《Defifined tumor antigen-specifific T cells potentiate personalizedTCR-T cell therapy and prediction of immunotherapy response》
简介
从患者体内自然发生的肿瘤抗原特异性T(Tas)细胞中提取的T细胞受体(TCRs)设计的T细胞将靶向其肿瘤中的个人TSAs。为了建立这种个性化的TCR-T细胞治疗，通过单细胞mRNA测序(scRNA-seq)、TCR测序(TCR-seq)和体外新抗原刺激，对肿瘤及其邻近组织中的T细胞进行了全面的表征。与组织间循环的旁观者T细胞相比，TAS细胞具有肿瘤富集、肿瘤特异性克隆扩增和新抗原特异性的特征。我们发现CXCL13是CD4+和CD8+Tas细胞的独特标记物。重要的是，表达TAS细胞TCR的TCR-T细胞显示出显著的治疗效果
文章脉络
一、体外肿瘤抗原刺激系统 二、scRNA-seq和TCR-seq鉴定了在肿瘤中富集的T细胞簇 三、肿瘤特异性克隆扩增发生在肿瘤富集的T细胞簇中 四、具有肿瘤特异性tcr的T细胞簇的比例与TMB呈正相关 五、CXCL13是表达肿瘤特异性tcr的CD4+和CD8+T细胞的独特标记物 六、在肿瘤中特异性扩增的tcr在体外对新抗原刺激有反应 七、Tas细胞TCRs工程的TCR-T细胞抑制自体PDX肿瘤的生长 八：CXCL13在肿瘤中的表达可以预测对ICB的反应 九、基因表达谱分析可以识别Tas细胞的表面生物标志物
关键名词解释：
1、肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)治疗
肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）是从肿瘤组织中分离出的浸润淋巴细胞。 1986年Rosenberg研究组首先报道了肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte,TIL）。 TIL细胞 表型具有异质性。 一般来说，TIL中绝大多数细胞CD3阳性。 不同肿瘤来源的TIL细胞中，CD4+T细胞、CD8+T细胞的比例有差异。
2、TSA、TAS、TAA、TCR对比解释
3、ICB免疫检查点阻断
ICB能够使肿瘤特异性T细胞重新活化，恢复它杀伤肿瘤的能力，因此这个疗法广泛应用于多种肿瘤的临床治疗中。 遗憾的是，ICB治疗效果十分有限，比如在三阴性乳腺癌（TNBC）中有效率仅有4.7%；而且部分肿瘤还存在获得性耐药现象，在治疗后期肿瘤重新生长变大。
免疫检查点阻断(ICB)正在改变许多癌症的治疗范式，其原理是通过阻断表达免疫检查点的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用从而来解除肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用。 ICB最早被证明对转移性黑色素瘤患者有效，但现在这种治疗方法已扩展到其他类型和一些早期癌症当中。
4、PD1、PD-L1解释
PD1、PD-L1:PD-L1是肿瘤细胞产生的配体蛋白，能够和T淋巴细胞的PD-1相结合，T淋巴细胞的免疫识别功能被抑制，这样T淋巴细胞就不会杀灭带有PD-L1的肿瘤细胞，这样肿瘤就能顺利生长了；
基于以上的原理，PD-1抗体就是能够特异性的和PD-1相结合，从而解除了对T淋巴细胞的免疫抑制调节，这样T淋巴细胞就能杀灭肿瘤细胞了；而PD-L1抗体就是能够和肿瘤细胞的PD-L1相结合，这样肿瘤细胞的PD-L1就不能和淋巴细胞的PD-1想结合，淋巴细胞的免疫功能得到正常发恢，杀灭肿瘤细胞。
5、ORR、DCR、PFS、OS分别的含义解释：
