《Cancer Cell.》 年12月11日在线发表法国、比利时的Neou M, Villa C, Armignacco R,等联合撰写的《垂体神经内分泌肿瘤的泛基因组分类Pangenomic Classification of Pituitary Neuroendocrine Tumors.》（doi: 10.1016/ell..11.002.）。
垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs)很为常见，有五种主要的组织学亚型:泌乳素细胞、生长激素细胞和促甲状腺激素细胞(POU1F1/PIT1谱系)；促肾上腺皮质激素细胞(TBX19 / TPIT谱系);和促性腺激素细胞(NR5A1/SF1谱系)。我们报告一个全面的泛基因组分类。来自POU1F1/PIT1谱系的垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs)显示弥漫性DNA低甲基化的表观遗传特征，表现为转录因子的表达和染色体的不稳定性(GNAS突变的生长激素细胞除外)。在TPIT谱系中，促肾上腺皮质激素细胞被分为三类:USP8突变伴明显分泌(overt secretion)；USP8野生型伴增强的侵袭性（increased invasiveness），以及伴上皮-间质细胞转化增加（increased epithelial-mesenchymal transition）；在有(SF1表达的)GNAS-野生型生长激素细胞中也发现了促性腺激素标记的意外表达，这对目前关于SF1/促性腺激素谱系的定义提出了挑战。这一分类提高了我们的认识并影响到对垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs)患者的临床分层。
重点
●通过综合的泛基因组学分析，确定垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）的分子学类型。
●垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）的分子学分类主要反映PIT1驱动的垂体谱系
●在某些促肾上腺皮质激素细胞和生长激素细胞的垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）中，发现促性腺激素细胞的特征。
●USP8突变的促肾上腺皮质激素细胞垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）对应于一组具有有限进袭性的群体。
引言
垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs)占总人口的5% (Asa等，)。最常见的垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs)于泌乳素细胞谱系，其次是促性腺激素细胞、促生长激素细胞、促皮质激素细胞，更少见的是，促甲状腺激素细胞肿瘤，它们分别表达和/或分泌泌乳素、促性腺激素、生长激素(肢端肥大症)、促肾上腺皮质激素(库欣病)和促甲状腺激素(中枢性甲状腺机能亢进)。与这些分泌有关的内分泌疾病会诱发重要的并发症发生率，严重和不受控制的分泌有可能导致死亡。大多数的垂体内分泌肿瘤(PitNETs)是在局部发生的。一些垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs)侵袭或压迫邻近的结构，更罕见的是引起转移(Molitch, )。最近，与这些肿瘤相关的术语“腺瘤（adenoma）”被改称为“垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）”，能更好地反映这种潜在的局部和远处的进袭性(Asa等，)。
一线治疗包括垂体手术，连同针对特定的垂体神经内分泌肿瘤（PitNET）亚型的药物治疗:针对泌乳素细胞的多巴胺激动剂和针对生长激素细胞的生长抑素类似物。放射治疗和全身性化疗也可能被提出(Molitch, )。当无法完全手术时，就无法从临床或病理资料中确定残留肿瘤的预后。垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs)的组织-预后分级是一个有争议的话题(Rindi等，)。世界卫生组织(WHO)在发布了最新的组织学预后分类(Lloyd 等， )。
