一种量子点双发射比率荧光探针及其制备方法 应用与流程

本发明涉及比率荧光探针技术领域，尤其涉及一种量子点双发射比率荧光探针及其制备方法、应用。

背景技术：

比率荧光探针是近年来备受关注的一种新型荧光传感器，它将两个不同的荧光团组合在一个纳米颗粒中，一个荧光团作为参考另一个荧光团作为信号单元，通过测量两个波长的荧光强度比值的变化来检测分析物。与单波长测量相比，比率荧光技术不受光源强度、仪器灵敏度等外部环境的影响，可以为环境效应提供内在的内置校正，在提高灵敏度和准确性方面具有优势。

通常使用量子点和有机染料作为比率探针的荧光信号。相比于有机染料，量子点具有荧光量子产率高、抗光漂白、发射光谱窄而对称、吸收光谱宽、波长可调谐性等优点。由于水相量子点合成方法比较简单，用其制备的荧光探针可以直接应用于水溶液中，因此常用水相量子点进行比率荧光微球的制备。然而水溶性量子点荧光产率低，性质不稳定，在应用方面受到一定的限制。而具有高发光性能，单分散性好，色纯度高的量子点通常在油相合成。在油相中合成的量子点表面包裹有一层有机配体分子，性质稳定，但具有疏水性。然而将油溶性量子点与纳米载体进行组装可有效改善量子点的生物相容性。

二氧化硅球具有较高的光学透明度，尺寸可控制，合成方法简单，并且可以进行多种表面硅烷化修饰，是一种优良的纳米载体。其中介孔二氧化硅球因其具有大的比表面积，较高的热稳定性等优点而应用广泛。现有量子点荧光比率微球制备技术主要通过包埋或共价偶联将量子点负载于硅球内部或表面。例如利用硅酸四乙酯水解形成硅层，在水相中将水溶性量子点包埋在硅层内形成荧光微球，对硅球表面进行氨基修饰，用碳二亚胺活化水溶性量子点的羧基，然后通过酰胺键负载在荧光微球表面，得到比率荧光微球。或者加入一些乳化剂，将量子点和碳点以一定比例混合，利用硅酸四乙酯的水解将两种荧光物质包埋在硅球内，形成荧光微球。

在上述方法中需要对量子点进行一定的修饰，因此在组装过程中可能导致量子点表面配体脱落，导致荧光猝灭，负载效率低，且最终得到的微球的荧光强度比具有随机性。

中国专利文献上公开了“一种双发射比率荧光探针的构建方法及其应用”，其公告号为cn106350069a，该发明通过将bpei-cqds碳量子点修饰在二氧化硅球上制备双发射荧光探针，其在苛刻条件下稳定性高，所建立的测定人体尿液中和血浆中微量cu2+的方法选择性好、灵敏度高、可视化。但是，该双发射比率荧光探针采用包埋的方法将红色cdte/cds水相量子点作为荧光硅球的内核，在该制备过程中，量子点表面配体易被改变导致荧光减弱，同时，从透射电镜图可以看出，每个荧光硅球中，红色量子点的负载量不多；该探针在ph5～7的条件下稳定性较好，而其他ph条件下荧光有所减弱，存在性质不够稳定，应用条件有限的问题。

技术实现要素：

本发明为了克服传统量子点比率荧光探针荧光比率调控准确度差、水溶性量子点性质不够稳定，在生物体上应用受限的问题，提供了一种粒径均一、荧光比率可调、性能稳定的量子点双发射比率荧光探针。

本发明为了克服传统量子点比率荧光探针制备过程中需要对量子点进行一定的修饰，在组装过程中可能导致量子点表面配体脱落，导致荧光猝灭，负载效率低，且最终得到的微球的荧光强度比具有随机性的问题，提供了一种量子点双发射比率荧光探针的制备方法，该方法在有机相中对量子点直接组装，不用对量子点表面进行任何改性和修饰，组装效率高，避免了复杂繁琐的量子点相转移等前处理，有利于量子产率的保持。

