Advanced Materials | 肿瘤激活的可放大的生物诱导脂蛋白进入肿瘤细胞以引起抗肿瘤免疫反应

免疫检查点阻断剂（ICB）在临床上的显着成功，使得癌症免疫治疗已成为癌症治疗中广泛关注的焦点，但是ICBs介导的免疫治疗只有10%到40%的患者能够受益。肿瘤免疫治疗的疗效很大程度上取决于肿瘤中癌细胞附近的抗肿瘤淋巴细胞的浸润，然而，肿瘤内存在的抗肿瘤淋巴细胞与癌症类型的潜在免疫原性高度相关，并受肿瘤免疫抑制微环境的影响。此外，癌细胞自身也会发生进化，促使其免疫逃逸浸润的淋巴细胞的杀伤。因此，如何改善肿瘤杀伤淋巴细胞的肿瘤浸润，逆转肿瘤的免疫抑制微环境，成为改善ICBs介导的实体瘤免疫治疗的迫切问题。某些化疗药物如奥沙利铂（OXP）能够诱导癌细胞的免疫原性细胞死亡（ICD），从而增强抗肿瘤免疫应答，协同ICBs介导的肿瘤免疫治疗。小尺寸纳米颗粒在肿瘤中显示出优越的穿透能力，但是它们在很大程度上被广泛存在的间质细胞所劫持，无法进入肿瘤中的癌细胞组分，此外，小尺寸纳米颗粒也遭受着肿瘤区域快速清除的困扰。中国科学院上海药物研究所李亚平教授课题组设计了一种肿瘤激活的可放大生物激发脂蛋白系统，以响应肿瘤中高表达酶和细胞内酸性环境（图1），从而促进肿瘤内对癌细胞组分的通透性和可及性，诱导抗肿瘤免疫应答，协同ICBs介导的肿瘤免疫治疗。这篇文章于今年8月份发表于杂志Advanced Materials，题为：Tumor-Activated Size-Enlargeable Bioinspired Lipoproteins Access Cancer Cells in Tumor to Elicit Anti-T umor Immune Responses。

图1.通过TA-OBL增强抗肿瘤免疫反应和协同ICBs介导的肿瘤免疫治疗示意图TA-OBL是通过整合一种豆科素敏感的1,2-二甲基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-聚乙二醇5000蜂毒肽共轭物（DMPE-PEG-LM），pH敏感的1-棕榈酰-2-环戊二酰磷脂酰胆碱（PCP）磷脂，以及一种对氮还原酶敏感的疏水性前药奥沙利铂（N-OXP）形成生物诱导的脂蛋白系统。肿瘤组织中过表达豆荚蛋白酶可特异性激活TA-OBL以释放蜂毒肽，促进其在瘤内穿透基质屏障和接近肿瘤中的癌细胞部分。TA-OBL被癌细胞内化后，在酸性环境下会发生粒径增大，释放出N-OXP，经硝基还原酶转化为一级氨基端的OXP，在还原环境中进一步降解为OXP，发挥ICD诱导活性，从而增强抗肿瘤免疫反应。（不含N-OXP的TA-OBL空白配方（称为TA-b-BL）和不含DMPE-PEG-LM和PCP的N-OXP生物诱导脂蛋白（称为OBL）作为对照）TEM检测TA-OBL的形态，显示为均匀的纳米尺度球形颗粒（图2A）。DLS分析表明，TA-OBL的平均直径为22.05±1.50nm。当TA-OBL与PBS（pH=7.4）和PBS（pH=7.4）与10%血清孵育24小时时，平均直径几乎没有变化，表明它们在模拟生理环境中具有良好的稳定性（图2B）。蜂毒肽是一种膜溶性肽，能诱导红细胞产生巨大的溶血作用,溶血试验用红细胞在PBS（pH=7.4）存在和不存在活性豆蔻酸的情况下进行，如图2D所示，在含有活性豆蔻酸的PBS（pH=7.4）中，TA-OBL和LM明显检测到溶血，而在不含活性豆蔻酸的PBS（pH=7.4）中几乎没有观察到溶血现象。TA-OBL的溶血率从6.03±0.18%显着增加到80%（图2E）。这些结果提示LM-pro肽能有效地恢复到活性蜂毒素中，并在肿瘤微环境中对豆蔻毒素有特异性反应。接下来，评估TA-OBL对细胞内酸性环境的反应性。TA-OBL在pH=5.5的PBS中孵育24小时后，其平均直径逐渐增大。透射电镜测量结果表明，在视场中存在大量不规则颗粒，颗粒的平均直径远远大于原直径（图2F），这是由于在酸性环境中PCP介导的颗粒聚集。同时，TA-OBL中的N-OXP在pH为7.4的PBS中逐渐释放，在孵育24小时内累积释放约35.0%，但在pH 5.5的PBS中迅速释放，累积释放约80%（图2H）。这些结果证实了TA-OBL在细胞内酸性环境下表现出尺寸增大和药物释放的响应性。