对垂体肿瘤的发生至今仍知之甚少。罕见的单基因家族性垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs)主要与MENIN和AIP的种系突变有关。复发性体细胞突变局限于促肾上腺皮质激素细胞垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs)中的，编码PKA-cAMP途径激活剂Gsα的GNAS， (Spada等， 1990)，和编码泛素特异性肽酶8 的USP8，(Ma 等， );(Reincke 等， )，两者在三分之一的病例中出现。垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs)以各种各样的基因组学方法（various genomic approaches.）为特征。外显子组测序未见USP8和GNAS以外的常见复发性突变(Bi等， ;Song 等， )。染色体分析显示出常见的广泛的染色体改变，与垂体神经内分泌肿瘤的一般良性的行为形成对比(Pack等， ;Salomon等，)。转录组学分析已经确定特定的生长激素细胞因子和促肾上腺皮质激素细胞标记(Salomon et al.， )，并提出了进袭性信号(Salomon等， )。miRNome表现出几种差异表达的microRNAs (miRNAs) (Bottoni 等， ；Cheunsuchon 等， )。DNA甲基化组显示差异甲基化基因（differentially methylatedgenes）(Duon等，；Salomon等，)，以及功能性与无功能性之间的差异甲基化模式(Ling等， ；Salomon等，)。大多数研究包括基于有争议的临床和形态学标准的单基因组分析和监督比较（supervised comparisons）。然而，Salomon 等()最近的一项研究对37例包括生长激素细胞、促肾上腺皮质激素细胞和无功能性垂体神经内分泌肿瘤的垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）进行外显子组、甲基化组和转录组学分析整合研究。
除了垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs），对其他类型的人类肿瘤也通过广泛使用泛基因组学（pangenomics）进行探索，以为更好地了解这些肿瘤和开发新的治疗方法提供高度有价值的数据来源(Cancer Genome Atlas Research Network 等， ；Zhang等，)。相比之下，垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs）还没有被正确地描述。在这里，我们从单个专家中心仔细收集了134例高质量和高纯度的垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs），并结合了各种组学（-omics）分析。我们包括了具有广泛的临床特征的所有组织学的、分泌性的和进袭性的类型。我们的目标旨在提供一个分子水平上的无偏差的分类（molecularly unbiased classification），以进一步破译导致肿瘤发生的途径，并从单组类型的垂体神经内分泌肿瘤（a single set ofPitNETs.）中提供广泛的分子数据。
结果
垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）患者
共纳入134例患者(表S1)，中位年龄49岁(范围:15 - 84虽)，女性和男性患者人数相等。肿瘤大小中位数为20mm(范围:6-50mm)。这个研究系列涵盖了所有类型的垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs），其中包括35例(26%)促肾上腺皮质激素细胞，29例(22%)促性腺激素细胞，23例(17%)促生长激素细胞，16例(12%)泌乳素细胞，和8例(6%)混合性生长激素/泌乳素(GH-PRL) 垂体术后内分泌肿瘤（PitNETs）。罕见类型也有代表，其中裸细胞8例(6%)，促甲状腺素细胞6例(4%)，多激素PIT1-阳性PitNETs9例(7%)。呈现不同程度的进袭性，其中60例(45%)患者术后病情缓解，48例(36%)患者有持续性疾病，12例(9%)患者有耐药性，14例(10%)为进袭性疾病(表S1)。
