本发明涉及皮肤保养品
技术领域：
，具体涉及一种含脐带间充质干细胞因子的精华液及其制备方法。
背景技术：
：随着生活水平的提高和科技的发展，人们在注重面部保养的同时更关注于天然健康。以往的含有防腐剂、人工色素、香精香料、矿物油等对皮肤有不良影响的化工成分的美容化妆品逐渐被含有天然原料的化妆品所替代。随着生物
技术领域：
的发展，使得含有生物活性因子的化妆品在美容界倍受青睐。间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)是一类来源于中胚层，具有自我复制能力的多潜能细胞，可在一定条件下分化成多种功能细胞。间充质干细胞来源广泛，现已从骨髓、外周血、胚胎、脂肪、脐血、脐带等组织中分离出了间充质干细胞。其中外周血、骨髓间充质干细胞培养时间长，含量少，细胞增殖分化潜能随年龄的增长而明显下降；脐血源mscs分离效率低，胚胎易污染且存在伦理等问题。而脐带组织因其取材方便，细胞数量多，感染风险小等优点，成为极有潜力的mscs来源。脐带华通胶间充质干细胞(umbilicalcordwharton’sjelly-derivedmscs，uw-mscs)是来源于脐带华通胶组织的间充质干细胞，和其他的间充质干细胞一样，脐带华通胶间充质干细胞也可以分泌多种细胞因子，比如：表皮生长因子、血管内皮生长因子和血小板源生长因子等。这些细胞因子可有效地调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞。随着生物技术的不断发展，越来越多的美容化妆品中加入了细胞因子和活性物质，不仅具有保湿美白功效，还能够修复受损皮肤、消除皮肤皱纹。目前，中国专利cn106344493a公开了一种含人间充质干细胞因子的精华液的制备方法，是经过人间充质干细胞因子冻干粉的制备、溶媒的制备和混合步骤完成含人间充质干细胞因子的精华液的制备方法，该方法的操作过程繁琐，干细胞因子的回收率较低，在97.6％以下，干细胞增殖速度较慢，制备精华液所需时间较长。中国专利cn105078777a公开了一种间充质干细胞分泌因子精华液及其制备方法和应用，所用的间充质干细胞来源于脐血，所用的培养基成分复杂，制备方法较为繁琐。针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种含脐带间充质干细胞因子的精华液及其制备方法，该方法制备的脐带间充质干细胞的增殖能力强，间充质干细胞因子的含量和回收率高，操作过程简单，节省了大量的时间。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种含脐带间充质干细胞因子的精华液及其制备方法。提高了脐带间充质干细胞的增殖能力、间充质干细胞因子的含量和回收率，有效缩短了精华液的制备时间。本发明一方面提供了一种含脐带间充质干细胞因子的精华液，所述的精华液包括：脐带间充质干细胞因子浓缩液50％(v/v)、人白蛋白1％-2.5％(w/v)、葡聚糖0.5％-2％(w/v)、透明质酸0.5％-1.4％(w/v)、海藻酸钠0.4％-1.1％(w/v)、胶原蛋白1％-2.5％(w/v)、甘油0.3％-0.9％(v/v)和儿茶素0.2％-0.5％(w/v)。优选地，所述的精华液包括：脐带间充质干细胞因子浓缩液50％(v/v)、人白蛋白1.5％-2.5％(w/v)、葡聚糖1％-2％(w/v)、透明质酸0.8％-1.4％(w/v)、海藻酸钠0.7％-1.1％(w/v)、胶原蛋白1.4％-2.5％(w/v)、甘油0.5％-0.9％(v/v)和儿茶素0.3％-0.5％(w/v)。进一步优选地，所述的精华液包括：脐带间充质干细胞因子浓缩液50％(v/v)、人白蛋白1.5％(w/v)、葡聚糖1％(w/v)、透明质酸0.8％(w/v)、海藻酸钠0.7％(w/v)、胶原蛋白1.4％(w/v)、甘油0.5％(v/v)和儿茶素0.3％(w/v)。本发明另一方面提供了一种上述精华液的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：(1)脐带间充质干细胞因子浓缩液的制备：a.脐带华通胶间充质干细胞的分离与培养：将人脐带组织用75％乙醇浸泡，组织两端各剪去1cm，剩余部分用生理盐水洗涤至澄清，剪成小段，生理盐水清洗3次，沿脐带组织静脉腔剪开，平铺后剔除静脉、动脉和羊膜，取血管之间、血管与外膜之间的胶状物，即：华通胶，将华通胶剪碎，转移至完全培养基进行原代细胞培养，培养至80％-90％融合时进行细胞传代；b.