本发明涉及一种用于检测乙酰胆碱酯酶活性的荧光探针材料及其制备方法及应用。
背景技术：
乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，ache)是生物神经传导中一种关键性酶。它具有羧肽酶和氨肽酶的活性，主要生理功能是水解乙酰胆碱(atch)，生成乙酸和胆碱(tch)，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递。研究发现，如果体内atch的含量低于正常水平，更容易罹患阿尔茨海默症，而atch的含量可以通过影响ache的活性来调控。同时，乙酰胆碱酯酶也参与细胞的发育与成熟，能促进神经元发育和神经再生。因此，对ache活性的检测和研究有着十分重要的意义。
多巴胺(da)是一种神经传导物质，调控着中枢神经系统的多种生理功能。在有氧环境中，多巴胺很容易被氧化而自发聚合为聚多巴胺。聚多巴胺(pda)是一种天然的黑色素，具有优良的吸附性能，几乎能吸附所有类型的底物。当体系中存在抗氧化剂时，多巴胺不会聚合为聚多巴胺。
利用聚多巴胺优异的吸附性能，我们将荧光染料分子吸附到pda表面，由于聚集荧光发生淬灭。ache能够水解atch产生巯基，巯基分子作为一种抗氧化剂，可以防止da聚合成pda，荧光分子无法吸附聚集，体系中的荧光不会淬灭。基于此原理，我们构建了一种荧光探针，用于快速、灵敏地检测ache的活性，此方法能够有效实现对ache的定量检测，具有检测限低、操作简单、成本低的优点。
技术实现要素：
本发明目的之一在于提供一种用于检测乙酰胆碱酯酶活性的荧光探针材料。
本发明的目的之二在于提供该探针材料的制备方法。
本发明的目的之三在于提供该探针材料，并利用聚多巴胺和该荧光探针联用来检测乙酰胆碱酯酶的活性。
为达到上述目的，本发明采用如下反应机理：
根据上述反应机理，本发明采用如下技术方案：
一种用于检测乙酰胆碱酯酶活性的荧光探针，其特征在于该荧光探针的结构式为：
其中，r1，r2，r3，r4为氢原子、氨基、甲基或乙基。
一种制备上述的用于检测乙酰胆碱酯酶活性的荧光探针的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：将苝二酐和有机胺按照1:2～1:5的摩尔比溶解在n,n-二甲基甲酰胺dmf和1,4-二氧六环混合液中，在惰性气氛保护下，加热至100-180℃，反应2～10小时，通过离心、提纯后，得到目标产物用于检测乙酰胆碱酯酶活性的荧光探针；所述的苝二酐的结构式为：
上述的用于检测乙酰胆碱酯酶活性的荧光探针材料在中的应用。
本发明的荧光探针通过对聚多巴胺的吸附与解吸附发生荧光信号的变化来检测乙酰胆碱酯酶的活性。其优点在于检测限低、操作简单、成本低。
附图说明
图1为按照实施例1得到的荧光探针与多巴胺的荧光强度随时间变化的荧光光谱图；
图2为按照实施例2得到的荧光探针对乙酰胆碱酯酶活性检测的荧光光谱图
具体实施方式
实施例1
(1)称取苝二酐(ptcd，1.0g，2.5mmol)，三(2-氨基乙基)胺(0.72g，5.6mmol)，10mldmf和10ml1,4-二氧六环混合液中加入到100ml单口圆底烧瓶中，在n2保护下搅拌、加热至120℃，回流反应4h，得到深紫色溶液。离心除去溶剂，将得到的紫色残余物溶于1mhcl溶液中。过滤除去不溶性杂质后，加入naoh将所得溶液调节至ph12。沉淀出深紫色产物，过滤分离出固体。用去离子水洗涤沉淀物并在真空下干燥，得到所需产物ptris。
(2)将1μmptris工作液与2mm的多巴胺混合，加入到tris-hcl缓冲溶液中(50mm，ph8.5)，观察荧光光谱随时间的变化曲线。
由图1可知，ptris在550nm处有很强的荧光，随着时间的增加，荧光强度逐渐变弱，到9min后几乎完全淬灭。这是因为体系中的多巴胺(da)随着时间逐渐氧化为聚多巴胺(pda)，pda将荧光探针吸附后，荧光分子聚集导致荧光淬灭。
实施例2
将1μmptris工作液、2mm多巴胺、100μm硫代乙酰胆碱(atch)和10mu/ml的乙酰胆碱酯酶，加入到tris-hcl缓冲溶液中(50mm，ph8.5)，在37℃下水浴反应40min，最后进行荧光测试。
由图2可知，只有ptris时，550nm处会出现较高的荧光峰(a)，当加入2mmpda时，体系中的荧光几乎完全淬灭(b)。当继续加入atch和ache，荧光信号恢复(d)。这是因为ache催化水解atch产生的硫代胆碱可以抑制da形成pda，荧光无法吸附聚集，影响信号恢复。而只加入atch，荧光强度是不发生变化的(c)，说明恢复的荧光信号是ache催化水解atch产生硫代胆碱所致，该荧光探针是一种有效检测乙酰胆碱酯酶活性的探针。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：
1.一种用于检测乙酰胆碱酯酶活性的荧光探针，其特征在于该荧光探针的结构式为：
其中，r1，r2，r3，r4为氢原子、氨基、甲基或乙基。
2.一种制备根据权利要求1所述的用于检测乙酰胆碱酯酶活性的荧光探针的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：将苝二酐和有机胺按照1:2～1:5的摩尔比溶解在n,n-二甲基甲酰胺dmf和1,4-二氧六环混合液中，在惰性气氛保护下，加热至100-180℃，反应2～10小时，通过离心、提纯后，得到目标产物用于检测乙酰胆碱酯酶活性的荧光探针；所述的苝二酐的结构式为：
3.根据权利要求1所述的用于检测乙酰胆碱酯酶活性的荧光探针材料在中的应用。
技术总结
本发明涉及一种用于检测乙酰胆碱酯酶活性的荧光探针，其特征在于该荧光探针的结构式为：其中，R1，R2，R3，R4为氢原子、氨基、甲基或乙基。本发明的荧光探针通过对聚多巴胺的吸附与解吸附发生荧光信号的变化来检测乙酰胆碱酯酶的活性。其优点在于检测限低、操作简单、成本低。
技术研发人员：陈莹莹;刘文霞;张斌斌;邢菲菲;冯凌燕
受保护的技术使用者：上海大学
技术研发日：.09.23
技术公布日：.02.28
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