PitNETs的突变和染色体改变
通过外显子组和RNA测序结合(n = 83)或单独RNA测序(n = 51)建立突变景观（mutational landscape）。如前所述，在>5%的PitNETs中，只有GNAS和USP8两个基因发生了突变(Bi等， ；Song 等，)(表S2)。每个样本的体细胞突变的中位数为67个(范围:14-247)，如前所述,主要有C>T转换(80%)和三核苷酸突变“信号1[signature 1]”(84%)，(Bi等，;Song 等， )。在组织学类型之间无差异(数据未显示)。
我们利用SNP排列技术（array）识别到86例PitNETs的染色体改变。平均23%的基因组被改变(0%-100%;表S3)。确定了三个特征:(1)带有扩大染色体缺失的PitNETs，(2)带有安静的基因组的PitNETs，(3)具有延长的染色体增益的PitNETs(图1A -1C)。改变的数量因分泌类型而异(ANOVA p < 10-4), 静默性肿瘤较少有改变，(7%的促性腺激素和裸细胞，1%在静默性促肾上腺皮质激素PitNETs有改变），而相比之下，分泌性肿瘤则较多发生改变(51%的促甲状腺素细胞、49%的泌乳素细胞，32%促肾上腺皮质激素细胞，22%的多激素PIT1阳性细胞，和18%的生长激素细胞PitNETs中有改变;图1 D)。染色体改变与进袭性无关，(卡方[X2] p值= 0.21;图1D),也不在任何组织学类型(数据未显示)。纯合子的缺失和焦扩增（focal amplicons）是有限的(表S3)。
PitNETs的表观遗传学资料收集
111例PitNETs的miRNome（miRNA组学）由miRNA测序产生。结合基因组学的物理接近（physical proximity）以及其表达的相关性，12个miRNA簇含有至少5个miRNA，(图2A和表S4)。
从(miR1到miR4)四个组中确定基于非负矩阵因子分解（non-negative matrixfactorization）的无监督分类(Unsupervised classification)(图2B和2 C；表S5)，与肿瘤类型和分泌强烈相关(x2p < 10-35和 p <10-33, 分别).特别是,POU1F1/PIT1谱系肿瘤与促性腺激素细胞和促肾上腺皮质激素细胞PitNETS明显不同(图2B和表S5)。最大的miRNA簇，MEG3(85个miRNA) (Cheunsuchon等，)，与分泌相关 (ANOVA p 值 < 10-25;(图2C和2D)，伴在POU1F1/PIT1的PitNETs中有较高的表达。而再第二大的miRNA簇MiR532-let7簇(17个miRNA)中观察到相反的表达模式，也与分泌相关 (ANOVA p<10-14; 图2C和2D)。
对86例所有类型的垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs)，通过DNA微阵列实验，进行甲基化组的确定。使用折叠的（collapsed ）CpGs进行非监督分类(表S6)和一致性聚类（consensus clustering）识别与肿瘤类型 和分泌相关的(Met1至Met3的）三个组;（图3A和图3B)(x2p < 10 -18和 p < 10-22, 分别).尤其是POU1F1/ PIT1谱系肿瘤表现出整体的低甲基化，主要在“开放区域(open sea）”DNA中(图3C和3D)。在调节DNA甲基化的基因中，去甲基化酶TET2的表达呈与开放区域(open sea )DNA甲基化最密切相关(Pearrson’s r= -0.4;数据未显示)。接下来我们研究了在DNA甲基化和染色体改变之间的 联系。GNAS 突变的PitNETs呈现低甲基化的结合与有限数目的染色体的改变结合，而其他的PitNETs在DNA甲基化和染色体改变之间呈负相关(图3E;Pearson’s r =-0.39).