本发明还提供了一种量子点双发射比率荧光探针在可视化检测三聚氰胺中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种量子点双发射比率荧光探针，所述量子点双发射比率荧光探针以绿色量子点为核心，并包埋于巯基化介孔二氧化硅球中，然后经硅烷化处理、巯基化处理，加入红色量子点，超声组装、硅烷化处理后，得到量子点双发射比率荧光探针；所述绿色量子点为发绿色荧光的油相cdse/zns量子点(g-qds)；所述红色量子点为发红色荧光的油相cdse/zns量子点(r-qds)。

本发明的量子点双发射比率荧光探针利用金属-配基亲和作用，将性质比较稳定的油溶性量子点直接负载到巯基化介孔二氧化硅球里，实现量子点的高效组装；对复合微球进行硅烷化以及巯基修饰后，负载另一波长的量子点，通过控制量子点的加入量，从而得到不同比率的粒径均一、荧光比率可调、性能稳定荧光探针。本发明的绿色量子点和红色量子点是基于元素组成相同发两种荧光颜色的cdse/zns量子点，其原理为量子点具有尺寸依赖性，随着反应时间的延长，量子点的尺寸增加，发射光可以从蓝色调到红色。本发明所述绿色量子点为发绿色荧光的油相cdse/zns量子点，其尺寸为8nm；所述红色量子点为发红色荧光的油相cdse/zns量子点，其尺寸为12nm，可以通过调节红色量子点和绿色量子点的加入量，调节量子点双发射比率荧光探针的比率和颜色，得到不同荧光强度比的量子点双发射比率荧光探针。

一种量子点双发射比率荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)在巯基化介孔二氧化硅球中加入绿色量子点的氯仿溶液，超声处理，离心得沉淀(sq)，沉淀挥发掉氯仿后，加入辛基三甲氧基硅烷(otms)混合均匀，转移至甲醇/氨水混合液中，反应后离心得到沉淀，洗涤、分散于水/氨水混合液中，搅拌均匀，离心，得到水溶性的二氧化硅/绿色量子点荧光微球(记为[email protected]，otms-sq，缩写为otms-sq)，s代表介孔二氧化球，dendriticsilicasupports(dsio2)；q代表量子点，quantumdots(qds)，sq即为[email protected]的简写，otms-sq为转水相后的亲水的绿色荧光微球；该步骤以巯基化介孔二氧化硅球为金属亲和模板，直接在有机相中实现对油溶性量子点的高密度负载；通过烷基硅烷化试剂(otms)水解缩合，实现量子点组装体的硅烷化修饰即亲水改性，实现量子点微球的相转移，有效避免了常规配体替换方法造成的量子点发光效率下降，同时保持高发光效率，然后进一步进行二氧化硅壳层的可控生长；

(2)将步骤(1)得到的水溶性的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散在乙醇/水混合溶液中，加入氨水和正硅酸乙酯(teos)，搅拌均匀，离心得到硅烷化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球(记为[email protected]@sio2,，缩写为sqs)；第一个s代表介孔二氧化球，dendriticsilicasupports(dsio2)；第二个s代表包覆的二氧化硅壳层(记为sqs)；该步骤中，加入正硅酸乙酯的作用是将介孔二氧化硅球的孔填充满，为红色量子点提供附着空间，同时将红绿两种量子点隔开；

(3)将步骤(2)得到的硅烷化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散于乙醇中，加入氨水和(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(mptms)，搅拌均匀，离心得沉淀，将沉淀洗涤后均匀分散于乙醇中，得到巯基化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散液(记为[email protected]@sio2-sh,缩写为sqs-sh)；

(4)将步骤(3)得到的巯基化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散液离心，在沉淀中加入红色量子点的氯仿溶液，超声处理，离心；向沉淀(sqsq)中加入辛基三甲氧基硅烷(otms)并混合均匀，转移至甲醇/氨水混合液中，反应后离心得到沉淀，将沉淀洗涤后分散于水/氨水混合液中，搅拌均匀，离心、分散于乙醇中，得到水溶性的二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅/红色量子点荧光微球(记为[email protected]@[email protected]，缩写为otms-sqsq)；

(5)将步骤(4)得到的水溶性的二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅/红色量子点荧光微球分散于乙醇溶液中，加入水、氨水、正硅酸乙酯(teos)，室温搅拌，离心收集产物，洗涤，分散于水中，得到二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅/红色量子点/二氧化硅复合荧光微球(记为[email protected]@[email protected]@sio2，缩写为sqsqs)，即为量子点双发射比率荧光探针。

