技术领域：
本发明属于金属有机骨架复合材料和比率荧光探针的制备技术领域，具体涉及一种基于银纳米簇/黑磷量子点双掺杂金属有机骨架复合物的比率荧光黄岑苷探针的制备方法，其制备的探针可用于黄岑苷的高灵敏和选择性定量检测。
背景技术：
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黄芩苷是从植物黄芩的干燥根茎中提取分离出来的一种黄酮类化合物。黄岑苷具有显著的生物活性，具有抑菌、抗炎、降胆固醇、抗血栓形成、缓解哮喘、泻火解毒、止血、解痉等作用。黄岑苷是一种哺乳动物肝脏涎酶的特异性抑制剂，具有调节某些疾病的作用，也具有较强的抗癌反应生理效能。黄岑苷对人体也存在一定的副作用，主要体现在苦寒伤胃，脾胃虚寒者不宜食用。黄岑苷毒性很低，一般剂量下不会对人体有明显的不良反应，对于特定病人可能出现胃部不适、腹泻等反应，过敏体质者可能出现大水疱样药疹。在黄岑苷注射类制剂大剂量使用时，人体会出现低热、肌肉酸痛、白细胞下降等现象。药物中非法添加过量的黄岑苷成分，会对人体造成损伤，对其进行精准检测是十分必要的。
检测黄岑苷的分析方法主要包括电化学法、色谱法等。经查阅文献后发现，sheng等制备了钴纳米颗粒掺杂的氨基化石墨烯改性的电极，用于黄岑苷的电化学检测(kaisheng,luwang,huichaoli,linazou,baoxianye.greensynthesizedconanoparticlesdopedamino-graphenemodifiedelectrodeanditsapplicationtowardsdeterminationofbaicalin.talanta,,164,249–256)；wang等采用液相色谱-质谱/质谱联用技术测定大鼠血浆中的黄岑苷(yingwang,yifanzhang,juanxiao,ranchixu,qiangliwang,xinhongwang.simultaneousdeterminationofbaicalin,baicalein,wogonoside,wogonin,scutellarin,berberine,coptisine,ginsenosiderb1andginsenosidereofbanxiaxiexindecoctioninratplasmabylc-ms/msanditsapplicationtoapharmacokineticstudy.biomedicalchromatography,,32,e4083)。截至目前，尚未检索到有关黄岑苷定量检测的国内外专利报道。
当前检测黄岑苷的分析方法主要是色谱法，但该方法普遍存在耗时较长、操作复杂、条件苛刻、成本较高等问题。相比而言，化学和生物传感器检测方法如电化学传感器，具有操作简便、灵敏度高、选择性好等优异性能。当前用于检测黄岑苷主要是电化学传感器方法，其中对黄岑苷的检测依赖单一的电化学信号输出。通常，单一信号强度易受背景、试剂、系统和环境条件等因素的干扰，引起测定结果的波动。然而，采用双重信号的比值处理来获得信号强度的比率值，可具备自校准功能，有效消除了自体和背景信号的干扰，进而提高检测结果的准确性和可靠性。
基于此，本发明报道了一种基于银纳米簇agncs/黑磷量子点bpqds双掺杂金属有机骨架mof复合物agncs/bpqds/mof的比率荧光探针，用于检测黄岑苷。在该复合物水分散液中加入过氧化氢，引起了agncs荧光淬灭，然后加入过氧化氢酶和黄岑苷，随着黄岑苷浓度的增大，提升了过氧化氢酶的活性，促进了过氧化氢酶将过氧化氢催化分解成水和氧气。换言之，黄岑苷浓度的增大促进了过氧化氢的分解，而过氧化氢分解引起了agncs荧光恢复，这些过程对bpqds的荧光影响甚微。以bpqds的荧光为参比信号，agncs的荧光为响应信号，拟合荧光发射峰强度比率ibpqds/iagncs与黄岑苷浓度之间的线性关系，构建比率荧光黄岑苷探针。迄今为止，尚未发现有关银纳米簇/黑磷量子点双掺杂的金属有机骨架复合物，以及采用比率荧光探针来检测黄岑苷的国内外文献和专利的报道。