在这些肿瘤中，考虑到在POU1F1/ PIT1阳性与POU1F1/ PIT1阴性的PitNETs之间有转位因子(TEs)差异表达, 而在去甲基化（hypomethylated）的肿瘤中，TE表达量较高 (Pearson’s r =-0.55;图3F和表S7)。在一个结合了DNA甲基化、染色体的改变，TE的表现中，POU1F1/PIT1谱系聚集在一个低甲基化、基因组改变和TE过表达的群体中，(图3 G)。我们可以推测，如在癌症中所报道的在POU1F1/PIT1谱系中的DNA低甲基化通过激活转位因子(TEs)，可诱发染色体改变。(Anwar等，)，但这仍有待调查。
DNA甲基化与1164 个 基因顺式表达（cis expression）呈负相关 (Pearson’s r <-0.5;表S8)。这些基因是富含在性-类固醇-反应（sex-steroid-response）和蛋白质分-泌特征(基因集合[gene-set]富集分析[enrichment analysis][GSEA]标准化富集分数> 2.8)。使用这1164个基因进行无监督的转录组学分类所产生的PitNET分类，强烈反映了甲基化组学的分类和POU1F1/PIT1 谱系(x2p < 10 -15, 数据未显示).五个miRNA的特征与顺式DNA甲基化呈负相关(Pearsonr < -0.5), 包括 MEG3 簇, 反映其母系印记，和四个反映POU1F1/PIT1谱系的miRNA(miR-574、miR-195、miR-497-5p和let-7b)。
PitNET转录组学
我们用RNA测序测定了134例PitNETs的转录组学。基于非负矩阵因子分解的无监督分类显示(t1到t6）六个不同的组；（图4 a和4 b)。这些组与世界卫生组织（WHO)）组织-预后（histo-prognostic）分类有关 (x2 p < 10-68), 有4个明显的差异。首先，世卫组织（WHO）的“裸细胞亚型（null-cell subtype）”并非与t4组中促性腺激素细胞肿瘤不同(图4A)。第二,确定了两种类型的促肾上腺皮质激素型PitNETs，具有t1组的有明显库欣的微腺瘤和t3组的静默性促肾上腺皮质激素细胞大腺瘤(对尺寸大小的t检验p值= 0.02;对分泌性的x2p < 10-4 )。第三。混合性GH-PRL型PitNETs在t6组中，除在t2组中发现成簇的泌乳素细胞肿瘤外，与生长激素细胞PitNETs聚集在一起。最后，稀疏颗粒性生长激素细胞PitNETs，以及促甲状腺激素细胞和多激素的PIT1-阳性的PitNETs主要见于t5组中，而不是与其他生长激素细胞PitNETs聚集的t6组中(5/8, x2p = 0.016;图4)。
在每个转录组中，驱动转录组的基因表现出明显的表达特征(表S9)。富集分析显示t1组中细胞周期高，炎症反应低(明显的库欣促肾上腺皮质激素细胞)，(泌乳素细胞)t2组中的的高MYC（原癌基因）靶区，t3组中(静默性促肾上腺皮质激素细胞)低上皮-间质转化，t4组中(促性腺激素细胞和生长激素细胞)的高氧化磷酸化反应，以及t5和t6中的高度干扰素a和-γ(GSEA标志假性发现率p值<0.05，标准化富集评分>3分;富集数据未显示)。有USP8-和GNAS突变的PitNETs分别与t1和t6转录组中特定的转录组亚群相关，（x2p < 104和p < 0.02;图4A)，具有不同于它们的野生型对应物的特定签名(表S9)。USP8的突变是与低表达氧化磷酸化、MYC靶向、炎症和上皮间质转化的特征相关(表S9)。
对每种PitNETs的细胞组成及分化情况，使用标准的转录组学特征（using a canonical transcriptome signature）估计为每个垂体神经内分泌细胞类型(表S10)。45例PitNETs (34%)显示≥2细胞类型的混合(图4C和表S11)，主要是GH-PRL型的PitNETs，具有单独的生长激素细胞和泌乳素细胞组成。值得注意的是，如一些作者之前所述，静默性促肾上腺皮质激素细胞PitNETs(7/8, 88%)，同时显示促肾上腺皮质激素细胞和促性腺激素细胞特征(t3集群;图4C)，(Cooper等， ;Suzuki等，)。这通过免疫组化检测共享表达的促性腺激素细胞标记的GATA3 得以证实(Mete 等，)(图4D)。这些肿瘤中GATA3、ACTH和TPIT的弥漫性阳性提示其通过相同的肿瘤细胞的共同表达(图4D)。最后，最稀疏的颗粒性生长激素细胞和多激素PIT1阳性PitNETs(分别为5/8和5/9),显示促甲状腺素细胞的特征(t5簇;图4C)。