6、流式细胞仪
流式细胞仪：通过流式细胞仪从患者肿瘤样本中分类Tas细胞可能是获得肿瘤抗原特异性TCRs用于个性化TCR-T细胞治疗的有效方法流失细胞仪可以对具有某种特征的细胞进行分离和进一步培养研究流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。 流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。 参考：流式细胞仪分析技术及应用 - 简书 ()
文章详解
一、体外肿瘤抗原刺激系统
建立了一个体外肿瘤抗原刺激系统来研究来自已测序的T细胞的tcr的抗原特异性，将TCR转导导外周血单核细胞的T细胞上，来建立TCR-T细胞。
具体过程为：
通过肿瘤和肿瘤周围组织的全外显子组测序 (WES) 和批量 RNA 测序 (RNA-seq) 鉴定了源自肿瘤突变的有效新抗原表位；
通过EBV感染从自体 B 细胞转化而来的 B 淋巴母细胞被用作抗原呈递细胞 (APC)；
通过将 TCR-T 细胞与用由肿瘤特异性突变序列组成的串联小基因转导的 APC 共培养来进行体外肿瘤抗原刺激；
通过干扰素 γ (IFNγ) 的产生来评估测试 TCR 的反应。
同时，将测序患者的肿瘤移植到免疫缺陷的NOD-SCID IL-2受体γ无效（NSG）小鼠中，建立PDX模型用于TCR-T细胞的治疗实验。
二、scRNA-seq和TCR-seq鉴定了在肿瘤中富集的T细胞簇
单细胞RNA测序（scRNA-seq）目前更常见的是将单个细胞包裹在微流体装置中的液滴中 (droplet-based)，在那里将mRNA转换为cDNA并扩增。每个小滴都带有一个独一无二的DNA “barcode”， 标记了它来自哪一个单个细胞。除此之外， 也有protocols会采用唯一的分子标识符(umi)，对捕获的mRNA在扩增测序之前进行标记。一旦逆转录完成，就可以将来自许多细胞的cDNA混合在一起进行测序。。scRNA-seq对于器官或者固体组织制备的细胞悬液的细胞活性和细胞数目有着较高的要求，这也意味着 “躺在”超低温冰箱中的大量珍贵临床样本（脑组织，肿瘤组织等）都无法进行scRNA测序。
TCR-seq：T细胞受体，T细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的分子，具有非常高的多态性，TCR分为TCRα/β和TCRγ/δ两种类型, 外周血T细胞主要为TCRα/β的T细胞, 是介导机体特异性细胞免疫 反应的主要细胞
TCRβ基因由可变区(V)、多变区(D)、结合区(J)和恒定区(C)四部分基因片段组成，形成互补决定区(complementarities determining region, CDR)和间隔的4个骨架区(framework region, FR)。
在T细胞发育过程中CDR1，2和FR区域相对保守，CDR3区由V、 D和J 进行重排(如图2所示)而形成具有功能的TCR编码基因(T细胞克隆)，由于V (65-100种)、D (2种)、J (13种)基因片段 本身具有多样性，此外，由于在重排的过程中，在VD及D-J的连接区经常有非模板的核苷酸的随机插入或删除，进一步增加了CDR3区的多样性。
这种基因片段连接的不准确性使TCR的表达呈多样性, 以识别各种不同的抗原。正常个体在无抗原刺激时，TCR基因重排是随机的，因此正常人外周T细胞呈多家族、多克隆性特点。
不同抗原(肿瘤、疫苗、病院微生物或者移植物等)刺激后，TCR V区基因可对该\抗原产生特异性识别，并使带有这类基因的 T细胞得到优势扩增，可用于分析不同 TCR V亚家族 T细胞的表达和利用。