技术实现要素：
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本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，设计一种方法简便、成本低、高灵敏和高选择性的一种基于银纳米簇/黑磷量子点双掺杂金属有机骨架复合物的比率荧光黄岑苷探针的制备方法。
为了实现上述目的，本发明涉及的一种基于银纳米簇/黑磷量子点双掺杂金属有机骨架复合物的比率荧光黄岑苷探针的制备工艺包括以下步骤：
1.双掺杂金属有机骨架复合物比率荧光黄岑苷探针制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
(1)黑磷量子点bpqds的制备：称取10mg黑磷晶体加入30ml氮甲基吡咯烷酮中，超声处理30min形成分散液，将此分散液转入微型高压反应釜中，在氮气保护下加热至140℃，连续搅拌反应12h。反应混合物在3500rpm转速下离心15min，去除尺寸较大的产物，然后在13000rpm转速下离心15min，获得沉淀物。将此沉淀物用乙醇和蒸馏水洗涤三次，真空干燥后得到bpqds，在避光和氮气下保存备用，bpqds的平均尺寸为1～5nm。
(2)银纳米簇agncs的制备：称取40mg硫辛酸粉末加入20ml蒸馏水中，搅拌均匀后加入新鲜配制浓度为2moll-1的硼氢化钠0.1ml，快速搅拌30min，形成均质混合液，在快速搅拌下向此混合液中加入浓度为0.05moll-1的硝酸银0.4ml，然后逐滴加入浓度为2moll-1的硼氢化钠0.3ml，保持快速搅拌反应90min，制得产物agncs分散液，在避光和4℃下保存备用，agncs的平均尺寸为10～20nm。
(3)银纳米簇/黑磷量子点/金属有机骨架agncs/bpqds/mof复合物的制备：称取2mgbpqds加入10ml2-甲基咪唑的乙醇溶液中，搅拌10min形成混合液，加入10ml六水合硝酸锌水溶液，搅拌30min制得棕色沉淀物，用乙醇和蒸馏水洗涤三次，在3500rpm转速下离心15min，配制bpqds/mof复合物的水分散液。向此分散液中逐滴加入5mlagncs分散液，搅拌反应2h，产物溶液经离心得到沉淀物，沉淀物经洗涤、干燥后制得agncs/bpqds/mof复合物，将其在避光、氮气保护和4℃下保存备用。其中2-甲基咪唑、六水合硝酸锌和agncs的质量浓度分别为1～5gl-1、1～10gl-1和1～10mgl-1。
(4)向agncs/bpqds/mof复合物水分散液中加入过氧化氢，搅拌均匀，用磷酸盐水缓冲液调节ph为7.4，复合物和过氧化氢的浓度分别为1～10mgml-1和10～200μm；然后加入过氧化氢酶，搅拌均匀，过氧化氢酶的浓度为5～10mul-1；再加入黄岑苷，搅拌均匀形成均质混合液，黄岑苷浓度为0.01～100μgml-1。在避光处稳定5min后，测定不同黄岑苷浓度下均质混合液的荧光发射光谱，拟合荧光发射峰强度比率ibpqds/iagncs与黄岑苷浓度之间的线性关系，构建比率荧光探针，用于黄岑苷的定量检测。黄岑苷浓度的线性检测范围为0.01～100μgml-1，检测限为1～10ngml-1。