图2 .TA-OBL的表征接下来，作者在4T1细胞中评价TA-OBL对细胞存活率和诱导ICD的体外效果。用DiIC18(3) (DiI)荧光探针标记TA-OBL和OBL，在激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）和流式下观察。CLSM图像显示OBL和TA-OBL很容易在4T1细胞内检测到，并且主要分布在溶酶体内部（图3A）。细胞毒性试验表明，TA-OBL对细胞活力表现出明显的抑制作用,TA-OBL的OXP的IC50仅为8.56µg mL−1（图3B）。接着，作者评价了TA-OBL诱导4T1癌细胞表面CRT暴露、HMGB1释放和ATP分泌的效率，如图3C所示，与OXP处理相比，OBL、TA-b-BL和TA-OBL处理的4T1细胞可明显检测到CRT的绿色信号。流式显示TA-OBL治疗组CRT阳性细胞比例为50.5%，明显高于其他组（图3D）,引起4T1癌细胞HMGB1和ATP的显着释放（图3E）。因此，TA-OBL具有显着的诱导肿瘤细胞ICD的能力，为诱导肿瘤细胞产生抗肿瘤反应提供了前提。然后，作者用流式分析TA-OBL介导的ICD诱导的4T1癌细胞的DC成熟，其中成熟的DC表示为CD11c+CD80+CD86+细胞。TA-OBL治疗组DC成熟率为20.4±0.9%，分别比游离OXP和OBL高5.11倍和2.23倍（图3F）。同时，作者对成熟树突状细胞中白细胞介素12（IL-12）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌进行量化,TA-OBL处理组DCs成熟率为20.4±0.9%，分别比游离OXP和OBL高5.11倍和2.23倍(图3F)。结果表明，TA-OBL能有效地促进DC的成熟和抗肿瘤IL-12和TNF-α的分泌。