在转录因子中(图4E和表S9)，促性腺激素细胞标志物NR5A1 (SF1)也表达于生长激素细胞PitNETs的子集中，与没有GNAS突变的PitNETS相对应(x2p = 0.003;图4 e)。
PitNET的泛基因组学分类
使用多因子（multiple factor）分析,将体细胞突变，染色体改变，以及miRN组学, 甲基化组学, 和转录组学(表S1, S2, S3，S4、S5、S6和S9)合并作单一分析（combined into a single analysis）。这是确定POU1F1/PIT1谱系作为主要分隔符(separator)的多组学的对PitNETS的推测（multi-omic projection of PitNETs）(图5 A和5B)。转录组学分类结合GNAS/USP8突变状态更适合分子组学与WHO 组织学预后分类相比(图5A和5B;分别按 年 WHO 的Bayesian 信息标准值-7.723，和-6.265 ,转录组学分类)。
泛基因组学分类的临床相关性
在t1转录组的促肾上腺皮质激素细胞PitNETs中，相比USP8突变的PitNETs ,USP8野生型PitNETsgen 更具进袭性(精确的Fisher检验p值= 0.018;图4A)。在这些肿瘤中，蝶骨侵袭更为常见(精确的Fisher检验p值= 0.007)相比之下，对于海绵窦侵袭没有差别((精确的Fisher检验p值 = 1)， MIB1/Ki67标记指数也没有差别(Wilcoxont检验p值= 0.26)。USP8野生型PitNETs增加的侵袭性进一步证实了通过它们的转录组特征，显示出增加上皮-间质-过化特征(GSEA标志FDR p < 10-3;图6A和表S9)。
生长抑素激动剂是主要的生长激素细胞PitNETs的治疗手段，也可用于促皮质素细胞PITNETs(Molitch, )。生长抑素受体亚型存在分子组间的不同表达(Kruskal-Wallis检验，SSTR2 和SSTR5分别的p < 10 -13和 p < 10 -15,图S1A及6B;表S9)。值得注意的是,对于促肾上腺皮质激素细胞PitNETs，在USP8-突变的PitNETs中，SSTR5的表达较高，相比 USP8-野生型(Wilcoxonp < 10 -4;图6B)，如前所述，支持USP8突变状态的潜在值以预测对帕瑞肽（pasireotide）的反应(Hayashi 等， )。正如最近提出的，多巴胺2型受体 (DRD2)在泌乳素细胞PitNETs中呈现最高度的表达(t2)，其次是促性腺激素细胞PitNETs(Ben-Shlomo等，)(图S1B)。值得注意的是，在生长激素细胞PitNETs中多巴胺2型受体的表达十分不同，而在GNAS突变的PitNETs中，有较高的表达(精确Fisherp = 0.001)，支持GNAS突变状态的潜在值用于预测生长激素细胞PitNETs对多巴胺激动剂的反应。
替莫唑胺目前被推荐用于治疗对其他治疗无反应的进袭性PitNETs，(Raverot等，)。替莫唑胺被甲基转移酶MGMT (O-6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶)降解(Hegi等，)。MGMT的表达在分子群体中是不同的(Kruskal-Wallis p < 10-4),但在群体内也是不同的，且与进袭性无关(Kruskal-Wallis p = 0.52;图6C和表S9)。MGMT表达和对替莫唑胺反应之间的相关性在三名患者进行评估。在1例没有反应的患者中，MGMT表达水平较高。有部分反应的1例患者，有中等的反应；而在一例有完整的反应的患者中，MGMT的表达较低(图6C)。MGMT表达与在MGMT位点的DNA甲基化之间无负相关性，包括其启动子(中位相关系数0.55;范围-0.27 到 0.76）。因此，MGMT mRNA表达水平可以作为替莫唑胺反应的预测指标，与以前发表的使用MGMT免疫组织化学相同(Bengtsson 等， )，但到目前为止，尚未得到重复（but notreproduced so far）。
