本发明涉及荧光探针技术领域，特别涉及一种荧光探针及其制备方法和在可逆检测活体内亚硫酸氢盐/过氧化氢中的应用。
背景技术：
活性氧物种(ros)和活性硫物种(rss)在人体内的生理和病理过程中发挥着重要的作用。亚硫酸氢盐(hso3–)是一种重要的活性硫物种，也是一种食物添加剂，经常用于食品或酒水中来阻止氧化、褐变、细菌发酵等过程，在制药和造纸工业中也有大量应用。另外，亚硫酸氢盐作为气体信号分子二氧化硫在体内的主要存在形式，具有抗氧化、调节心血管结构和功能等重要的生理学作用。过量摄入亚硫酸氢盐易引起哮喘和过敏反应；生物体内源性亚硫酸氢盐水平的异常与呼吸和心血管疾病、肺癌和许多神经疾病的发病密切相关。过氧化氢(h2o2)是生命体系中一种主要的活性氧物种，它作为第二信使在细胞信号转导中起着重要作用。生物体内适量水平的过氧化氢在多种正常的生理过程中都起着相当重要的作用。然而，过量产生的过氧化氢会导致氧化损伤的积累，从而引起衰老、癌症、心血管疾病和阿尔兹海默病等一系列的疾病。
基于荧光探针的荧光成像技术具有简单易行、便于操作、灵敏度高、选择性好等优点。同时还可以借助于激光共聚焦成像技术实现细胞内目标物的“可视化”，从而实现对细胞内目标物的“实时在线”检测。然而生物体内的活性氧物种和活性硫物种不是孤立存在的，两者共同调控着体内的氧化还原平衡。因此，实时在线监测生物体内亚硫酸氢盐和过氧化氢水平的变化，对于深入了解生命体氧化还原平衡调控的机制具有重要意义。
目前报道的荧光分子探针，一种探针通常仅能识别亚硫酸氢盐或过氧化氢单一目标物，而不能同时监测生物体内亚硫酸氢盐和过氧化氢调控的氧化还原平衡。虽已有少量探针应用于活体细胞水平亚硫酸氢盐和过氧化氢的可逆检测，但可逆检测活体内亚硫酸氢盐和过氧化氢的荧光探针还未见报道。因此，研发一种高特异性荧光探针，用于检测生物体内，尤其是活体内由亚硫酸氢盐和过氧化氢调控的氧化还原平衡态，具有重要的应用价值。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种荧光探针及其制备方法和在可逆检测活体内亚硫酸氢盐/过氧化氢中的应用。本发明提供的荧光探针可实现可逆检测活体内由亚硫酸氢盐(hso3–)和过氧化氢(h2o2)调控的氧化还原平衡，填补了现有荧光探针应用的空白。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种荧光探针，所述荧光探针具有式1所示结构：
式1中，r为-ch3、-ch2ch3、-ch2ch2ch3、-ch2ch2ch2oh或
本发明提供了以上方案所述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
将原料ⅰ和原料ⅱ在哌啶的催化作用下进行亲核加成-消除反应，得到具有式1所示结构的荧光探针；
所述原料ⅰ和原料ⅱ的结构分别如式2和式3所示：
式3中，r为-ch3、-ch2ch3、-ch2ch2ch3、-ch2ch2ch2oh或
优选地，所述原料ⅰ和原料ⅱ的摩尔比为1:1。
优选地，所述亲核加成-消除反应的溶剂为甲醇。
优选地，所述亲核加成-消除反应的温度为65～70℃，时间为6～10h。
优选地，所述亲核加成-消除反应后，还包括对所得反应液进行后处理；所述后处理包括以下步骤：
将所得反应液进行减压蒸馏，得到粗产物；
将所述粗产物进行色谱硅胶柱提纯，得到具有式1所示结构的荧光探针。
优选地，所述色谱硅胶柱提纯使用的展开剂为二氯甲烷和乙酸乙酯的混合物；所述混合物中二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为20:1。