间充质干细胞传代培养：吸弃步骤a中待传代细胞的培养液，加入生理盐水洗涤组织贴壁面，加入0.25％胰酶，37℃孵育1-3min，待细胞变圆后，加终止液终止消化，快速震荡，吹打细胞，吸出细胞悬液，加入生理盐水洗涤，离心，收集沉淀，用完全培养基重悬沉淀，接种至完全培养基进行p1代培养，细胞生长至80％-90％融合时，继续进行传代培养，传代至p6代；c.脐带间充质干细胞因子浓缩液的制备：收集p2-p6代的细胞培养液，经过微滤膜、超滤膜过滤浓缩，收集截留液，得到脐带间充质干细胞因子浓缩液；所述的完全培养基包括：达优mscmb培养基80％-90％(v/v)、helios血清替代物7％-12％(v/v)、白细胞介素20.5％-2％(w/v)、柠檬酸钠0.5％-2％(w/v)和硫酸葡聚糖2％-4％(w/v)；所述的终止液包括：α-mem培养基92％-96％(v/v)、胎牛血清2％-5％(v/v)、盐酸硫胺素0.8％-1.5％(w/v)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸1.2％-1.5％(w/v)；(2)稀释液的制备：将人白蛋白、葡聚糖、透明质酸、海藻酸钠、胶原蛋白、甘油和儿茶素用无菌超纯水按比例配制，震荡5-10min均匀，得到稀释液；(3)脐带间充质干细胞因子精华液的制备：将步骤(1)得到的脐带间充质干细胞因子浓缩液和步骤(2)得到的稀释液按照体积比为1:1的比例混合，震荡5-10min均匀，得到含脐带间充质干细胞因子的精华液。优选地，所述的完全培养基包括：达优mscmb培养基86％-90％(v/v)、helios血清替代物7％-8％(v/v)、白细胞介素20.5％-1.5％(w/v)、柠檬酸钠0.5％-1.5％(w/v)和硫酸葡聚糖2％-3％(w/v)。进一步优选地，所述的完全培养基包括：达优mscmb培养基86％(v/v)、helios血清替代物8％(v/v)、白细胞介素21.5％(w/v)、柠檬酸钠1.5％(w/v)和硫酸葡聚糖3％(w/v)。优选地，所述的终止液包括：α-mem培养基92％-94％(v/v)、胎牛血清3.5％-5％(v/v)、盐酸硫胺素1.2％-1.5％(w/v)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸1.3％-1.5％(w/v)。进一步优选地，所述的终止液包括：α-mem培养基94％(v/v)、胎牛血清3.5％(v/v)、盐酸硫胺素1.2％(w/v)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸1.3％(w/v)。优选地，所述的稀释液包括：人白蛋白2％-5％(w/v)、葡聚糖1％-4％(w/v)、透明质酸1％-2.8％(w/v)、海藻酸钠0.8％-2.2％(w/v)、胶原蛋白2％-5％(w/v)、甘油0.6％-1.8％(v/v)和儿茶素0.4％-1％(w/v)。进一步优选地，所述的稀释液包括：人白蛋白3％-5％(w/v)、葡聚糖2％-4％(w/v)、透明质酸1.6％-2.8％(w/v)、海藻酸钠1.4％-2.2％(w/v)、胶原蛋白2.8％-5％(w/v)、甘油1％-1.8％(v/v)和儿茶素0.6％-1％(w/v)。更进一步优选地，所述的稀释液包括：人白蛋白3％(w/v)、葡聚糖2％(w/v)、透明质酸1.6％(w/v)、海藻酸钠1.4％(w/v)、胶原蛋白2.8％(w/v)、甘油1％(v/v)和儿茶素0.6％(w/v)。优选地，所述的原代细胞培养和传代细胞培养所用的培养条件为37℃，5％co2，湿度为95％，每隔3天更换新鲜的培养基。优选地，步骤b中所述接种的细胞密度为2-5×104/ml；进一步优选地，步骤b中所述接种的细胞密度为3×104/ml。优选地，步骤c中所述超滤膜是通过分子量为50kd和3kd的超滤膜。具体地，一种脐带间充质干细胞因子精华液的制备方法，包括如下步骤：(1)脐带间充质干细胞因子浓缩液的制备：a.脐带华通胶间充质干细胞的分离与培养：无菌取健康的人脐带组织，75％乙醇浸泡1min，将脐带组织两端各剪去1cm长度，剩余部分用生理盐水洗涤至澄清，剪成2cm的小段，生理盐水清洗3次，转移脐带组织至一新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没脐带组织1/2处，沿脐带组织静脉腔剪开，平铺后剔除1根静脉、2根动脉以及羊膜，取血管之间、血管与外膜之间的胶状物，即：华通胶，将华通胶剪碎至1mm3大小，转移至完全培养基中进行培养，将培养瓶放入37℃、5％co2培养箱中培养至80％-90％融合时进行细胞传代，每隔3天更换新鲜的培养基。b.