本发明的效果是：报道了一种基于银纳米簇/黑磷量子点双掺杂的金属有机骨架agncs/bpqds/mof复合物的比率荧光探针用于定量检测黄岑苷。先将蓝荧光bpqds与mof前驱体一起反应制备bpqds/mof，再加入红荧光agncs继续反应，逐步将bpqds和agncs嵌入mof结构中。bpqds被包封在mof中，而agncs吸附在mof孔隙中。在该复合物水分散液中加入过氧化氢，引起agncs荧光淬灭，然后加入过氧化氢酶和黄岑苷，随着黄岑苷浓度的增大，提升了过氧化氢酶的活性，促进了过氧化氢酶将过氧化氢催化分解成水和氧气。换言之，黄岑苷浓度的增大促进了过氧化氢的分解，而过氧化氢分解引起agncs荧光恢复，这些过程对bpqds荧光影响甚微。以bpqds荧光为参比信号，agncs荧光为响应信号，拟合荧光发射峰强度比率ibpqds/iagncs与黄岑苷浓度之间的线性关系，构建比率荧光黄岑苷探针。与现有技术相比，本发明方法操作简便，比率荧光信号抗干扰能力强，灵敏度高和选择性好，可作为一种新颖的比率荧光探针用于黄岑苷的高灵敏和选择性检测。
附图说明：
图1为基于银纳米簇/黑磷量子点双掺杂金属有机骨架复合物的比率荧光探针的制备与黄岑苷检测的原理示意图；
图2(a)为测定不同黄岑苷浓度下该比率荧光探针体系的荧光发射光谱；
图2(b)为不同黄岑苷浓度对应荧光发射峰强度比率ibpqds/iagncs即i535/i630，拟合不同比率值与黄岑苷浓度之间的线性关系。
具体实施方式：
下面结合附图并通过具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：
本实施例涉及的基于银纳米簇/黑磷量子点双掺杂金属有机骨架复合物的比率荧光黄岑苷探针的制备方法，其制备工艺和比率荧光检测黄岑苷的原理示意图如图1所示，具体工艺步骤如下：
bpqds的制备：称取10mg黑磷晶体加入30ml氮甲基吡咯烷酮中，超声处理30min形成分散液，将此分散液转入微型高压反应釜中，在氮气保护下加热至140℃，连续搅拌反应12h。反应混合物在3500rpm转速下离心15min，去除尺寸较大的产物，然后在13000rpm转速下离心15min，获得沉淀物。将此沉淀物用乙醇和蒸馏水洗涤三次，真空干燥后得到bpqds，在避光和氮气下保存备用，bpqds的平均尺寸为2nm。
agncs的制备：称取40mg硫辛酸粉末加入20ml蒸馏水中，搅拌均匀后加入新鲜配制浓度为2moll-1的硼氢化钠0.1ml，快速搅拌30min，形成均质混合液，在快速搅拌下向此混合液中加入浓度为0.05moll-1的硝酸银0.4ml，然后逐滴加入浓度为2moll-1的硼氢化钠0.3ml，快速搅拌反应90min，制得产物agncs分散液，在避光和4℃下保存备用，agncs平均尺寸为10nm。
agncs/bpqds/mof复合物的制备：称取2mgbpqds加入10ml浓度为1gl-1的2-甲基咪唑乙醇溶液中，搅拌10min形成混合液，加入10ml浓度为2gl-1的六水合硝酸锌水溶液，搅拌30min制得棕色沉淀物，用乙醇和蒸馏水洗涤三次，在3500rpm转速下离心15min，配制bpqds/mof的水分散液。向此分散液中逐滴加入5ml浓度为2mgl-1的水agncs分散液，搅拌反应2h，产物溶液经离心得到沉淀物，沉淀物经洗涤、干燥后制得agncs/bpqds/mof复合物，将其在避光、氮气保护和4℃下保存备用。