T细胞受体测序(TCR seq)，采用多重扩增的手段获取TCRβ的CDR3区域，结合高通量测序技术，结合生物信息学分析 手段，分析VDJ重排的方式等，广泛应用于肿瘤免疫、自身免疫性疾病、器官移植免疫监测、疫苗注射免疫监测等领域。
T细胞受体测序(TCR seq) - 实验方法 - 丁香通 ()
T细胞受体（T cell receptor，TCR）是T细胞表面，负责特异性识别与MHC（主要组织相容性复合体）结合的抗原肽的蛋白。当TCR与抗原肽和MHC结合时，T淋巴细胞通过信号转导被激活，进入后续的免疫应答过程。人类基因组中有4个TCR基因：
两个编码轻链TCR：TRA基因编码TCRα，TRG基因编码TCRγ；
两个编码重链TCR：TRB基因编码TCRβ，TRD基因编码TCRδ；
重链TCR和轻链TCR形成异源二聚体，组成完整的TCR。在人类中存在两种TCR：TCRα/β和TCRγ/δ，其中95％的T细胞表达TCRα/β，称为αβT细胞；5％的T细胞表TCRγ/δ，称为γ/δT细胞。该比例在个体发育过程中和患病状态（例如白血病）中发生变化，物种之间也有所不同。
成熟的重链TCR基因由可变区（V）、多变区（D）、连接区（J）和恒定区（C）四部分基因片段组成（VDJC），轻链TCR则缺少D区（VJC）。重链和轻链TCR都具有3个互补决定区（complementarities determining region, CDR），在抗原识别中起主要作用：
CDR1和CDR2相对保守，负责识别MHC；
CDR3是负责识别抗原的主要CDR；
TCR-seq用于评价各种免疫相关疾病和遗传性突变引起的某个物种所有T细胞或特地T细胞激活介导的细胞免疫反应中TCR基因重排的碱基序，及个序列丰度。
TCR-seq是为了检测TCR多样性，目前主流两大技术：多重PCR和5‘RACE
选在扩增的T细胞（患者中含有相同TCR>=2T细胞）进行下一步分析，将CD4+,CD8+细胞分别聚类，T细胞亚型的经典标记物表明，在CD4+和CD8+T细胞以及CD4+调节性T细胞(treg)中都存在传统的幼稚、效应、记忆、调节簇。
单细胞测序能有效的解决肿瘤的异质性问题，单细胞分析中的经常见到t-SNE，具体意思为：t-SNE是一种可以把高维数据降到二维或三维的降维技术，它的特点是能够保留数据的全局和局部结构，通常用于做高维数据的可视化。经过高维数据降维后将相同类型的细胞归为一类，然后后面就可以看某个基因在这些细胞系中的表达情况。
三、肿瘤特异性克隆扩增发生在肿瘤富集的T细胞簇中
我们比较了肿瘤tcr在肿瘤及其邻近组织中的分布。我们观察到组织共享和肿瘤特异性的tcr(图2a)，这表明循环和局部扩张共同促进了肿瘤中T细胞的组成。为了确定哪些簇保留了T细胞克隆在肿瘤中特异性扩增，我们选择了每个簇中肿瘤T细胞的前10个tcr，并比较了它们在肿瘤及其邻近组织中的分布，在肿瘤富集簇中观察到肿瘤特异性TCR扩增
四、具有肿瘤特异性tcr的T细胞簇的比例与TMB呈正相关
由于Tas细胞被肿瘤抗原扩增，肿瘤中Tas的丰度可能与其TMB（肿瘤负荷）相关，TMB是新抗原负担的替代物。
肿瘤vs肿瘤周围样本进行WES测序，找肿瘤特异性突变，RNAseq测序，计算每个突变的表达量，TMB计算为每MB平均突变数，详细说明为：特定基因区域内体细胞非同义突变的个数，通常为每兆碱基多少个突变表示（mut/Mb）。
肿瘤特异性TCR扩增的簇(CD4+T细胞中C9、C10和CD8+T细胞中C8、C9)的比例与TMB显著正相关。大多数其他聚类与TMB呈负相关，尽管没有统计学意义。这些数据支持了TCR在肿瘤富集簇中的扩增主要是通过刺激由肿瘤突变衍生的新抗原来介导的
五、CXCL13是表达肿瘤特异性tcr的CD4+和CD8+T细胞的独特标记物