本发明提供了以上方案所述的荧光探针在非治疗目的的可逆检测由亚硫酸氢盐和过氧化氢调控的氧化还原平衡中的应用。
优选地，所述应用包括可逆检测活体内由亚硫酸氢盐和过氧化氢调控的氧化还原平衡。
本发明提供了一种荧光探针，具有式1所示结构。本发明提供的荧光探针具有近红外荧光发射、专一性强、灵敏度高、适用于生理ph、细胞毒性低的优点，能够可逆检测由亚硫酸氢盐(hso3–)和过氧化氢(h2o2)调控的氧化还原平衡，特别是实现了可逆检测活体内由亚硫酸氢盐(hso3–)和过氧化氢(h2o2)调控的氧化还原平衡，填补了现有荧光探针应用的空白。
本发明提供了所述荧光探针的制备方法，本发明提供的制备方法过程简单，条件易控，易于实现规模化生产。
附图说明
图1为实施例1中荧光探针与亚硫酸氢盐和竞争物种作用后的吸收光谱及颜色变化图，图1中(a)是荧光探针与亚硫酸氢盐作用后吸收光谱及颜色的变化图，图1中(b)是荧光探针和竞争物种作用后吸收光谱及颜色的变化图；
图2为实施例1中荧光探针与亚硫酸氢盐和竞争物种作用后的发射光谱变化图，图2中(a)是荧光探针与亚硫酸氢盐作用后发射光谱的变化图，图2中(b)是荧光探针和竞争物种作用后发射光谱变化图；
图3为实施例1中荧光探针与亚硫酸氢盐反应后的产物进一步识别过氧化氢和竞争物种的吸收光谱及颜色变化图，图3中(a)是荧光探针与亚硫酸氢盐反应后的产物进一步识别过氧化氢的吸收光谱及颜色变化图，图3中(b)是荧光探针与亚硫酸盐反应后的产物进一步和竞争物种作用后的吸收光谱及颜色变化图；
图4为实施例1中荧光探针与亚硫酸氢盐反应后的产物进一步识别过氧化氢和竞争物种的发射光谱变化图，图4中(a)是荧光探针与亚硫酸氢盐反应后的产物进一步识别过氧化氢的发射光谱变化图，图4中(b)是荧光探针与亚硫酸氢盐反应后的产物进一步和竞争物种作用后的发射光谱变化图；
图5为实施例1中荧光探针依次与不同浓度的亚硫酸氢盐和过氧化氢反应的动力学曲线，图5中(a)是荧光探针与不同浓度的亚硫酸氢盐反应的动力学曲线图，图5中(b)是荧光探针与亚硫酸氢盐反应后再进一步与不同浓度h2o2反应的动力学曲线图；
图6为ph对实施例1中荧光探针识别性能的影响曲线图；
图7为实施例1中荧光探针识别亚硫酸氢盐和过氧化氢的可逆変化曲线图；
图8为实施例1中荧光探针识别斑马鱼体内亚硫酸氢盐的荧光成像图及量化图，图8中(a)为荧光成像图，其中(a)表示空白斑马鱼的荧光成像图，(b)表示斑马鱼吞噬探针后的荧光成像图，(c)表示斑马鱼吞噬探针后再吞噬亚硫酸氢盐后的荧光成像图，(d)表示斑马鱼进一步吞噬过氧化氢的荧光成像图；图8中(b)为量化图，表示图8(a)中(a)～(d)阶段的荧光强度；
图9为实施例1中荧光探针识别裸鼠体内亚硫酸氢盐的荧光成像图及量化图，图9中(a)为荧光成像图，其中(a)表示空白裸鼠的荧光成像图，(b)表示小鼠左后腿皮下注射荧光探针后的荧光成像图，(c)～(e)表示小鼠皮下注射荧光探针，再原位注射亚硫酸氢盐(400μm)在1min、2min和5min后的荧光成像图，(f)～(h)表示(e)阶段的小鼠继续皮下注射过氧化氢(400μm)在5min、10min和15min后的荧光成像图；图9(b)为量化图，表示图9(a)中(a)～(h)阶段的荧光强度。
具体实施方式
本发明提供了一种荧光探针，所述荧光探针具有式1所示结构：
式1中，r为-ch3、-ch2ch3、-ch2ch2ch3、-ch2ch2ch2oh或
本发明提供的荧光探针为蓝紫色固体有机化合物，为阳离子型化合物，可溶于水及dmso等溶剂。