图3 .TA-OBL对4T1细胞的体外评价接着，作者将DiI标记的TA-OBL和OBL静脉注射给荷瘤小鼠，在注射后的特定时间点，用活体成像系统记录TA-OBL和OBL在荷瘤小鼠和主要器官中的荧光信号。如图4A，B所示，TA-OBL的红色荧光信号在注射后不同时间点的肿瘤部位都能很容易地检测到，其强度比OBL强。使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定不同器官的铂浓度（图4C），与游离OXP和OBL相比，TA-OBL治疗肿瘤部位的药物积聚更高。与OBL组相比，注射后2、8和24.0h肿瘤组织中Pt浓度分别提高了2.16、3.86和2.60倍。CLSM成像结果表明，TA-OBL的红色荧光信号在整个肿瘤切片中都可以很容易地观察到，其强度比对应的OBL强，这表明TA-OBL可以灵活地渗透到肿瘤组织中（图4D）。将肿瘤切片用特异性CD31标记物染色，勾勒肿瘤血管，并在CLSM下显示。如图4E所示，TA-OBL的红色荧光可以广泛可见，强度很强，而OBL的红色荧光主要局限于血管周围区域，说明TA-OBL从肿瘤血管系统向远处的肿瘤基质有较好的外渗作用。然后，作者评估了TA-OBL对肿瘤中4T1-GFP区域的可及性（图4F，G），如图4G所示，TA-OBL的红色荧光与4T1-GFP癌细胞区域的绿色信号大部分共定位。相比之下，OBL主要位于癌细胞区附近，但不能到达癌细胞区内部（图4F）。图像分析表明，TA-OBL的红色荧光信号与4T1-GFP的绿色荧光信号有较大的重叠，且强度较高。然而，OBL信号在距4T1-GFP细胞区20-40µm处停止，很少与4T1-GFP的绿色信号融合。与OBL相比，TA-OBL具有更高的肿瘤聚集性、更深的肿瘤穿透性和对肿瘤细胞组分的可及性，因此具有诱导癌细胞ICD诱导抗肿瘤反应的潜力。

图.4 TA-OBL的体内肿瘤靶向性、穿透性和对癌细胞组分的可及性免疫抑制微环境和抗原特异性抗肿瘤T细胞在肿瘤中的有限浸润是肿瘤免疫治疗的主要障碍。作者评估了TA-OBL诱导癌细胞ICD和重塑免疫抑制以增强抗肿瘤免疫反应的有效性（图5）。4T1荷瘤小鼠在接种肿瘤后第6、8和10天使用每种制剂进行治疗，在第12天检测肿瘤免疫微环境的变化（图5A）。将CRT暴露作为ICD的替代标志物，作者发现TA-OBL治疗在肿瘤中诱导了广泛和强烈的CRT暴露，这明显高于其他治疗（图5B）。用流式测量肿瘤组织和邻近淋巴结中DC成熟率。TA-OBL治疗促进DC成熟的效果最好，肿瘤的成熟率为15.77±2.15%，淋巴结的成熟率为30.63±1.76%（图5C），显示出增强抗肿瘤免疫的巨大潜力。用流式细胞仪检查CD3+CD4-CD8+T细胞和干扰素γ（IFN-γ）阳性CD3+CD8+IFN-γ+T细胞的瘤内浸润。经TA-OBL治疗后，肿瘤中CD3+CD8+IFN-γ+T细胞的频率明显增加到3.84±0.62%，分别是OXP和OBL的2.76倍（图5E）。流式显示，TA-OBL治疗组脾脏中的NK细胞（CD3−CD49b+细胞）数量明显增加。用流式检测肿瘤组织中的巨噬细胞（F4/80+），OBL和TA-OBL治疗组肿瘤中F4/80阳性细胞数量显着增加（p<0.05），但在其他治疗中几乎没有变化（p>0.05），表明TA-OBL治疗增强巨噬细胞募集。然后，确定肿瘤组织中M2表型TAM（特征为CD80−CD206+F4/80+）和M1巨噬细胞（特征为CD80+CD206−F4/80+）的细胞群体（图5F–H）。TA-OBL治疗组M2巨噬细胞百分率明显降低至2.08±0.69%，M1巨噬细胞百分率显着增加至18.43±0.65%（图5F，G）。经TA-OBL处理后，M1/M2比值显着升高至9.49±2.90，分别是TA-b-BL的2.62倍和OBL的3.08倍（图5H）。ELISA检测与IFN-γ、IL-12以及 IL-10免疫抑制因子水平。作者发现TA-OBL治疗明显提高肿瘤内IFN-γ和IL-12水平，与OBL组相比分别提高了1.88倍和2.54倍（图5I，J）。相比之下，TA-OBL治疗后肿瘤中的免疫抑制IL-10水平显着降低，仅为PBS对照组的9.51%，OBL治疗组的16.34%（图5K）。总的来说，TA-OBL治疗有效地重塑了肿瘤免疫微环境，并在4T1荷瘤小鼠中产生了强大的抗肿瘤免疫应答。

