《Endocrine Pathology》杂志 年3月 9日在线发表土耳其的Kara M, Tokat F, Pamir MN, Danyeli AE.等撰写的研究报告《（多肿瘤抑癌基因）CDKN2A在高风险垂体神经内分泌肿瘤中的频率和作用。Frequency and Role of CDKN2A Deletion in High-Risk Pituitary Neuroendocrine Tumors.》（doi: 10.1007/s1-020-09609-2. ）。
尚不清楚进袭性垂体神经内分泌肿瘤(pitNETs)的潜在机制。常有报道在多种癌症中，有染色体9p21上的CDKN2A抑癌基因编码的p16蛋白的丢失。因此，本研究旨在检测CDKN2A纯合子缺失在高风险型垂体神经内分泌肿瘤(PiNETs)中的状态。
作者采用荧光原位杂交技术(FISH)检测38例高风险型垂体神经内分泌肿瘤(PiNETs)(男性30例，女性8例)的CDKN2A的缺失情况。记录如性别等人口统计学特征，手术时的年龄，包括肿瘤大小和侵袭状态等鞍区磁共振成像的结果。
表1.患者统计资料及临床特点。
高风险型垂体神经内分泌肿瘤(PiNETs)组CDKN2A纯合子缺失发生率为3/38(7.89%)。三例CDKN2A纯合子缺失都为侵袭性致密颗粒性泌乳素腺瘤(p = 0.000)。CDKN2A的缺失与患者的年龄、性别、海绵窦侵袭(CSI)、肿瘤大小无关(p > 0.05)。Ki-67增殖指数与CDKN2A纯合子缺失显着相关(p = 0.003)。CDKN2A纯合子缺失的垂体神经内分泌肿瘤(PiNETs)的Ki-67增殖指数平均为10.7%，整个研究组的Ki-67增殖指数为4.1%。海绵窦侵袭（CSI）与泌乳素细胞瘤、侵袭性零细胞瘤、侵袭性促性腺激素细胞腺瘤等形态功能肿瘤类型显着相关(p = 0.021)。
这些发现提示p16基因失活与侵袭性泌乳素细胞腺肿瘤之间存在密切的相关性。需要进一步研究p16 (CDKN2A)基因在高风险型垂体神经内分泌肿瘤(PiNETs)中缺失的机制。
图1.高风险垂体神经内分泌肿瘤的显微照片，垂体神经内分泌肿瘤内可见致密颗粒性泌乳素细胞肿瘤，胞浆嗜酸性，胞核泡状，核仁突出(a)。肿瘤细胞对丙氨酸呈弥漫性阳性(b)。热点部位的Ki67标记指数高达15% (c)。
垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs)约占所有颅内肿瘤的15%。大多数的垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs)是良性的，显示缓慢扩张性生长的。然而，约35%的PitNETs是侵袭性的，其中一些表现出较强的进袭性临床行为，且复发率较高。经蝶窦手术(TSS)是治疗分泌生长激素(GH)和促肾上腺皮质激素(ACTH)的无功能性和功能性PitNETs的一线治疗方法。通常在对多巴胺激动剂产生耐药性或不能耐受或有严重肿块占位效应的情况下，对分泌泌乳素的泌乳素细胞肿瘤需进行手术治疗。对于肿瘤有残留、进展或复发的PitNETs患者，可采用再手术、放疗和药物治疗。尽管采用了多种治疗方法，有些PitNETS仍然具有抵抗性。因为早期识别潜在的进袭性肿瘤，可能改善预后预测PitNETs的行为是有挑战性的，但也是值得做的。在(第四版)世界卫生组织（WHO）内分泌肿瘤分类中，对pitNETs的分类是基于对细胞特异性垂体转录因子和垂体前叶激素的免疫染色所显示的垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）的形态功能状态。(第4版)WHO内分泌肿瘤分类中不鼓励使用不典型腺瘤（atypical adenoma）的分类，和常规p53评估。为了预测肿瘤复发的可能性，WHO分类保留了评估Ki-67增殖指数和有丝分裂活性的建议，并强调使用如放射影像学/外科手术中侵袭性的证据临床等参数。新版WHO分类没有包括“不典型性腺瘤（atypical adenoma）”的概念。但建议评估细胞增殖性(如Ki-67增殖指数、有丝分裂计数)和放射影像学/外科手术中侵袭性证据，以预测进袭性行为。WHO的分类还强调了一些可能具有更强的进袭性临床行为的特殊PitNET亚型:稀疏颗粒性生长激素细胞肿瘤(SGST)、男性的泌乳素细胞肿瘤(LT)、静默性促肾上腺皮质激素细胞肿瘤(SCT)、Crooke细胞肿瘤和PIT-1阳性的多激素肿瘤。
一部分的PitNETS可能表现出进袭性行为，并延伸至邻近的骨骼和鼻窦组织，而一小部分有可能变成恶性的，并可能转移到中枢神经系统以外。内分泌肿瘤的发生和发展被认为是由遗传和最近认为的表观遗传异常的积累引起的。