为了鉴定含有肿瘤中特异性扩增的TCRs的T细胞的生物标志物，我们将具有肿瘤特异性TCRs的T细胞与肿瘤CD4+或CD8+T细胞中具有组织共享TCRs的T细胞的基因表达进行了比较。CD4+Treg细胞也与具有组织共享tcr的CD4+T细胞进行了比较
CXCL13在具有肿瘤特异性的CD4+和CD8+T细胞中均有特异性表达
此外，在10例已测序的非小细胞肺癌(NSCLC)患者中，CXCL13+细胞在总肿瘤T细胞中的百分比与TMBs呈正相关
六、在肿瘤中特异性扩增的tcr在体外对新抗原刺激有反应
为了检测这些肿瘤特异性tcr是否能识别TSAs，我们采用体外肿瘤抗原刺激来检测肿瘤特异性和组织共享tcr的肿瘤抗原特异性。
1）从2个患者4个T细胞系中，挑选前5个TCR，每个患者共计20个TCR-T细胞系，这些TCR被合成并构建成一个表达表面标记物Thy1.1的低水平载体，TCR转载到自体PBMC（外周血单核细胞）的T细胞上；
2）选择mRNA表达量从高到中的100个突变作为潜在的肿瘤抗原，构建5个串联基因并转导到自体淋巴母细胞系(LCLs)中，每个基因由20个选定的突变序列组成。
3）将TCR-T分别和转导的和非转导的LCLs共培养，
4）通过细胞内染色测量 TCR-T 细胞中 IFNγ 的产生，以评估对抗原刺激的反应，产生至少比对照多 3 倍的 IFNγ 的 TCR-T 细胞被确定为阳性反应。
在 P4 患者中，1 个 CD4+ 和 4 个 CD8+ 肿瘤特异性 TCR 对肿瘤抗原刺激有阳性反应，但在肿瘤共享的 TCR 中未检测到阳性反应（图 4b）。 在 P5 患者中，一个 CD4+ 和所有 CD8+ 肿瘤特异性 TCR 对肿瘤抗原刺激有阳性反应，但没有一个肿瘤共有 TCR 显示阳性反应（图 4c）。 这些数据提供了直接证据表明在肿瘤中特异性扩增的 TCR 识别肿瘤抗原。
七、Tas细胞TCRs工程的TCR-T细胞抑制自体PDX肿瘤的生长
是否可以使用 Tas TCR 改造 TCR-T 细胞用于治疗自体肿瘤呢？作者发现表达来自 CD8+CXCL13+ T 细胞的 TCR 的 TCR-T 细胞对来自 P4或 P5 患者的自体 PDX 肿瘤显示出显着的治疗效果
八、CXCL13在肿瘤中的表达可以预测对ICB的反应
发现 CXCL13 的中位表达与多种癌症类型中的 ORR 显着相关，对 ICB 治疗前已发表的肿瘤样本 RNA seq 数据的分析还表明，CXCL13 的高表达与改善的总体存活率和对 ICB 的更好反应相关。
收集了黑色素瘤和结直肠癌 (CRC) 患者在ICB 治疗前的肿瘤样本，并通过 IHC 检查了 CXCL13 的表达。 与结果相似：高水平的 CXCL13 蛋白与这些患者的无进展生存期（PFS）改善相关。 这些数据表明，代表肿瘤中 Tas 细胞丰度的 CXCL13 水平可以准确预测对 ICB 的反应。
九、基因表达谱分析可以识别Tas细胞的表面生物标志物
表面标记可以促进从肿瘤中分选Tas细胞。 因此，挑选了在 CD4+ 或 CD8+ Tas 细胞中高度表达的表面基因，并比较了它们在肿瘤 T 细胞簇中的表达，发现 CD200 在 CD4+CXCL13+ Tas 细胞中特异性表达，ENTPD1 和 LAYN 可以将 CD8+CXCL13+ Tas 细胞与其他 CD8 簇区分开来，尽管它们在 CD4+ Treg.34中表达。
对已发表的 scRNA-seq 数据的分析表明，CD4+CXCL13+ 和具有相似特征的 CD8+CXCL13+ Tas 细胞出现在所有 9 种分析的肿瘤类型中，表明这些标记物可以识别跨肿瘤类型的 Tas 细胞。
表面标志物 CD200 和 ENTPD1 能够分别通过 FACS 分选从肿瘤中分离出 CD4+ 和 CD8+ Tas 细胞。
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