间充质干细胞传代培养：吸弃步骤a中待传代细胞的培养液，于非细胞培养面加入10ml生理盐水，轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次，加入0.25％胰酶3ml，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育1min，待细胞变圆后加等量的终止液终止消化，快速震荡，用10ml移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml生理盐水，吹洗一次，汇入50ml离心管中，1200rpm，离心6min，弃上清，合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用完全培养基重悬，接种进行p1代培养，根据细胞数量铺瓶(t175瓶)，细胞密度为2-5×104/ml，每瓶体积为25ml，将培养瓶放入37℃、5％co2培养箱中培养至80％-90％融合时，继续进行传代培养，传代至p6代。c.脐带间充质干细胞因子浓缩液的制备：收集p2-p6代的细胞培养液，经0.22μm的滤膜过滤，然后通过分子量为50kd超滤膜进行干细胞上清液的浓缩，将浓缩液通过分子量为3kd的超滤膜，收集截留液，即为脐带间充质干细胞因子浓缩液；所述的完全培养基包括：达优mscmb培养基80％-90％(v/v)、helios血清替代物7％-12％(v/v)、白细胞介素20.5％-2％(w/v)、柠檬酸钠0.5％-2％(w/v)和硫酸葡聚糖2％-4％(w/v)；所述的终止液包括：α-mem培养基92％-95％(v/v)、胎牛血清2％-5％(v/v)、盐酸硫胺素0.8％-1.5％(w/v)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸1.2％-1.5％(w/v)。(2)稀释液的制备：将人白蛋白、葡聚糖、透明质酸、海藻酸钠、胶原蛋白、甘油和儿茶素用无菌超纯水按比例配制，放入恒温振荡器，震荡5-10min，振荡均匀，得到稀释液；(3)脐带间充质干细胞因子精华液的制备：将步骤(1)得到的脐带间充质干细胞因子浓缩液和步骤(2)得到的稀释液按照体积比为1:1的比例混合，放入恒温振荡器，震荡5-10min，振荡均匀，得到脐带间充质干细胞因子精华液。与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：本发明所提供的一种含脐带间充质干细胞因子的精华液及其制备方法，该精华液具有美白淡斑、修复皮肤、减少皱纹和延缓衰老等功效。通过优化其制备方法，显著提高了间充质干细胞因子浓缩液中间充质干细胞因子的含量和回收率，提高了脐带间充质干细胞的增殖能力，有效缩短了精华液的制备时间，可适用于规模化生产。具体实施方式以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改于本领域的专业技术人员而言是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属
技术领域：
的普通技术人员通常理解的相同意义。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所使用的各种试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。实施例1一种含脐带间充质干细胞因子的精华液，包括：脐带间充质干细胞因子浓缩液50％(v/v)、人白蛋白1％(w/v)、葡聚糖0.5％(w/v)、透明质酸0.5％(w/v)、海藻酸钠0.4％(w/v)、胶原蛋白1％(w/v)、甘油0.3％(v/v)和儿茶素0.2％(w/v)。该精华液的制备方法包括如下步骤：(1)脐带间充质干细胞因子浓缩液的制备：a.脐带华通胶间充质干细胞的分离与培养：无菌取健康的人脐带组织，75％乙醇浸泡1min，将脐带组织两端各剪去1cm长度，剩余部分用生理盐水洗涤至澄清，剪成2cm的小段，生理盐水清洗3次，转移脐带组织至一新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没脐带组织1/2处，沿脐带组织静脉腔剪开，平铺后剔除1根静脉、2根动脉以及羊膜，取血管之间、血管与外膜之间的胶状物，即：华通胶，将华通胶剪碎至1mm3大小，转移至完全培养基中进行培养，将培养瓶放入37℃、5％co2培养箱中培养至80％-90％融合时进行细胞传代，每隔3天更换新鲜的培养基。b.