本发明提供了以上方案所述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
将原料ⅰ和原料ⅱ在哌啶的催化作用下进行亲核加成-消除反应，得到具有式1所示结构的的荧光探针；
所述原料ⅰ和原料ⅱ的结构分别如式2和式3所示：
式3中，r为-ch3、-ch2ch3、-ch2ch2ch3、-ch2ch2ch2oh或
在本发明中，所述原料ⅰ和原料ⅱ的摩尔比优选为1:1；本发明对所述原料ⅰ和原料ⅱ的来源没有特别的要求，采用本领域熟知的市售产品或采用本领域熟知的制备方法自行制备得到均可。在本发明中，所述亲核加成-消除反应的溶剂优选为甲醇；所述甲醇优选为无水甲醇；本发明对所述甲醇的加入量没有特别的要求，能够将所述原料ⅰ和原料ⅱ溶解即可。在本发明中，所述亲核加成-消除反应的温度优选为65～70℃，更优选为66～68℃，时间优选为6～10h，更优选为8～9h。在本发明中，上述各原料的加入顺序优选为：先将原料ⅰ和原料ⅱ溶于甲醇，然后向其中滴加哌啶；再将所得混合溶液加热至所需温度进行亲核加成-消除反应。在本发明中，所述亲核加成-消除反应的反应式如式a所示：
亲核加成-消除反应后，本发明优选对所得反应液进行后处理；所述后处理优选包括以下步骤：将所得反应液进行减压蒸馏，得到粗产物；将所述粗产物进行色谱硅胶柱提纯，得到具有式1所示结构的荧光探针。本发明通过减压蒸馏除去所得反应液中的溶剂；本发明对所述减压蒸馏没有特别的要求，采用本领域熟知的方法能够将溶剂充分去除即可。在本发明中，所述色谱硅胶柱提纯使用的展开剂优选为二氯甲烷和乙酸乙酯的混合物；所述混合物中二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比优选为20:1；通过所述色谱硅胶柱提纯，得到纯净的式1所示结构的荧光探针。
本发明提供的所述荧光探针的制备方法过程简单，条件易控，易于实现规模化生产。
本发明提供了以上方案所述的荧光探针在非治疗目的的可逆检测由亚硫酸氢盐和过氧化氢调控的氧化还原平衡中的应用，所述应用优选包括可逆检测活体内由亚硫酸氢盐和过氧化氢调控的氧化还原平衡。在应用时，本发明优选先将所述荧光探针配制成hepes缓冲溶液，具体操作优选包括以下步骤：将所述荧光探针溶于dmso(二甲基亚砜)，得到荧光探针溶液；再向所述荧光探针溶液中加入水和hepes，得到所述hepes缓冲溶液。在本发明中，荧光探针在dmso中溶解度较好，且二甲基亚砜的毒性较低，因此优选采用dmso溶解荧光探针制得荧光探针溶液。在本发明中，所述荧光探针溶液中荧光探针的浓度优选为0.5mmol/l；所述dmso和水的体积比优选为3:7所述hepes缓冲溶液中hepes的浓度优选为20mmol/l；所述hepes缓冲溶液的ph优选为7.4。在本发明中，所述hepes缓冲溶液优选现配现用。
在本发明中，在所述荧光探针hepes缓冲溶液中加入hso3–后，荧光探针的吸收峰和发射峰会逐渐减弱并达到平衡；继续加入h2o2后，探针的吸收峰和发射峰都得以恢复。因此，本发明提供的荧光探针能够可逆检测由亚硫酸氢盐(hso3–)和过氧化氢(h2o2)调控的氧化还原平衡，机理如式b所示(xc表示探针)：
本发明提供的荧光探针具有近红外荧光发射、专一性强、灵敏度高、适用于生理ph、细胞毒性低的优点，能够可逆检测由亚硫酸氢盐(hso3–)和过氧化氢(h2o2)调控的氧化还原平衡。本发明在实施例中以斑马鱼和裸鼠为动物模型，证明了所述荧光探针可用于可逆检测活体内由亚硫酸氢盐(hso3–)和过氧化氢(h2o2)调控的氧化还原平衡，即本发明提供的荧光探针实现了可逆检测活体内由亚硫酸氢盐(hso3–)和过氧化氢(h2o2)调控的氧化还原平衡，填补了现有荧光探针应用的空白，在生物医学等领域具有重要的应用价值。