讨论
本研究提供对PitNETs的泛基因组学分类。呈现出所有组织学类型，包括在以前报道的分子学研究中几乎没有或甚至难以获得的亚型，特别是泌乳素细胞，促甲状腺素细胞和多激素PIT1-阳性PitNETs。所有分泌强度和所有进袭性水平也被呈现出来，因此提供了一个全面的PitNETs的描写。这个队列被非常仔细地以包括激素和病理学水平两方面的临床为特征，，使用最先进的专业知识。（纯未碰撞的冻结物质[pure undegraded frozen material]）高质量地收集这些样本，由于体积尺寸小和某些亚型的罕见，具有挑战性。目前的分类是经验性的，主要基于组织学标准(Lloyd等，；Raverot 等， )。这个没有偏见的(unbiased)分子分类在很大程度上确认了《世界卫生组织WHO》分类，强调根据WHO分类所明确的，按垂体谱系因素的生物学相关性对PitNETs进行分类。然而，在临床相关性方面，识别进袭性的潜力和预测药物治疗的反应仍是未解决的难题。这种广泛的分子学研究有助于朝这个目标迈进。事实上,USP8突变的促肾上腺皮质激素细胞PitNETs的有限的侵袭蝶窦倾向和有限的上皮-间质-转化，支持用USP8的体细胞基因分型以测定预后结果。由于USP8-突变的促肾上腺皮质激素细胞PitNETs的分子组表现出较高的SSTR5表达，USP8突变状态也有助于预测对帕瑞肽(pasireotide)的反应。最后，MGMT的低mRNA水平可以用于预测对替莫唑胺的反应。进一步的临床研究现在应该能证实这些发现。
这项研究对目前对促性腺激素细胞谱系的定义提出了质疑。事实上，促性腺激素细胞的PitNETs(t4)的分子组中还包括裸细胞PitNETs，说明促性腺激素细胞PitNETs的定义应推广到未表达SF1的这一类型的PitNETs。此外，静默性促肾上腺皮质激素细胞PitNETs(t3)的分子组表现出促性腺激素细胞的特征。既往研究也报道在促肾上腺皮质激素细胞PitNETs的子集中有促性腺激素细胞标志物的表达(Cooper等, ;Suzuki等，)。这些PitNETs是否从有别于其他促肾上腺皮质激素细胞PitNETs的特定的垂体谱系起源，仍然有待确定。在小鼠模型中，有报道存在表达TPIT和阿黑皮素原（pro-opiomelanocortin）的不同的垂体细胞系(Drouin, )。最后，在GNAS野生型生长激素细胞(t6b)中发现，SF1的表达，引发对SF1作为促性腺激素谱系标志物的特异性的质疑。综上所述，这些结果表明目前对垂体肿瘤细胞的细胞分化的认识的局限性。
PIT1似乎是主要的分类驱动因子。POU1F1/PIT1谱系与DNA低甲基化、分化标志物的转录、转位因子(TEs)，和染色体不稳定性有关。POU1F1/PIT1的分化可能与可能是通过TET2的诱导低甲基化的表观遗传开关有关，这反映了最近报道的促性腺激素细胞谱系中TET1的表观遗传开关(Yosefzon等，)。功能性研究将有助于理解POU1F1/PIT1对DNA甲基化和更广泛的染色质结构，以及随后的潜在机制的直接影响。
除了USP8和GNAS突变外，大多数的PitNETs没有发现明显的驱动改变。尤其是其中24例PitNETS,显示无功能性体细胞变异(no functional somatic variant)和无染色体改变。大多数的这些PitNETs是静默性的(21/24,87%)，主要包括促性腺激素细胞和裸细胞(16/24,66%)，以及静默的促肾上腺皮质激素细胞(4/24;17%)PitNETs。考虑到从转录组学特征推断出的这些样本的高纯度，对于这些PitNETs,不可能出现基因改变检测的技术性失败(图4C)。利用全基因组测序和染色体结构分析等技术对这些PitNETs进行进一步的鉴定，可能揭示出非编码区中影响染色质开放和/或特定转录因子结合的突变。
综上所述，本研究提出了一种稳健的无偏见的（robust unbiased）分子分类方法，其中包含了以前没有描述过的新亚型。在此所确定的生物学机制和潜在的临床应用会带来在对了解这些肿瘤的生物学，并在管理这些肿瘤的患者方面的重要的提高。
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