现有的量子点比率荧光微球通常是将水相量子点通过包埋或者共建偶联的方式制备，但是水相量子点表面配体在修饰过程中容易被破坏，可能影响最终的荧光强度，无法准确调控荧光比率。当荧光信号分子负载在硅球表面后，暴露在溶液中，不能确定是不是分析物将其猝灭，而且量子点含有有毒金属离子，在生物体上的应用受到限制。

本发明量子点双发射比率荧光探针的制备方法中将带有金属亲和性表面(如硫醇修饰)的介孔二氧化硅球与油溶性量子点在有机相中直接组装，不仅组装效率高，而且避免了复杂繁琐的量子点相转移等前处理，有利于量子产率的保持。同时由于油溶性量子点的性质稳定，因此在制备比率探针的过程中可以通过控制两种颜色的量子点的量，调节量子点双发射比率荧光探针的比率和颜色，得到不同荧光强度比的量子点双发射比率荧光探针。

作为优选，步骤(1)中，所述巯基化介孔二氧化硅球按照以下方法制得：在介孔二氧化硅球的乙醇溶液中加入氨水，(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，室温下搅拌过夜，离心收集产物，乙醇洗涤后，得到巯基化介孔二氧化硅球。

作为优选，所述介孔二氧化硅球按照以下方法制得：将三乙醇胺水溶液于75～85℃温度条件下加入十六烷基三甲基溴化铵和水杨酸钠，继续搅拌，加入硅酸四乙酯中继续反应，通过离心收集产物并用乙醇洗涤数次以除去残留的反应物，将收集的产物用盐酸/甲醇混合溶液在55～65℃下萃取以除去模板，离心收集产物，并洗涤，得到介孔二氧化硅球。

作为优选，步骤(1)中，所述绿色量子点与巯基化介孔二氧化硅球的质量比为(0.4～0.6)：1。

作为优选，步骤(1)和步骤(4)中，所述甲醇/氨水混合液中氨水与甲醇的体积比为(0.02～0.03)：1。

作为优选，步骤(1)和步骤(4)中，所述水/氨水混合液中氨水与水的体积比为(2×10-3～2.4×10-3)：1。

作为优选，步骤(2)中，所述乙醇/水混合液中乙醇与水的体积比为(3～4.5)：1。

作为优选，步骤(4)中，以巯基化二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅荧光微球总质量为基准，所述红色量子点与巯基化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球的质量比为(0.04～0.06)：1。

作为优选，步骤(5)中，乙醇与水的体积比为(3～4.5)：1；所述氨水与乙醇和水总用量的体积比为(0.02～0.03)：1；所述teos与乙醇和水总用量的体积比为(0.002～0.003):1。

一种量子点双发射比率荧光探针在可视化检测三聚氰胺中的应用，通过金纳米粒子(aunps)与量子点双发射比率荧光探针的内滤效应，对三聚氰胺进行快速可视化检测。

作为优选，基于量子点双发射比率荧光探针可视化检测三聚氰胺的方法为：

用柠檬酸钠还原法合成粒径约为13nm的水相aunps。在含有aunps的溶液中加入三聚氰胺，三聚氰胺的胺基与aunps表面的柠檬酸根通过配体交换和氢键相互作用，使得aunps从单分散的状态变成聚集的状态，紫外光谱发生改变，加入荧光探针后，将吸收信号转换为荧光信号，用于荧光和可视化检测三聚氰胺。

目前虽然已经报道了许多检测三聚氰胺的方法，但是简单快速高效的检测依然是研究的重点。金纳米粒子(aunps)由于其独特的尺寸依赖性光学性质和伴随的溶液颜色变化而应用广泛。内滤效应(ife)是指检测系统中吸收剂对荧光团的激发或发射光的吸收。与传统的基于荧光共振能量转移的荧光方法相比，ife不需要吸收剂和荧光团之间的化学连接。aunps具有高的摩尔消光系数，是一个好的吸收剂，因此aunps对量子点的ife被认为是开发荧光方法的有效策略。