下面结合实施例对本发明提供的荧光探针及其制备方法和在可逆检测活体内亚硫酸氢盐/过氧化氢中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)荧光探针的合成
将式2和式3所示的两种原料各1mol(式3中，r＝-ch2ch3)溶于20ml干燥甲醇中，然后加入2滴哌啶催化反应。混合物回流加热反应10小时，停止反应，减压蒸除有机溶剂。粗产物经色谱硅胶柱提纯(展开剂：二氯甲烷/乙酸乙酯v/v，20:1)，得蓝紫色目标产物，产率31％。所得产物的表征数据如下：
1hnmr(dmso-d6,600mhz),δ(ppm)8.49(s,1h),8.38(s,1h),8.25(s,1h),8.23(d,j＝7.38hz,1h),7.80(t,j＝9.96hz,2h),7.72(d,j＝8.16hz,1h),7.65(d,j＝8.16hz,1h),7.52(t,j＝6.9hz,1h),7.36(d,j＝8.52hz,1h),7.28(t,j＝6.84hz,1h),7.21(s,1h),4.46(d,j＝6.54hz,2h),3.69(m,4h),3.09(m,2h),2.85(m,2h),1.90(m,2h),1.28(t,j＝6.54hz,12h).
13cnmr(dmso-d6,150hz),δ(ppm)163.6,158.8,156.0,140.8,140.6,138.9,132.2,130.0,127.1,126.8,125.6,124.6,123.5,123.2,122.6,121.2,118.7,118.3,110.2,110.1,95.8,45.9,37.7,31.8,29.3,27.0,22.6,21.6,14.3,13.0.
hrms-api(positivemode,m/z)for[探针]+:calcd461.2587,found:461.2586.
mp:234.6-235.2℃。
由以上表征数据可以得出，所得蓝紫色目标产物符合式1(r＝-ch2ch3)所示结构，成功制备出荧光探针。
(2)对所得荧光探针的性能进行测试
制备荧光探针hepes缓冲溶液：将荧光探针溶于二甲基亚砜(dmso)中，制成浓度为0.5mm的溶液。在进行光谱和生物测试时，将探针稀释至所需浓度的hepes缓冲溶液(dmso:h2o(v:v)＝3:7，20mm(hepes)，ph＝7.4)现配现用。
(2.1)荧光探针识别亚硫酸氢盐(hso3–)的紫外-可见光谱响应
图1(a)是荧光探针与亚硫酸氢盐作用后吸收光谱及颜色的变化图，图1(a)中试管(ⅰ)内为荧光探针hepes缓冲溶液，试管(ⅱ)内为加入hso3–后的荧光探针hepes缓冲溶液。由图1(a)可以看出，在hepes缓冲溶液中(ph7.4)，探针的最大吸收峰在605nm处，加入hso3–(0～40μm)后该吸收峰逐渐减弱并达到平衡；同时，溶液的颜色由蓝色变为无色。
