立25μl的pcr反应体系：2×pcrmix12.5μl，chpvdna和h9亚型aivcdna模板各1μl，引物chpv-f、chpv-r、h9-f和h9-r(25pmol/μl)各加入0.1～1.0μl，共设置10个试验梯度，每个梯度递增0.1μl，进行两个引物组合浓度的优化，最后用rna-free补足至25μl；
最终确定二重pcr的最佳反应体系为：2×pcrmix12.5μl，待测样品(cdna和dna混合物)模板2μl，引物h9-f和h9-r(25pmol/μl)各加入0.5μl，引物chpv-f和chpv-r(25pmol/μl)则分别加入0.8μl，最后用超纯水补足至25μl；最佳反应条件为：95℃5min；进入95℃30s，56℃30s，72℃45s，共35个循环；然后再72℃延伸10min。
5、运用上述所建立的二重pcr检测方法按照对h1n2、h2n3、h3n2、h5n1、h6n2、h7n2、h9n2、h9n6、ndv、ibv、arv、iltv、chpv、adv4、rtv、ampv、cav、ahev和mdv的cdna/dna进行检测验证所建方法的特异性。pcr反应产物通过琼脂糖凝胶电泳，电泳图为图1，在图1中各泳道分别为：m.dna标准dl2000；1.h9n2+chpv；2.chpv；3.h9n2；4.h6n2；h3n2；6.h5n1；7.h7n2；8.鸡传染性贫血病毒；9.禽i群腺病毒4型；10.禽轮状病毒；11.禽偏肺病毒；12.禽戊型肝炎病毒；13.鸡传染性支气管炎病毒；14.禽呼肠孤病毒；15.鸡传染性喉气管炎病毒；16.鸡新城疫病毒；17.马立克病毒；18.阴性对照。
从图1可以看出，用所建立的二重pcr法从h9及chpv混合感染样品中分别检测出2条特异性的条带，分别为558bp(chpv)及367bp(h9亚型)；对h9n2和h9n6亚型aivpcr检测的结果仅出现1条特异性条带，片段大小为367bp；对chpv检测结果仅出现1条特异性条带，片段大小为558bp；对其他亚型aiv未出现特异性条带，其它常见的禽病病原体均未扩增出任何条带，结果表明该方法具有良好的特异性。
实施例3敏感性试验
1、标准品的制备：参考[李丹,谢芝勋,宋德贵,等.h9和h6亚型禽流感病毒二重rt-pcr检测方法的建立[j].中国畜牧兽医,,43(12):3101-3106.]的方法，用chpvns基因和h9n2ha全长基因的引物，分别以h9n2与chpv的cdna为模板进行rt-pcr的扩增，得到其ha和ns基因的全长目的片段，并将这二个基因片段分别链接到pmd18-t的载体上。将含有h9亚型aiv的ha基因和chpvns基因片段的正确序列的重组载体分别命名为h9-t和ns-t。用质粒抽提试剂盒提取h9-t和ns-t的质粒，并用微量核酸检测仪对其进行核酸浓度的测定，根据分子质量和核酸浓度计算对应的拷贝数，将h9-t和ns-t等拷贝数混合，并进行10倍倍比稀释，以得到h9-t和ns-t质粒dna浓度均为5×109～5×101拷贝/μl的标准品。
2、敏感性试验运用上述优化好的二重rt-pcr检测方法对对h9-t和ns-t质粒浓度为5×107拷贝/μl至5×102拷贝/μl的样品进行特异性扩增，检测该方法的敏感性。pcr产物通过琼脂糖凝胶电泳，电泳图为图2，在图2中各泳道分别为：m.dnamarkerdl1000；1.5×107拷贝/μl；2.5×106拷贝/μl；3.5×105拷贝/μl；4.5×104拷贝/μl；5.5×103拷贝s/μl；7.negativecontrol。
从图2中可以看出，对浓度为5×107～5×104拷贝/μl的h9亚型aivha基因和chpvns基因质粒均有2条明显的特异性扩增条带出现，片段大小分别为367bp和558bp；对浓度等于或小于5×103拷贝/μl的h9亚型aivha基因和chpvns基因质粒均无扩增条带。由此可见，该法最低能检测到5×104拷贝/μl的h9亚型aivha基因和chpvns基因质粒，说明本方法的检测灵敏度高。
实施例4临床样品检测
1、检测样品：南宁活禽市场采集到140份鸡口腔及泄殖腔拭子样品，提取样品dna和cdna；
2、pcr反应体系和反应条件：
反应体系为：2×pcrmix12.5μl，待测样品dna和cdan混合物模板2μl，引物h9-f和h9-r(25pmol/μl)各加入0.5μl，引物chpv-f和chpv-r(25pmol/μl)则分别加入0.8μl，最后用超纯水补足至25μl；
反应条件为：95℃5min；进入95℃30s，56℃30s，72℃45s，共35个循环；然后再72℃延伸10min；
3、pcr反应产物使用琼脂糖凝胶电泳检测，