因此，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的量子点双发射比率荧光探针粒径均一、荧光比率可调、性能稳定；

(2)制备方法简单高效，在有机相中对量子点直接组装，无需对量子点表面进行任何改性和修饰，组装效率高，避免了复杂繁琐的量子点相转移等前处理，有利于量子产率的保持；

(3)本发明的量子点双发射比率荧光探针可与金纳米粒子(aunps)基于内滤效应(ife)，实现对三聚氰胺的快速可视化检测，与传统的基于荧光共振能量转移的荧光方法相比，ife不需要吸收剂和荧光团之间的化学连接，应用范围更广。

附图说明

图1是本发明量子点双发射比率荧光探针的制备方法的合成机理示意图。

图2是实施例1制得的介孔二氧化硅球dsio2的tem图。

图3是实施例1制得的二氧化硅/绿色量子点荧光微球(otms-sq)的tem图。

图4是实施例1制得的二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅荧光微球(sqs)的tem图。

图5是实施例1制得的二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅/红色量子点荧光微球(sqsq)的tem图。

图6是实施例1制得的二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅/红色量子点/二氧化硅复合荧光微球(sqsqs)的tem图。

图7是实施例1制得sqsqs在检测水中三聚氰胺时，添加不同浓度的三聚氰胺后sqsqs的荧光照片。

图8是实施例1制得sqsqs在检测水中三聚氰胺时，添加不同浓度的三聚氰胺后sqsqs的荧光光谱图。

图9是实施例1制得sqsqs在检测水中三聚氰胺时，i627/i528与三聚氰胺浓度(0.02-0.96μm)(n＝3)的线性图。

图10是实施例2制得sqsqs在检测牛奶中三聚氰胺时，色调值作为三聚氰胺功能的线性校准图。插图是荧光照片和加入不同量三聚氰胺的纳米探针的计算浓度(通过色调值)。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。

本发明以下实施例中，cdse/zns绿色量子点(g-qds)购买自广东普加福光电科技有限公司，生产批号为180409t2501103；cdse/zns红色量子点(r-qds)购买自广东普加福光电科技有限公司，生产批号为zs027。

本发明以下实施例中：

介孔二氧化硅球的合成方法为：

将0.14g三乙醇胺(tea)加入到50ml水中，并在80℃油浴中磁力搅拌0.5小时。然后，将0.76g十六烷基三甲基溴化铵(ctab)和0.34g水杨酸钠(nasal)加入上述溶液中并继续搅拌1小时。然后，在搅拌下，将8ml硅酸四乙酯(teos)加入到水-ctab-nasal-tea溶液中反应4小时。通过离心收集产物并用乙醇洗涤数次以除去残留的反应物。将收集的产物用盐酸和甲醇溶液在60℃下萃取6小时两次以除去模板，通过离心收集产物并用乙醇洗涤数次，最后将产物分散在乙醇溶液中，得到介孔二氧化硅球。

巯基化介孔二氧化硅球的合成方法为：

取上述介孔二氧化硅球的乙醇溶液100ml，加入0.7ml氨水，0.5ml(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(mptms)，室温下搅拌过夜，离心收集产物巯基化介孔二氧化硅球，乙醇洗三次，产物最后保存在乙醇溶液中，冰箱4℃储存待用。

金纳米颗粒(aunps)的合成方法为：

1mmhaucl4水溶液150ml，回流搅拌下加热至沸腾，快速加入1％柠檬酸三钠15ml，继续加热20min溶液颜色变为酒红色，冷却至室温，用0.22μm滤头过滤，4℃储存待用。

实施例1

(1)取1ml巯基化介孔二氧化硅球乙醇溶液离心，沉淀中加入10mgml-1cdse/zns绿色量子点的氯仿溶液0.5ml，超声得到绿色均相溶液；离心，得到二氧化硅/绿色量子点复合物沉淀(sq)；将二氧化硅/量子点微球沉淀物在空气中稍微干燥后，加入100μlotms，沉淀溶解后得到均相溶液；将该溶液转入7.5ml甲醇及187.5μl氨水混合溶液中反应30min；离心，用甲醇洗涤沉淀一次。将沉淀分散于16.5ml水中并加入33μl氨水，在室温下搅拌过夜得到水溶性的二氧化硅/量子点荧光微球(otms-sq)；