图1(b)是荧光探针和竞争物种作用后吸收光谱及颜色的变化图，图1(b)中试管(1)内为荧光探针hepes缓冲溶液(空白探针)，试管(2)内为加入hso3–后的荧光探针hepes缓冲溶液，记为“xc+hso3–”，试管(3)～(25)内为加入其它竞争物种后的荧光探针hepes缓冲溶液，记为“xc+competitiveanalytes”，对应的竞争物种分别为br–，cl–，f–，s2–，hso4–，no2–，no3–，p2o74–，po43–，so32–，so42–，hco3–，aco–，pi(磷酸根)，ppi(焦磷酸根)，1o2，·oh，onoo–，h2o2，hocl，cys，hcy，gsh。由图1(b)可以看出，在荧光探针hepes缓冲溶液中加入其它竞争物种如阴离子(br–，cl–，f–，s2–，hso4–，no2–，no3–，p2o74–，po43–，so32–，so42–，hco3–，aco–，pi，ppi)、活性氧物种(1o2，·oh，onoo–，h2o2，hocl)以及生物小分子(cys，hcy，gsh)后，对荧光探针的吸收峰未有干扰，同时溶液的颜色也未发生变化，说明该荧光探针专一性强。
(2.2)荧光探针识别亚硫酸氢盐(hso3–)的荧光光谱响应
图2(a)是荧光探针与亚硫酸氢盐作用后发射光谱的变化图。在hepes缓冲溶液中(ph7.4)，用605nm处的光激发，探针的最大发射峰在684nm；加入hso3–(0～40μm)后该发射峰逐渐减弱并达到平衡。探针对hso3–的检出限为1.0μm。
图2(b)是荧光探针和竞争物种作用后发射光谱变化图，图2(b)中的竞争物种与图1(b)相同。由图2(b)可以看出其他竞争物种对荧光探针未有干扰。
(2.3)荧光探针进一步识别过氧化氢(h2o2)的光谱响应
图3(a)是荧光探针与亚硫酸氢盐反应后的产物进一步识别过氧化氢的吸收光谱及颜色变化图，图3(a)中试管(ⅰ)内为荧光探针与hso3–反应后的hepes缓冲溶液，试管(ⅱ)内为荧光探针与hso3–反应后的hepes缓冲溶液中再加入过氧化氢后的溶液。由图3(a)可看出，向荧光探针与hso3–反应后的hepes缓冲溶液中(ph7.4)继续加入h2o2(0～50μm)后，荧光探针的吸收峰得以恢复，同时溶液的颜色由无色变为蓝色。图3(b)是荧光探针与亚硫酸盐反应后的产物进一步和竞争物种作用后的吸收光谱及颜色变化图，图3(b)中试管(1)内为荧光探针与hso3–反应后的hepes缓冲溶液，试管(2)内为荧光探针与hso3–反应后的hepes缓冲溶液中再加入过氧化氢后的溶液，试管(3)～(6)内为荧光探针与hso3–反应后的hepes缓冲溶液中再加入竞争物种后的溶液，对应的竞争物种分别为1o2，onoo-，hocl，·oh。由图3(b)可以看出，这些竞争物种对荧光探针未有干扰；此外，还以此方法测试了竞争物种zn2+，ni2+，al3+，cr3+，ca2+，mg2+，ba2+，li+，k+，fe3+，co2+，cd2+，pb2+和na+，同样对荧光探针未有干扰，说明该荧光探针专一性强。
图4(a)是荧光探针与亚硫酸氢盐反应后的产物进一步识别过氧化氢的发射光谱变化图。由图4(a)可看出，向荧光探针与hso3–反应后的hepes缓冲溶液中(ph7.4)继续加入h2o2(0～50μm)后，荧光探针的发射峰也得以恢复。图4(b)是荧光探针与亚硫酸氢盐反应后的产物进一步和竞争物种作用后的发射光谱变化图，图4(b)中的竞争物种与图3(b)相同。由图4(b)可以看出其他竞争物种对荧光探针未有干扰。
(2.4)荧光探针的动力学性能及ph影响情况
图5(a)是荧光探针与不同浓度的亚硫酸氢盐反应的动力学曲线图，图5(b)是荧光探针与亚硫酸氢盐反应后进一步与不同浓度h2o2反应的动力学曲线图。从图5(a)和图5(b)可以看出，探针具有较快的响应时间，加入hso3–后，探针的荧光光谱在5s内达平衡；在h2o2加入后，探针的发射光谱在15min内达到平衡。
图6为ph对荧光探针识别性能的影响曲线图。从图6可以看出，探针在ph4.5～11.0的范围内对hso3–/h2o2具有良好的响应，表明该探针适用于生理ph条件。
