本发明涉及一种检测乙酰胆碱酯酶活性用荧光探针材料其制备方法及应用。
背景技术：
乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，ache)具有羧肽酶和氨肽酶的活性，对动物神经传导过程起着重要的作用，它主要的生理功能是水解乙酰胆碱(atch)，生成乙酸和胆碱(tch)，将神经系统内ache含量控制在合理范围(0.1–1mm)，从而使得神经冲动传递受到阻碍，促进神经元发育和神经再生。据文献报道，如果体内atch含量低于正常水平，会更容易罹患阿尔茨海默症(ad)。ache对于神经系统的重大意义使得对其的研究成为当下热点问题。ache抑制剂能够透过血脑屏障，通过影响ache的活性来调控神经系统内atch的含量。现阶段，已有大量的研究工作报道ache抑制剂在疾病治疗方面的重要作用，研究还发现ache在细胞凋亡等方面有重要影响。所以，对ache活性的检测和其抑制剂的筛选有着十分重要的意义。
目前，已有许多研究者在该领域进行了研究。迄今为止，开发出了许多用于ache活性检测的分析技术，如比色法，电化学法，以及荧光方法。其中，荧光法有着操作简单、检测灵敏等优势，在药物检测方面受到广泛的应用。有学者利用了绿色荧光蛋白来进行ache活性测定及其抑制剂的筛选。该实验设计的原理在于蛋白与cu2+之间的络合作用，能够对ache进行“开-关”形式的控制检测，因而有着较大的优势。尽管已有的文献报道为检测ache提供了新思路，但也有着一定的局限性，例如实验步骤复杂，检测限较高等。
技术实现要素：
本发明目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种检测乙酰胆碱酯酶活性的荧光探针材料。该材料以苝二酰亚胺为底物的高灵敏荧光探针，利用该荧光探针检测乙酰胆碱酯酶的活性，并对乙酰胆碱酯酶的抑制剂进行筛选。
本发明的目的之二在于提供该探针材料的制备方法。
本发明的目的之三在于提供该探针材料在检测乙酰胆碱酯酶活性中的应用。
为达到上述目的，本发明采用如下反应机理：
根据上述反应机理，本发明采用如下技术方案：
一种检测乙酰胆碱酯酶活性用荧光探针材料，其特征在于该探针材料的结构式为：
其中：r为羟基或羧基。
一种检测乙酰胆碱酯酶活性用荧光探针材料，其特征在于该探针材料的结构式为：
其中：r为羟基或羧基。
一种制备上述的检测乙酰胆碱酯酶活性用荧光探针，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.将苝二酐、氨基酸按1:1～1:4的摩尔比溶解在咪唑中，惰性气氛保护下，加热至150～180℃，反应6～10小时；将产物溶解在热水中，通过离心、水洗、乙醇洗涤后，得到产物苝二酰亚胺(pasp)；所述的苝二酐的结构式为：
b.将步骤a所得pasp溶解在弱碱性的4-羟乙基哌嗪乙磺酸hepes缓冲液中，pasp和cucl2按1:2～1:10的摩尔比加入cucl2溶液，避光反应12～24小时，得到pasp-cu荧光探针材料。
一种上述测乙酰胆碱酯酶活性用荧光探针材料在检测乙酰胆碱酯酶活性中的应用。
一种上述测乙酰胆碱酯酶活性用荧光探针材料在乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选中的应用。
本发明的原理：atch是一种胆碱类似物，它能够被ache水解生成tch。tch分子自身的巯基和cu2+间有着强作用力从而互相结合，形成tch-cu复合物，pasp荧光小分子被释放出来，荧光恢复。当体系中加入ache及其抑制剂时，ache的活性被抑制，不能催化水解atch，体系中没有tch生成，所以cu2+不能与硫代胆碱反应生成tch-cu复合物，pasp的荧光不能恢复。利用该机理，我们设计了乙酰胆碱酯酶活性检测的荧光探针，以及利用探针进行筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法。
本发明的荧光探针通过对巯基类化合物响应产生荧光检测乙酰胆碱酯酶的活性，同时，通过荧光变化来筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂。其优点在于对巯基具有较高的选择性和灵敏度，操作简便，成本低，并且可以重复利用。该类化合物作为荧光探针可应用于疾病诊断及农残检测等领域。
附图说明
图1为按照实施例1得到的荧光探针对乙酰胆碱酯酶活性检测的荧光光谱图；
图2为按照实施例2得到的荧光探针对乙酰胆碱酯酶抑制剂他克林响应的荧光光谱图；其中a是荧光探针对他克林的荧光响应图谱，b是荧光探针的荧光强度随他克林浓度增加而减小的荧光光谱图。
图3为按照实施例3得到的荧光探针对乙酰胆碱酯酶抑制剂有机磷农药二嗪磷响应的荧光光谱图。
具体实施方式
实施例1