p16蛋白是由染色体9p21上的CDKN2A (MTS1, INK4A)抑癌基因编码，使cdk4-和cdk6 -细胞周期蛋白（cyclin ）D复合物（complex）功能失活。这些cdk细胞周期蛋白复合物反过来抑制控制细胞周期G1-S期检查点的视网膜母细胞瘤蛋白(pRb,由RB基因编码的)。p16的表达减少，从而导致增殖增加。因此，已在多种肿瘤中证实，CDKN2A基因因两个拷贝的缺失、点突变或甲基化而失活。
在文献中，导致PitNET序列中p16下调最常见的机制涉及CDKN2A启动子/外显子1甲基化，在一项研究系列中发现，其甲基化率为53%。由于我们没有发现CDKN2A缺失与进袭性垂体瘤之间的关系，我们分析了CDKN2A缺失在38个高风险垂体神经内分泌肿瘤中的作用，并将这些数据与形态功能肿瘤亚型、肿瘤大小、侵袭性、患者年龄和性别进行了比较。
图2. p16/ CDKN2A状态的FISH评估。正常的间期细胞有2个红色和2个绿色信号(a)，而CDKN2A纯合子缺失是通过每个细胞核丢失2个绿色信号来检测的(b)。
垂体神经内分泌肿瘤(PitNETS)
垂体神经内分泌肿瘤(PitNETS)很少表现为转移性传播；然而，他们较常具有侵袭性和表现出复发的行为和对常用的治疗方式的抵抗性。最近，基于出版的第4版《世界卫生组织WHO内分泌肿瘤分类》，对垂体神经内分泌肿瘤的进袭性和恶性的诊断和治疗管理发生了重要的变化。然而，试图建立临床进略性的预测标志物仍然是一个共同的挑战。最新的WHO分类引入了高风险性垂体腺瘤（high-risk pituitary adenoma）这一术语，用于描述快速生长的、放射影像学上具有侵袭性的和Ki-67增殖指数高的垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs)。此外，特定的形态功能亚群，如稀疏颗粒性生长激素细胞、PIT1阳性多激素细胞、男性的泌乳素细胞肿瘤、静默性促肾上腺皮质激素细胞肿瘤和Crooke细胞肿瘤也被认为具有潜在的进袭性。在我们的研究中，有38例患者根据这些标准被承认为高风险垂体神经内分泌肿瘤。
以前已知的不典型垂体腺瘤占所有垂体瘤的15% ；在我们的研究系列中，高风险的垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs）占所有接受经蝶窦手术的垂体神经内分泌肿瘤(PitNETs）的15.1%，与文献相一致。
Ki-67增殖指数
一般来说，有丝分裂计数和Ki-67增殖指数是神经内分泌肿瘤(NETs)的重要预后因素。WHO垂体神经内分泌肿瘤的分类未能确定有丝分裂计数或Ki-67增殖指数的截断值(cut-off)，从而将垂体瘤视作有增殖性的。然而，在神经内分泌肿瘤中，每10个高倍镜视野(HPF)中存在2个以上的核分裂和3%的Ki-67增殖指数通常被解释为增殖性增加的标志。在有可识别的热点（identifiable hotspots），WHO分类建议对热点的Ki-67增殖指数进行评估。根据我们的研究结果，Ki-67增殖指数与CDKN2A纯合子缺失（homozygous deletion）显着相关(p = 0.003)。CDKN2A纯合子缺失患者的Ki-67增殖指数均值为10.7%，整个研究组的平均Ki-67增殖指数为4.11%。这是文献中首次发现CDKN2A纯合子缺失与高风险PitNETs Ki-67增殖指数之间存在这种关系。Ki-67增殖指数与海绵窦侵袭性（CSI）无明显相关性(p> 0.05)。
在文献中，Ki-67增殖指数高的PitNETs出现率为16.8%。在这个研究系列中，Ki-67增殖指数≧3%的占高风险PitNETs的47.4% (n = 18)。在本研究中，我们观察到Ki-67增殖指数高对高风险PitNETs的复发具有预测价值(p = 0.034)。这些发现与Hassanov等的研究系列相一致。此外，以前的报道显示在肿瘤大小与Ki-67增殖指数之间的关系方面也有相互矛盾的结果。我们发现Ki-67增殖指数与肿瘤大小呈正相关(p = 0.047)，这与Hasanov等的研究结果相一致。
海绵窦侵袭
海绵窦和/或蝶窦内的肿瘤被认为具有侵袭性。术前MRI和术中可证实10 -20%的PitNETs患者存在海绵窦或蝶窦侵袭。MRI上的海绵窦侵袭（CSI）是预测预后的可靠因素。根据Hardy分类法，3级、4级、D期和/或E期肿瘤以及包绕或浸润2/3海绵窦的肿瘤被认为是侵袭性的。我们观察到海绵窦侵袭（CSI）与肿瘤复发相关(p=0.000)。海绵窦侵袭（CSI）与泌乳素细胞、零细胞（null cell）、促性腺激素肿瘤等PitNET亚群显着相关(p = 0.021)。整个研究组中海绵窦侵袭（CSI）的发生率为50% (n=19)。海绵窦侵袭（CSI）与CDKN2A、Ki-67增殖指数、肿瘤最大直径、或复发次数无显着相关性(p > 0.05)。