(2)将步骤(1)得到的水溶性的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散于30ml水-乙醇混合液中，加0.75ml氨水，300μlteos，室温搅拌10h。将溶液离心并用乙醇洗涤3次，沉淀分散于10ml乙醇中，得到硅烷化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球(sqs)；

(3)将步骤(2)得到的硅烷化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散于乙醇中，向上述10ml乙醇分散液中加入30ml乙醇及1ml氨水，混合均匀后加入200μlmptms，室温条件下搅拌过夜，离心用乙醇洗三次，得到巯基化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散液(sqs-sh)；

(4)将步骤(3)得到的巯基化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散液离心，向沉淀中加入2mgml-1cdse/zns红色量子点的氯仿溶液1ml，超声得到均相红色色透明溶液；离心得到二氧化硅/红色量子点复合物沉淀(sqsq)，向沉淀中加入100μlotms，沉淀溶解得到均相溶液，加入7.5ml甲醇及187.5μl氨水后反应30min；离心，用7.5ml甲醇洗涤沉淀一次。将上述沉淀分散于16.5ml水中并加入33μl氨水，在室温下搅拌过夜，离心，将沉淀分散在6ml水中，得到水溶性的二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅/红色量子点荧光微球(otms-sqsq)；

(5)将步骤(4)得到的水溶性的二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅/红色量子点荧光微球分散于24ml乙醇溶液中，加入6ml水、0.75ml氨水、60μl正硅酸乙酯(teos)，室温搅拌，离心收集产物，洗涤，分散于水中，得到二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅/红色量子点/二氧化硅复合荧光微球(sqsqs)，即为量子点双发射比率荧光探针。

将实施例1得到的量子点双发射比率荧光探针，应用于水中三聚氰胺的检测，检测体系为1ml。在2ml离心管中，加入5μl比率探针，250μlaunps，加入50μl不同浓度的三聚氰胺水溶液，用pb(10mmph8.0)缓冲液调整总体积为1ml。在365nm紫外灯下拍摄荧光照片，检测结果如图7所示：加入不同浓度的三聚氰胺后，在365nm紫外灯下的照片，随着三聚氰胺浓度的增加，溶液颜色从红色到橘黄色再到绿色。荧光光谱如图8所示：加入不同浓度的三聚氰胺的光谱图，随着三聚氰胺浓度的增加，528nm处的绿色荧光逐渐增强，627nm处红色荧光逐渐减弱。图9是以三聚氰胺浓度和对应的荧光强度比为坐标，检测水中三聚氰胺浓度的线性图。

实施例2

实施例2与实施例1的区别在于，实施例2步骤(4)中加入红色量子点的量为1.2ml(2.4mg)，与实施例1的红色量子点的量不同，得到的比率探针的红绿荧光比不同。

通过加标回收试验，将实施例2得到的量子点双发射比率荧光探针应用于牛奶中三聚氰胺的检测，检测体系为1ml。在2ml离心管中，加入5μl量子点双发射比率荧光探针，250μlaunps，加入50μl处理后的含有不同浓度三聚氰胺的牛奶样品溶液，用pb(10mmph8.0)缓冲液调整总体积为1ml，然后记录荧光光谱。在365nm紫外灯下拍摄荧光照片，检测结果如图10所示：插图为检测牛奶样品的荧光照片，以及根据色度-浓度线性图计算出的三聚氰胺的浓度，分别为0.201μm，0.483μm，0.779μm，样品溶液颜色分别为橘红色，橘黄色，黄绿色，其浓度为检测出的浓度。

表1是光谱和可视化检测牛奶中三聚氰胺的结果：

表1.牛奶中三聚氰胺的检测结果

数据用平均数±标准差表示(n＝3)。

由表1可以看出，光谱测试的加标回收率在101％-108％，可视化检测的加标回收率在95％-100％，相对标准偏差比较小。

实施例3

实施例3与实施例1的区别在于，实施例3与实施例1的区别在于，实施例2步骤(4)中加入红色量子点的量为1.5ml(3.0mg)，与实施例1的红色量子点的量不同，得到的比率探针的红绿荧光比不同。