向agncs/bpqds/mof复合物水分散液中加入过氧化氢，搅拌均匀，用磷酸盐水缓冲液调节ph为7.4，复合物和过氧化氢的浓度分别为1mgml-1和50μm；然后加入过氧化氢酶，搅拌均匀，过氧化氢酶的浓度为5mul-1；再加入黄岑苷，搅拌均匀形成均质混合液，黄岑苷浓度为0.1～50μgml-1。在避光处稳定5min后，测定不同黄岑苷浓度下均质混合液的荧光发射光谱(如图2(a)所示)，拟合荧光发射峰强度比率ibpqds/iagncs与黄岑苷浓度之间的线性关系(如图2(b)所示)，构建比率荧光探针，用于黄岑苷的定量检测。黄岑苷浓度的线性检测范围为0.1～50μgml-1，检测限为4ngml-1。
实施例2：
本实施例涉及的基于银纳米簇/黑磷量子点双掺杂金属有机骨架复合物的比率荧光黄岑苷探针的制备工艺和比率荧光检测黄岑苷的原理示意图，bpqds和agncs制备的工艺步骤同实施例1，其中bpqds平均尺寸为3nm，agncs平均尺寸为12nm。其它具体工艺步骤如下：
agncs/bpqds/mof复合物的制备：称取2mgbpqds加入10ml浓度为2gl-1的2-甲基咪唑乙醇溶液中，搅拌10min形成混合液，加入10ml浓度为3gl-1的六水合硝酸锌水溶液，搅拌30min制得棕色沉淀物，用乙醇和蒸馏水洗涤三次，在3500rpm转速下离心15min，配制bpqds/mof的水分散液。向此分散液中逐滴加入5ml浓度为3mgl-1的水agncs分散液，搅拌反应2h，产物溶液经离心得到沉淀物，沉淀物经洗涤、干燥后制得agncs/bpqds/mof复合物，将其在避光、氮气保护和4℃下保存备用。
向agncs/bpqds/mof复合物水分散液中加入过氧化氢，搅拌均匀，用磷酸盐水缓冲液调节ph为7.4，复合物和过氧化氢的浓度分别为2mgml-1和100μm；然后加入过氧化氢酶，搅拌均匀，过氧化氢酶的浓度为7mul-1；再加入黄岑苷，搅拌均匀形成均质混合液，黄岑苷浓度为0.1～100μgml-1。在避光处稳定5min后，测定不同黄岑苷浓度下均质混合液的荧光发射光谱，拟合荧光发射峰强度比率ibpqds/iagncs与黄岑苷浓度之间的线性关系，构建比率荧光探针，用于黄岑苷的定量检测。黄岑苷浓度的线性检测范围为0.1～100μgml-1，检测限为5ngml-1。
实施例3：
本实施例涉及的基于银纳米簇/黑磷量子点双掺杂金属有机骨架复合物的比率荧光黄岑苷探针的制备工艺和比率荧光检测黄岑苷的原理示意图，bpqds和agncs制备的工艺步骤同实施例1，其中bpqds平均尺寸为5nm，agncs平均尺寸为15nm。其它具体工艺步骤如下：
agncs/bpqds/mof复合物的制备：称取2mgbpqds加入10ml浓度为4gl-1的2-甲基咪唑乙醇溶液中，搅拌10min形成混合液，加入10ml浓度为5gl-1的六水合硝酸锌水溶液，搅拌30min制得棕色沉淀物，用乙醇和蒸馏水洗涤三次，在3500rpm转速下离心15min，配制bpqds/mof的水分散液。向此分散液中逐滴加入5ml浓度为8mgl-1的水agncs分散液，搅拌反应2h，产物溶液经离心得到沉淀物，沉淀物经洗涤、干燥后制得agncs/bpqds/mof复合物，将其在避光、氮气保护和4℃下保存备用。
向agncs/bpqds/mof复合物水分散液中加入过氧化氢，搅拌均匀，用磷酸盐水缓冲液调节ph为7.4，复合物和过氧化氢的浓度分别为5mgml-1和150μm；然后加入过氧化氢酶，搅拌均匀，过氧化氢酶的浓度为10mul-1；再加入黄岑苷，搅拌均匀形成均质混合液，黄岑苷浓度为0.01～50μgml-1。在避光处稳定5min后，测定不同黄岑苷浓度下均质混合液的荧光发射光谱，拟合荧光发射峰强度比率ibpqds/iagncs与黄岑苷浓度之间的线性关系，构建比率荧光探针，用于黄岑苷的定量检测。黄岑苷浓度的线性检测范围为0.01～50μgml-1，检测限为2ngml-1。