(2.5)荧光探针可逆检测hso3–/h2o2平衡
图7为荧光探针识别亚硫酸氢盐和过氧化氢的可逆変化曲线图，通过检测探针交替加入hso3–/h2o2后684nm处的发射光谱强度，表明探针具有良好的可逆性，至少可重复7次。
(2.6)荧光探针可逆检测活体内的hso3–/h2o2平衡
以成年斑马鱼为活体模型，将含有探针(0.4mm)的培养液加入水中，斑马鱼通过吞噬摄入体内，通过荧光成像检测斑马鱼体内的荧光信号；然后再向水溶液中依次加入hso3–(2mm)和h2o2(2mm)，再分别通过荧光成像检测荧光信号的变化；以未摄入探针的成年斑马鱼作为空白对照。图8为荧光探针识别斑马鱼体内亚硫酸氢盐的荧光成像图及量化图，图8中(a)为荧光成像图，其中(a)表示空白斑马鱼的荧光成像图，(b)表示斑马鱼吞噬探针后的荧光成像图，(c)表示斑马鱼吞噬探针后再吞噬亚硫酸氢盐后的荧光成像图，(d)表示斑马鱼进一步吞噬过氧化氢的荧光成像图；图8中(b)为量化图，表示图8(a)中(a)～(d)阶段的荧光强度。图8表明该探针实现了可逆检测活体内的hso3–/h2o2平衡。
进一步以裸鼠为活体模型，验证探针能够可逆检测活体内的hso3–和h2o2。图9为荧光探针识别裸鼠体内亚硫酸氢盐的荧光成像图及量化图，图9中(a)为荧光成像图，其中(a)表示空白裸鼠的荧光成像图，(b)表示小鼠左后腿皮下注射荧光探针后的荧光成像图，(c)～(e)表示小鼠皮下注射荧光探针，再原位注射亚硫酸氢盐(400μm)在1min、2min、和5min后的荧光成像图，(f)～(h)表示(e)阶段的小鼠继续皮下注射过氧化氢(400μm)在5min、10min和15min后的荧光成像图；图9(b)为量化图，表示图9(a)中(a)～(h)阶段的荧光强度。图9进一步验证了该探针能够可逆检测活体内的hso3–和h2o2。
实施例2
将式2和式3所示的两种原料各1mol(式3中，r＝-ch3)溶于20ml干燥甲醇中，然后加入2滴哌啶催化反应。混合物回流加热反应6小时，停止反应，减压蒸除有机溶剂。粗产物经色谱硅胶柱提纯(展开剂：二氯甲烷/乙酸乙酯v/v，20:1)，得蓝紫色目标产物，蓝紫色目标产物符合式1(r＝-ch3)所示结构，成功制备出荧光探针。
实施例3
将式2和式3所示的两种原料各1mol(式3中，r＝-ch2ch2ch3)溶于20ml干燥甲醇中，然后加入2滴哌啶催化反应。混合物回流加热反应6小时，停止反应，减压蒸除有机溶剂。粗产物经色谱硅胶柱提纯(展开剂：二氯甲烷/乙酸乙酯v/v，20:1)，得蓝紫色目标产物，蓝紫色目标产物符合式1(r＝-ch2ch2ch3)所示结构，成功制备出荧光探针。
实施例4
将式2和式3所示的两种原料各1mol(式3中，r＝-ch2ch2ch2oh)溶于20ml干燥甲醇中，然后加入2滴哌啶催化反应。混合物回流加热反应6小时，停止反应，减压蒸除有机溶剂。粗产物经色谱硅胶柱提纯(展开剂：二氯甲烷/乙酸乙酯v/v，20:1)，得蓝紫色目标产物，蓝紫色目标产物符合式1(r＝-ch2ch2ch2oh)所示结构，成功制备出荧光探针。
实施例5
将式2和式3所示的两种原料各1mol(式3中，
按照实施例1的方法对实施例2～5制备的荧光探针的性能进行测试，结果实施例2～5所得荧光探针具有与实施例1中荧光探针相似的特点和性能，同样实现了可逆检测活体内由亚硫酸氢盐(hso3–)和过氧化氢(h2o2)调控的氧化还原平衡。