(1)称取苝二酐(ptcd，196.4mg，0.50mmol)、天门冬氨酸(asp，136.7mg，1mmol)、咪唑(2.0g)与100ml单口圆底烧瓶中，在n2保护下搅拌、加热至150-180℃，回流反应6-10h，得到深红色溶液。反应液冷却至室温，液体凝固，向反应器中加入50ml热水，产物溶解在热水中，离心，除去不溶性杂质；用hcl(120ml，1-2m)酸化水溶液，得到红色沉淀，离心、水洗、乙醇洗两次，得到红色沉淀，80℃真空干燥，得到红色粗产品。将粗产品溶解在25mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，滴加1-2mhcl至ph＝1(溶液接近无色，红色沉淀量最大)，离心；将沉淀溶解在koh水溶液中，逐滴加入1-2mhcl至ph＝1，离心、水洗、乙醇洗两次，80℃真空干燥。粗产物重复koh溶解，1-2mhcl酸化操作2-3次，得到红色产物pasp。
(2)称取一定量的pasp(加入少量naoh溶解)，用ph＝7.2的hepes的缓冲溶液配制成10mm的原液，在逐级稀释为10μm的样品。金属盐，阴离子和硫代乙酰胆碱的储备浓度0.010m。乙酰胆碱酯酶储备浓度2000mu/ml，所有测试均在1mlhepes缓冲溶液(50mm，ph7.2)中进行。将pasp和cu2+(10μm-100μm)的工作液避光放置12h以上，使金属和配体完全络合。
(3)取20μl0.010m的atch和一定浓度梯度的ache加入hepes缓冲溶液中。之后迅速加入到放置了12h后的pasp-cu工作液中，进行不同时间的荧光追踪测量。从图1可以观察到，pasp-cu体系中加入ache和atch之后(紫色线)，荧光恢复，其原理在于ache有活性可以催化水解atch生成tch，tch自身所带的巯基和cu2+间有着强作用力从而互相结合，形成tch-cu复合物，当形成tch-cu复合物后，pasp的荧光信号就被释放出来，因此体系的荧光强度增强。
实施例2
取20μl0.010m的硫代乙酰胆碱，15μl2000mu/ml的乙酰胆碱酯酶和不同浓度的他克林(tacrine)药物加入到配好hepes缓冲溶液中。在37℃下水浴反应30-60min，然后加入到放置了12h后的pasp-cu工作液中，最后进行荧光测量。所有实验测试的总体积均为1ml。
由图2可知，在没有他克林存在时，体系的荧光强度最强，说明没有抑制剂存在时，ache具有很高的活性，生成的tch竞争出pasp-cu中的cu2+，释放出pasp小分子，体系的荧光处于最大强度。当体系中加入不同浓度的他克林(0-5μm)时，体系荧光逐渐被淬灭，这充分说明他克林对ache的活性的影响。
实施例3
取20μl0.010m的硫代乙酰胆碱，15μl2000mu/ml的乙酰胆碱酯酶和不同浓度的二嗪磷有机农药加入到配好的hepes缓冲溶液中。在37℃下水浴反应30-60min，然后加入到放置了12h后的pasp-cu工作液中，最后进行荧光测量。所有实验测试的总体积均为1ml。
由图3可知，随着二嗪磷浓度的增大，体系的荧光逐渐减弱。这也说明我们的体系能够快速灵敏的检测有机磷农药。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：
1.一种检测乙酰胆碱酯酶活性用荧光探针材料，其特征在于该探针材料的结构式为：
其中：r为羟基或羧基。
2.一种制备根据权利要求1所述的检测乙酰胆碱酯酶活性用荧光探针，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.将苝二酐、氨基酸按1:1～1:4的摩尔比溶解在咪唑中，惰性气氛保护下，加热至150～180℃，反应6～10小时；将产物溶解在热水中，通过离心、水洗、乙醇洗涤后，得到产物苝二酰亚胺(pasp)；所述的苝二酐的结构式为：
b.将步骤a所得pasp溶解在弱碱性的4-羟乙基哌嗪乙磺酸hepes缓冲液中，pasp和cucl2按1:2～1:10的摩尔比加入cucl2溶液，避光反应12～24小时，得到pasp-cu荧光探针材料。
3.一种根据权利要求1所述测乙酰胆碱酯酶活性用荧光探针材料在检测乙酰胆碱酯酶活性中的应用。
4.一种根据权利要求1所述测乙酰胆碱酯酶活性用荧光探针材料在乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选中的应用。
技术总结
本发明涉及一种检测乙酰胆碱酯酶活性用的荧光探针及其制备方法和应用。该探针材料的结构式为：其中：R为羟基或羧基。本发明通过对巯基类化合物响应产生荧光检测乙酰胆碱酯酶的活性，同时，通过荧光变化来筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂。其优点在于对巯基具有较高的选择性和灵敏度，操作简便，成本低，并且可以重复利用。该类化合物作为荧光探针可应用于疾病诊断及农残检测等领域。
技术研发人员：陈莹莹;刘文霞;张斌斌;邢菲菲;冯凌燕
受保护的技术使用者：上海大学
技术研发日：.09.23
技术公布日：.02.28
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