技术特征：
1.一种基于银纳米簇/黑磷量子点双掺杂金属有机骨架复合物的比率荧光黄岑苷探针的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
(1)黑磷量子点bpqds的制备：称取10mg黑磷晶体加入30ml氮甲基吡咯烷酮中，超声处理30min形成分散液，将此分散液转入微型高压反应釜中，在氮气保护下加热至140℃，连续搅拌反应12h。反应混合物在3500rpm转速下离心15min，去除尺寸较大的产物，然后在13000rpm转速下离心15min，获得沉淀物。将此沉淀物用乙醇和蒸馏水洗涤三次，真空干燥后得到bpqds，在避光和氮气下保存备用，bpqds的平均尺寸为1～5nm。
(2)银纳米簇agncs的制备：称取40mg硫辛酸粉末加入20ml蒸馏水中，搅拌均匀后加入新鲜配制浓度为2moll-1的硼氢化钠0.1ml，快速搅拌30min，形成均质混合液，在快速搅拌下向此混合液中加入浓度为0.05moll-1的硝酸银0.4ml，然后逐滴加入浓度为2moll-1的硼氢化钠0.3ml，保持快速搅拌反应90min，制得产物agncs分散液，在避光和4℃下保存备用，agncs的平均尺寸为10～20nm。
(3)银纳米簇/黑磷量子点/金属有机骨架agncs/bpqds/mof复合物的制备：称取2mgbpqds加入10ml2-甲基咪唑的乙醇溶液中，搅拌10min形成混合液，加入10ml六水合硝酸锌水溶液，搅拌30min制得棕色沉淀物，用乙醇和蒸馏水洗涤三次，在3500rpm转速下离心15min，配制bpqds/mof复合物的水分散液。向此分散液中逐滴加入5mlagncs分散液，搅拌反应2h，产物溶液经离心得到沉淀物，沉淀物经洗涤、干燥后制得agncs/bpqds/mof复合物，将其在避光、氮气保护和4℃下保存备用。其中2-甲基咪唑、六水合硝酸锌和agncs的质量浓度分别为1～5gl-1、1～10gl-1和1～10mgl-1。
(4)向agncs/bpqds/mof复合物水分散液中加入过氧化氢，搅拌均匀，用磷酸盐水缓冲液调节ph为7.4，复合物和过氧化氢的浓度分别为1～10mgml-1和10～200μm；然后加入过氧化氢酶，搅拌均匀，过氧化氢酶的浓度为5～10mul-1；再加入黄岑苷，搅拌均匀形成均质混合液，黄岑苷浓度为0.01～100μgml-1。在避光处稳定5min后，测定不同黄岑苷浓度下均质混合液的荧光发射光谱，拟合荧光发射峰强度比率ibpqds/iagncs与黄岑苷浓度之间的线性关系，构建比率荧光探针，用于黄岑苷的定量检测。黄岑苷浓度的线性检测范围为0.01～100μgml-1，检测限为1～10ngml-1。
技术总结
本发明涉及基于银纳米簇AgNCs/黑磷量子点BPQDs双掺杂金属有机骨架MOF复合物的比率荧光黄岑苷探针的制备方法。将BPQDs与MOF前驱体反应制备BPQDs/MOF，加入AgNCs反应制备AgNCs/BPQDs/MOF复合物。在复合物水分散液中加入H2O2引起AgNCs荧光淬灭。再加入过氧化氢酶和黄岑苷，随黄岑苷浓度增大，提升过氧化氢酶活性，促进过氧化氢酶将H2O2分解，引起AgNCs荧光恢复，此过程对BPQDs荧光影响甚微。以BPQDs荧光为参比，AgNCs荧光为响应信号，拟合荧光发射峰强度比率IBPQDs/IAgNCs与黄岑苷浓度之间的线性关系，构建比率荧光黄岑苷探针。
技术研发人员：桂日军;姜晓文;金辉;孙玉娇
受保护的技术使用者：青岛大学
技术研发日：.12.25
技术公布日：.02.28
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