复发
与手术缓解率相比，神经外科中心的复发率差异很大，从0%到50%不等。所有高风险pitNET患者的复发发生率为22/38(57.9%)(表2)。复发与Ki- 67增殖指数(p= 0.034)、海绵窦侵袭（CSI）(p= 0.000)、肿瘤残留(p= 0.000)显着相关。
CDKN2A
肿瘤细胞和正常细胞一样经历有规律的细胞周期。当细胞进入细胞周期时，细胞依赖于细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的激活。只有与细胞周期蛋白结合，细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase）才能被激活，并在与一系列蛋白结合时被抑制。这些被称为周期蛋白依赖性激酶抑制剂的蛋白质是一组参与细胞周期负调控的小分子蛋白。这些蛋白的改变会导致细胞增殖失控，从而导致癌变。P16蛋白就是这些蛋白中的一种，P16基因的突变和缺失会造成细胞增殖的不可控，进而导致的癌变。p16基因的改变与各种肿瘤的癌变之间的关系已被证实。
基因组异常（Genomic aberrations）是导致基因功能紊乱（gene dysfunction）的机制之一，并与肿瘤的发生和肿瘤的进展密切相关。与DNA拷贝数变化相关的差异表达基因（Differentially expressed genes）可能是扩增或纯合子缺失的候选靶点，在肿瘤发生和癌症的发生中起重要作用。9p21.3是多种癌症中最常见的损失，包括胶质母细胞瘤、食管癌、胰腺癌等。CDKN2A和CDKN2B被鉴定为9p21.3缺失的驱动基因。CDKN2A和CDKN2B在许多癌症类型中经常失活。在肺癌中，CDKN2A常通过纯合子缺失、启动子区域的甲基化或点突变而失活。
虽然在PitNET中，CDKN2A的缺失以前已经得到过研究，但它从未在侵袭性PitNETs中被研究过。Seemann等在他们的72例(6%)PitNETs中检测到4例有CDKN2A的缺失。虽然相对罕见，但值得注意的是，在它们的研究系列中，有缺失的仅仅限于生长激素细胞和促肾上腺皮质激素细胞肿瘤。我们的研究结果显示，在38例高风险的PitNETs中，CDKN2A纯合子缺失的频率为3/38(7.9%)。然而，3例有CDKN2A纯合子缺失与男性泌乳素细胞肿瘤存在显着的相关性(p= 0.000)，且缺失状态与所有3例患者的Ki-67增殖指数存在显着的相关性(p=0.003)。CDKN2A缺失的3例肿瘤都为致密颗粒性泌乳素细胞肿瘤。
在大多数用多巴胺激动剂(DAs)治疗的泌乳激素细胞肿瘤中，血清泌乳素水平可恢复正常，肿瘤可缩小。这些患者通常不需要其他手术或放疗干预。然而，一部分患有泌乳素细胞肿瘤的患者表现出对多巴胺激动剂（DAs）的耐药性。先前的一项研究表明，对多巴胺激动剂（DAs）的耐药性似乎与D2多巴胺受体表达缺陷有关。根据我们的研究结果，2例泌乳素细胞肿瘤患者对多巴胺激动剂（DAs）产生了耐药性，但在这2例中未检测到CDKN2A的缺失。虽然研究的病例数量有限，但对多巴胺激动剂（DAs）的耐药性可能与CDKN2A的缺失无关(p > 0.05)。然而，我们的研究表明，CDKN2A在肿瘤的恶性进侵袭过程中起着重要的作用，在男性泌乳素细胞肿瘤中也起着作用。根据我们的研究结果，3例有CDKN2A缺失的Ki-67增殖指数分别为12%、10%和10%(平均10.7%)。3例都出现复发(100%)(表2)。
表.2患者特征。
表3.肿瘤特征。
结论
本研究是首次对CDKN2A纯合子缺失在高风险垂体神经内分泌肿瘤中的作用进行研究。p16通路和CDKN2A基因具有抑癌作用，在细胞增殖过程中起重要作用。这种基因的改变对肿瘤的生长和进展很重要。在我们的研究中没有检测其他涉及CDKN2A基因的变化(包括甲基化或突变)。因此，对进一步的研究有一个明确的要求，要有更大的样本量，涉及不止一个类型的垂体肿瘤。虽然我们相信初步的结果值得考虑，这项研究是进行更全面研究的第一步，其目的旨在评估再其他PitNETs中的这些相关性。希望进一步的研究能够阐明难治性和复发性垂体肿瘤的发生和发病机制，并为这些肿瘤开发新的替代治疗方法。在本研究中，我们观察到CDKN2A纯合子缺失在男性泌乳素细胞肿瘤患者中出现的频率高于其他高风险PitNETs。大肿瘤尺寸的(MRI上的大腺瘤)泌乳素腺瘤患者的确实具有进袭性的病程，但其潜在机制尚不清楚。尽管我们的研究系列的规模较小，CDKN2A的抑瘤作用的丧失可能在男性泌乳素细胞肿瘤的进袭性临床过程中发挥着作用。
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