实施例4

(1)取1ml巯基化介孔二氧化硅球乙醇溶液离心，沉淀中加入10mgml-1cdse/zns绿色量子点的氯仿溶液0.4ml，超声得到绿色均相溶液；离心，得到二氧化硅/绿色量子点复合物沉淀(sq)；将二氧化硅/量子点微球沉淀物在空气中稍微干燥后，加入100μlotms，沉淀溶解后得到均相溶液；将该溶液转入9ml甲醇及180μl氨水混合溶液中反应30min；离心，用甲醇洗涤沉淀一次。将沉淀分散于16.5ml水中并加入33μl氨水，在室温下搅拌过夜得到水溶性的二氧化硅/量子点荧光微球(otms-sq)；

(2)将步骤(1)得到的水溶性的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散于6ml水与27ml乙醇混合液中，加0.75ml氨水，300μlteos，室温搅拌10h。将溶液离心并用乙醇洗涤3次，沉淀分散于10ml乙醇中，得到硅烷化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球(sqs)；

(3)将步骤(2)得到的硅烷化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散于乙醇中，向上述10ml乙醇分散液中加入30ml乙醇及1ml氨水，混合均匀后加入200μlmptms，室温条件下搅拌过夜，离心用乙醇洗三次，得到巯基化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散液(sqs-sh)；

(4)将步骤(3)得到的巯基化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散液离心，向沉淀(约50.5mg)中加入2mgml-1cdse/zns红色量子点的氯仿溶液1ml，超声得到均相红色色透明溶液；离心得到二氧化硅/红色量子点复合物沉淀(sqsq)，向沉淀中加入100μlotms，沉淀溶解得到均相溶液，加入9ml甲醇及180μl氨水后反应30min；离心，用7ml甲醇洗涤沉淀一次。将上述沉淀分散于16.5ml水中并加入33μl氨水，在室温下搅拌过夜，离心，将沉淀分散在6ml水中，得到水溶性的二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅/红色量子点荧光微球(otms-sqsq)；

(5)将步骤(4)得到的水溶性的二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅/红色量子点荧光微球分散于27ml乙醇溶液中，加入6ml水、1ml氨水、66μl正硅酸乙酯(teos)，室温搅拌，离心收集产物，洗涤，分散于水中，得到二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅/红色量子点/二氧化硅复合荧光微球(sqsqs)，即为量子点双发射比率荧光探针。

实施例5

(1)取1ml巯基化介孔二氧化硅球乙醇溶液离心，沉淀中加入10mgml-1cdse/zns绿色量子点的氯仿溶液0.5ml，超声得到绿色均相溶液；离心，得到二氧化硅/绿色量子点复合物沉淀(sq)；将二氧化硅/量子点微球沉淀物在空气中稍微干燥后，加入100μlotms，沉淀溶解后得到均相溶液；将该溶液转入7ml甲醇及210μl氨水混合溶液中反应30min；离心，用甲醇洗涤沉淀一次。将沉淀分散于17ml水中并加入40μl氨水，在室温下搅拌过夜得到水溶性的二氧化硅/量子点荧光微球(otms-sq)；

(2)将步骤(1)得到的水溶性的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散于7ml水与21ml乙醇混合液中，加0.75ml氨水，300μlteos，室温搅拌10h。将溶液离心并用乙醇洗涤3次，沉淀分散于10ml乙醇中，得到硅烷化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球(sqs)；

(3)将步骤(2)得到的硅烷化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散于乙醇中，向上述10ml乙醇分散液中加入30ml乙醇及1ml氨水，混合均匀后加入200μlmptms，室温条件下搅拌过夜，离心用乙醇洗三次，得到巯基化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散液(sqs-sh)；

(4)将步骤(3)得到的巯基化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散液离心，向沉淀(约51.0mg)中加入2mgml-1cdse/zns红色量子点的氯仿溶液1.2ml，超声得到均相红色色透明溶液；离心得到二氧化硅/红色量子点复合物沉淀(sqsq)，向沉淀中加入100μlotms，沉淀溶解得到均相溶液，加入7ml甲醇及210μl氨水后反应30min；离心，用7ml甲醇洗涤沉淀一次。将上述沉淀分散于17ml水中并加入40μl氨水，在室温下搅拌过夜，离心，将沉淀分散在6ml水中，得到水溶性的二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅/红色量子点荧光微球(otms-sqsq)；