由以上实施例可以看出，本发明提供的荧光探针具有近红外荧光发射、专一性强、灵敏度高、适用于生理ph、细胞毒性低的优点，能够可逆检测由亚硫酸氢盐(hso3–)和过氧化氢(h2o2)调控的氧化还原平衡，特别是实现了可逆检测活体内由亚硫酸氢盐(hso3–)和过氧化氢(h2o2)调控的氧化还原平衡，填补了现有荧光探针应用的空白。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
技术特征：
1.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针具有式1所示结构：
式1中，r为-ch3、-ch2ch3、-ch2ch2ch3、-ch2ch2ch2oh或
2.权利要求1所述荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将原料ⅰ和原料ⅱ在哌啶的催化作用下进行亲核加成-消除反应，得到具有式1所示结构的荧光探针；
所述原料ⅰ和原料ⅱ的结构分别如式2和式3所示：
式3中，r为-ch3、-ch2ch3、-ch2ch2ch3、-ch2ch2ch2oh或
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述原料ⅰ和原料ⅱ的摩尔比为1:1。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述亲核加成-消除反应的溶剂为甲醇。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述亲核加成-消除反应的温度为65～70℃，时间为6～10h。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述亲核加成-消除反应后，还包括对所得反应液进行后处理；所述后处理包括以下步骤：
将所得反应液进行减压蒸馏，得到粗产物；
将所述粗产物进行色谱硅胶柱提纯，得到具有式1所示结构的荧光探针。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述色谱硅胶柱提纯使用的展开剂为二氯甲烷和乙酸乙酯的混合物；所述混合物中二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为20:1。
8.权利要求1所述的荧光探针在非治疗目的的可逆检测由亚硫酸氢盐和过氧化氢调控的氧化还原平衡中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括可逆检测活体内由亚硫酸氢盐和过氧化氢调控的氧化还原平衡。
技术总结
本发明提供了一种荧光探针及其制备方法和在可逆检测活体内亚硫酸氢盐/过氧化氢中的应用，涉及荧光探针技术领域。本发明提供的荧光探针具有式1所示结构，式1中，R为‑CH3、‑CH2CH3、‑CH2CH2CH3、‑CH2CH2CH2OH或本发明提供的荧光探针具有近红外荧光发射、专一性强、灵敏度高、适用于生理pH、细胞毒性低的优点，能够可逆检测由亚硫酸氢盐和过氧化氢调控的氧化还原平衡，特别是实现了可逆检测活体内由亚硫酸氢盐和过氧化氢调控的氧化还原平衡，填补了现有荧光探针应用的空白。本发明提供了所述荧光探针的制备方法，本发明提供的制备方法过程简单，条件易控，易于实现规模化生产。
技术研发人员：贾宏敏;张志强;李绵;宋秋颖;胡文博;孟庆涛;王月;朱珮珣;周博
受保护的技术使用者：辽宁科技大学
技术研发日：.11.13
技术公布日：.02.18
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