检测结果显示有2份样品能同时扩增出367bp和558bp的目的条带，为h9亚型aiv和chpv混合感染阳性，有3份样品能扩增出367bp的目的条带，为单一h9亚型aiv阳性，15份样品仅能扩增出558bp的目的条带，为chpv单一感染阳性。部分临床样品检测结果见图3，在图3中，样品14为chpv阳性产物；样品9、11、16为h9亚型aiv阳性产物；样品6、17为h9亚型aiv与chpv的阳性产物；其余为阴性产物。上述结果与病毒分离鉴定和ha基因测序结果100％相符。
序列表
<110>广西壮族自治区兽医研究所
<120>鸡细小病毒与h9亚型禽流感病毒二重pcr检测引物组、试剂盒及方法
<130>zyws
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>鸡细小病毒与h9亚型禽流感病毒二重pcr检测引物组、试剂盒及方法(artificialsequence)
<400>1
acagagcataatgggatgct20
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>鸡细小病毒与h9亚型禽流感病毒二重pcr检测引物组、试剂盒及方法(artificialsequence)
<400>2
gggcgtcttggatagggtaat21
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>鸡细小病毒与h9亚型禽流感病毒二重pcr检测引物组、试剂盒及方法(artificialsequence)
<400>3
gcagctgcaatcagagcaag20
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>鸡细小病毒与h9亚型禽流感病毒二重pcr检测引物组、试剂盒及方法(artificialsequence)
<400>4
ctccaccgtcagatcgcttt20
技术特征：
1.一种鸡细小病毒和h9亚型禽流感病毒的二重pcr检测引物组，包括引物h9-f、引物h9-r、引物chpv-f和引物chpv-r；
引物h9-f的序列如seqidno.1所示，引物h9-r的序列如seqidno.2所示，引物chpv-f的序列如seqidno.3所示，引物chpv-r的序列如seqidno.4所示。
2.含有权利要求1所述的引物组的试剂或试剂盒。
3.使用二重pcr检测鸡细小病毒和h9亚型禽流感病毒的方法，其特征在于，二重pcr所用的引物为权利要求1所述的引物组。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的cdna和dna作为模板；
(2)建立二重pcr反应体系，利用上述引物组进行二重pcr反应；
(3)将pcr反应产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，当样品扩增出558bp的条带时说明该样品有鸡细小病毒，当样品扩增出367bp条带时说明该样品有h9亚型禽流感病毒。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中pcr反应体系为：2×pcrmix12.5μl，待测样品cdna和dna混合物模板2μl，引物h9-f和h9-r各加入0.5μl，引物chpv-f和chpv-r则分别加入0.8μl，最后用超纯水补足至25μl。
6.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中二重pcr反应条件为：95℃5min；进入95℃30s，56℃30s，72℃45s，共35个循环；然后再72℃延伸10min。
7.权利要求1所述的引物组或含有该引物组的试剂盒在检测检测鸡细小病毒与h9亚型禽流感病毒中的应用。
技术总结
本发明公开了鸡细小病毒与H9亚型禽流感病毒二重PCR检测引物组、试剂盒及方法，设计了针对鸡细小病毒与H9亚型禽流感病毒的特异性引物，经过对不同引物组合进行试验筛选得到扩增效果较好的一个引物组合，然后继续对反应体系中引物浓度、引物之间的比例、退火温度和扩增时间进行优化，最终建立起可同时检测鸡细小病毒与H9亚型禽流感病毒的方法。本发明的引物和检测方法通过一次PCR反应便可同时确定样品中鸡细小病毒与H9亚型禽流感病毒的混合感染及单一感染情况，该方法同时具有特异性强、灵敏度高、快速简便及易于操作等优点，十分适于在基层单位应用推广，为鸡细小病毒与H9亚型禽流感病毒的监测及其防控提供技术支撑。
技术研发人员：谢芝勋;李丹;李孟;谢丽基;罗思思;张艳芳;张民秀;黄娇玲;范晴;王盛;谢志勤;邓显文;曾婷婷
受保护的技术使用者：广西壮族自治区兽医研究所
技术研发日：.10.31
技术公布日：.02.28
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