图5. TA-OBL诱导抗肿瘤反应的效果受TA-OBL诱导抗肿瘤免疫方面的优越效果的鼓舞，作者试图评估其在4T1肿瘤模型中的抗肿瘤效果，并通过与anti PD-1或anti CD47的ICB相结合来进一步提高其治疗效果（图6A）。TA-OBL治疗对肿瘤生长表现出最有效的抑制作用(图6B)。TA-OBL治疗对肿瘤生长的显着抑制作用也通过测量终点肿瘤肿块的重量得到验证，抑制率为72.60%(图6C)。作者检查了TA-OBL与抗PD-1或抗CD47的ICB的协同治疗效果（图6D-F）。4T1癌细胞表达低量PD-L1，并且4T1荷瘤小鼠对抗PD-1单一疗法的反应有限，TA-OBL与抗PD-1联合使用可使疗效得到适度提高，肿瘤生长延迟，小鼠存活率延长。在肿瘤接种的第22天（PBS组检测到死亡）和第30天（TA-OBL组检测到死亡），TA-OBL和anti PD-1联合治疗的肿瘤体积明显小于TA-OBL组（p<0.01）。此外，ta-obl+抗pd-1联合治疗在肿瘤接种后第30天的存活率为100%，而ta-obl治疗的存活率仅为33.33%（图6d）< span="">。考虑到CD47在4T1癌细胞上的高表达以及TA-OBL治疗后M1/M2比率的显着增加，作者进一步评估了TA-OBL与anti CD47的协同治疗（图6E）,给药方案如上所述（图6A）。TA-OBL和anti CD47联合治疗显示出明显的肿瘤抑制和生存延长（图6E）。与TA-OBL治疗相比，TAOBL+抗CD47联合治疗在肿瘤接种的第26天（PBS组检测到死亡）（p<0.05）和第32天（ta-obl组检测到死亡）肿瘤生长显着降低（图6e）。值得注意的是，ta-obl+抗cd47联合治疗在肿瘤接种的第36天显示了100%的存活率，但ta-obl治疗组没有存活率（图6e）。然后，< span="">作者测量了TA-OBL和anti PD-1在CT-26诱导的免疫原性肿瘤模型中的协同作用(图6F）。TA-OBL和anti-PD-1联合治疗可显着抑制肿瘤生长，延长生存率，且肿瘤大小在最终药物治疗后13天内几乎没有变化。在肿瘤接种的第25天（PBS组检测到死亡）和第27天（TA-OBL组检测到死亡），TA-OBL和anti PD-1联合治疗的肿瘤体积仅为TA-OBL治疗组的39.26%和32.53%。接种后第39天，TA-OBL+抗PD-1联合治疗的存活率为100%，而TA-OBL治疗的存活率仅为16.67%。这些数据证实了TA-OBL和ICBs在抑制肿瘤生长和延长生存期方面的优越的协同治疗效。

图6 .TA-OBL联合ICBs抑制肿瘤生长和延长生存率的体内治疗效果综上所述，作者成功地开发了一种肿瘤激活的可放大的OXP生物诱导脂蛋白系统（TA-OBL），它能有效地在肿瘤部位蓄积并长时间滞留，并能灵活地渗透到肿瘤中的癌细胞组分。以TA-OBL为纳米载体，将ICD诱导的OXP传递给肿瘤细胞，与游离OXP和对位OBL相比，TA-OBL疗法产生了更强的抗肿瘤免疫应答。此外，在两种肿瘤模型中，TA-OBL与ICBs的联合应用在延缓肿瘤生长和延长生存率方面具有很强的疗效。内容提供：LR

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