(5)将步骤(4)得到的水溶性的二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅/红色量子点荧光微球分散于21ml乙醇溶液中，加入7ml水、0.66ml氨水、84μl正硅酸乙酯(teos)，室温搅拌，离心收集产物，洗涤，分散于水中，得到二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅/红色量子点/二氧化硅复合荧光微球(sqsqs)，即为量子点双发射比率荧光探针。

实施例6

(1)取1ml巯基化介孔二氧化硅球乙醇溶液离心，沉淀中加入10mgml-1cdse/zns绿色量子点的氯仿溶液0.6ml，超声得到绿色均相溶液；离心，得到二氧化硅/绿色量子点复合物沉淀(sq)；将二氧化硅/量子点微球沉淀物在空气中稍微干燥后，加入100μlotms，沉淀溶解后得到均相溶液；将该溶液转入7.5ml甲醇及187.5μl氨水混合溶液中反应30min；离心，用甲醇洗涤沉淀一次。将沉淀分散于16.8ml水中并加入40μl氨水，在室温下搅拌过夜得到水溶性的二氧化硅/量子点荧光微球(otms-sq)；

(2)将步骤(1)得到的水溶性的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散于6.5ml水与26ml乙醇混合液中，加0.75ml氨水，300μlteos，室温搅拌10h。将溶液离心并用乙醇洗涤3次，沉淀分散于10ml乙醇中，得到硅烷化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球(sqs)；

(3)将步骤(2)得到的硅烷化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散于乙醇中，向上述10ml乙醇分散液中加入30ml乙醇及1ml氨水，混合均匀后加入200μlmptms，室温条件下搅拌过夜，离心用乙醇洗三次，得到巯基化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散液(sqs-sh)；

(4)将步骤(3)得到的巯基化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散液离心，向沉淀(约51.6mg)中加入2mgml-1cdse/zns红色量子点的氯仿溶液1.55ml，超声得到均相红色色透明溶液；离心得到二氧化硅/红色量子点复合物沉淀(sqsq)，向沉淀中加入100μlotms，沉淀溶解得到均相溶液，加入7.5ml甲醇及187.5μl氨水后反应30min；离心，用7ml甲醇洗涤沉淀一次。将上述沉淀分散于16.8ml水中并加入40μl氨水，在室温下搅拌过夜，离心，将沉淀分散在6ml水中，得到水溶性的二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅/红色量子点荧光微球(otms-sqsq)；

(5)将步骤(4)得到的水溶性的二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅/红色量子点荧光微球分散于26ml乙醇溶液中，加入6.5ml水、0.98ml氨水、65μl正硅酸乙酯(teos)，室温搅拌，离心收集产物，洗涤，分散于水中，得到二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅/红色量子点/二氧化硅复合荧光微球(sqsqs)，即为量子点双发射比率荧光探针。

实施例3-6制得的量子点双发射比率荧光探针的性能及应用与实施例1和2相当，在此不再赘述。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

技术特征：

1.一种量子点双发射比率荧光探针，其特征在于，所述量子点双发射比率荧光探针以绿色量子点为核心，并包埋于巯基化介孔二氧化硅球中，然后经硅烷化处理、巯基化处理，加入红色量子点，超声组装、硅烷化处理后，得到量子点双发射比率荧光探针；所述绿色量子点为发绿色荧光的油相cdse/zns量子点；所述红色量子点为发红色荧光的油相cdse/zns量子点。

2.一种如权利要求1所述的量子点双发射比率荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在巯基化介孔二氧化硅球中加入绿色量子点的氯仿溶液，超声处理，离心得沉淀，沉淀挥发掉氯仿后，加入辛基三甲氧基硅烷混合均匀，转移至甲醇/氨水混合液中，反应后离心得到沉淀，洗涤、分散于水/氨水混合液中，搅拌均匀，离心，得到水溶性的二氧化硅/绿色量子点荧光微球；

(2)将步骤(1)得到的水溶性的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散在乙醇/水混合溶液中，加入氨水和正硅酸乙酯，搅拌均匀，离心得到硅烷化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球；

(3)将步骤(2)得到的硅烷化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散于乙醇中，加入氨水和(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，搅拌均匀，离心得沉淀，将沉淀洗涤后均匀分散于乙醇中，得到巯基化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散液；

(4)将步骤(3)得到的巯基化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球分散液离心，在沉淀中加入红色量子点的氯仿溶液，超声处理，离心；向沉淀中加入辛基三甲氧基硅烷并混合均匀，转移至甲醇/氨水混合液中，反应后离心得到沉淀，将沉淀洗涤后分散于水/氨水混合液中，搅拌均匀，离心、分散于乙醇中，得到水溶性的二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅/红色量子点荧光微球；

(5)将步骤(4)得到的水溶性的二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅/红色量子点荧光微球分散于乙醇溶液中，加入水、氨水、teos，室温搅拌，离心收集产物，洗涤，分散于水中，得到二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅/红色量子点/二氧化硅复合荧光微球，即为量子点双发射比率荧光探针。

3.根据权利要求2所述的量子点双发射比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述巯基化介孔二氧化硅球按照以下方法制得：在介孔二氧化硅球的乙醇溶液中加入氨水，(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，室温下搅拌过夜，离心收集产物，乙醇洗涤后，得到巯基化介孔二氧化硅球。

4.根据权利要求2所述的量子点双发射比率荧光探针的制备方法，其特征在于，所述介孔二氧化硅球按照以下方法制得：将三乙醇胺水溶液于75～85℃温度条件下加入十六烷基三甲基溴化铵和水杨酸钠，继续搅拌，加入硅酸四乙酯中继续反应，通过离心收集产物并用乙醇洗涤数次以除去残留的反应物，将收集的产物用盐酸/甲醇混合溶液在55～65℃下萃取以除去模板，离心收集产物，并洗涤，得到介孔二氧化硅球。

5.根据权利要求2所述的量子点双发射比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述绿色量子点与巯基化介孔二氧化硅球的质量比为(0.4～0.6)：1。

6.根据权利要求2所述的量子点双发射比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(4)中，所述甲醇/氨水混合液中氨水与甲醇的体积比为(0.02～0.03)：1。

7.根据权利要求2所述的量子点双发射比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述乙醇/水混合液中乙醇与水的体积比为(3～4.5)：1。

8.根据权利要求2所述的量子点双发射比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，以巯基化二氧化硅/绿色量子点/二氧化硅荧光微球总质量为基准，所述红色量子点与巯基化的二氧化硅/绿色量子点荧光微球的质量比为(0.04～0.06)：1。

9.根据权利要求2所述的量子点双发射比率荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，乙醇与水的体积比为(3～4.5)：1；所述氨水与乙醇和水总用量的体积比为(0.02～0.03)：1；所述teos与乙醇和水总用量的体积比为(0.002～0.003):1。

10.一种如权利要求1所述的量子点双发射比率荧光探针在可视化检测三聚氰胺中的应用，其特征在于，通过金纳米粒子与量子点双发射比率荧光探针的内滤效应，对三聚氰胺进行快速可视化检测。

技术总结

本发明涉及比率荧光探针技术领域，为解决传统量子点比率荧光探针荧光比率调控准确度差的问题，提供了一种量子点双发射比率荧光探针及其制备方法、应用，所述量子点双发射比率荧光探针以绿色量子点为核心，并包埋于巯基化介孔二氧化硅球中，然后经硅烷化处理、巯基化处理，加入红色量子点，超声组装、硅烷化处理后，得到量子点双发射比率荧光探针。本发明的量子点双发射比率荧光探针粒径均一、荧光比率可调、性能稳定；制备方法简单高效，在有机相中对量子点直接组装，无需对量子点表面进行任何改性和修饰，组装效率高，避免了复杂繁琐的量子点相转移等前处理，有利于量子产率的保持。

技术研发人员：汪晶;刘馨月;黄亮;胡军

受保护的技术使用者：浙江工业大学

技术研发日：.09.20

技术公布日：.02.11

如果觉得《一种量子点双发射比率荧光探针及其制备方法 应用与流程》对你有帮助，请点赞、收藏，并留下你的观点哦！