间充质干细胞传代培养：吸弃步骤a中待传代细胞的培养液，于非细胞培养面加入10ml生理盐水，轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次，加入0.25％胰酶3ml，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育1min，待细胞变圆后加等量的终止液终止消化，快速震荡，用10ml移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml生理盐水，吹洗一次，汇入50ml离心管中，1200rpm，离心6min，弃上清，合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用完全培养基重悬，接种进行p1代培养，根据细胞数量铺瓶(t175瓶)，细胞密度为2×104/ml，每瓶体积为25ml，将培养瓶放入37℃、5％co2培养箱中培养至80％-90％融合时，继续进行传代培养，传代至p6代。c.脐带间充质干细胞因子浓缩液的制备：收集p2-p6代的细胞培养液，经0.22μm的滤膜过滤，然后通过分子量为50kd超滤膜进行干细胞上清液的浓缩，将浓缩液通过分子量为3kd的超滤膜，收集截留液，即为脐带间充质干细胞因子浓缩液；其中，完全培养基包括：达优mscmb培养基80％(v/v)、helios血清替代物12％(v/v)、白细胞介素22％(w/v)、柠檬酸钠2％(w/v)和硫酸葡聚糖4％(w/v)；终止液包括：α-mem培养基92％％(v/v)、胎牛血清5％(v/v)、盐酸硫胺素1.5％(w/v)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸1.5％(w/v)。(2)稀释液的制备：将人白蛋白、葡聚糖、透明质酸、海藻酸钠、胶原蛋白、甘油和儿茶素用无菌超纯水按比例配制，放入恒温振荡器，震荡5min，振荡均匀，得到稀释液；稀释液包括：人白蛋白2％(w/v)、葡聚糖1％(w/v)、透明质酸1％(w/v)、海藻酸钠0.8％(w/v)、胶原蛋白2％(w/v)、甘油0.6％(v/v)和儿茶素0.4％(w/v)；(3)脐带间充质干细胞因子精华液的制备：将步骤(1)得到的脐带间充质干细胞因子浓缩液和步骤(2)得到的稀释液按照体积比为1:1的比例混合，放入恒温振荡器，震荡5min，振荡均匀，得到脐带间充质干细胞因子精华液。实施例2一种含脐带间充质干细胞因子的精华液，包括：脐带间充质干细胞因子浓缩液50％(v/v)、人白蛋白2.5％(w/v)、葡聚糖2％(w/v)、透明质酸1.4％(w/v)、海藻酸钠1.1％(w/v)、胶原蛋白2.5％(w/v)、甘油0.9％(v/v)和儿茶素0.5％(w/v)。该精华液的制备方法包括如下步骤：(1)脐带间充质干细胞因子浓缩液的制备：a.脐带华通胶间充质干细胞的分离与培养：无菌取健康的人脐带组织，75％乙醇浸泡1min，将脐带组织两端各剪去1cm长度，剩余部分用生理盐水洗涤至澄清，剪成2cm的小段，生理盐水清洗3次，转移脐带组织至一新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没脐带组织1/2处，沿脐带组织静脉腔剪开，平铺后剔除1根静脉、2根动脉以及羊膜，取血管之间、血管与外膜之间的胶状物，即：华通胶，将华通胶剪碎至1mm3大小，转移至完全培养基中进行培养，将培养瓶放入37℃、5％co2培养箱中培养至80％-90％融合时进行细胞传代，每隔3天更换新鲜的培养基。b.间充质干细胞传代培养：吸弃步骤a中待传代细胞的培养液，于非细胞培养面加入10ml生理盐水，轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次，加入0.25％胰酶3ml，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育3min，待细胞变圆后加等量的终止液终止消化，快速震荡，用10ml移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml生理盐水，吹洗一次，汇入50ml离心管中，1200rpm，离心6min，弃上清，合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用完全培养基重悬，接种进行p1代培养，根据细胞数量铺瓶(t175瓶)，细胞密度为5×104/ml，每瓶体积为25ml，将培养瓶放入37℃、5％co2培养箱中培养至80％-90％融合时，继续进行传代培养，传代至p6代。c.脐带间充质干细胞因子浓缩液的制备：收集p2-p6代的细胞培养液，经0.22μm的滤膜过滤，然后通过分子量为50kd超滤膜进行干细胞上清液的浓缩，将浓缩液通过分子量为3kd的超滤膜，收集截留液，即为脐带间充质干细胞因子浓缩液；其中，完全培养基包括：达优mscmb培养基90％(v/v)、helios血清替代物7％(v/v)、白细胞介素20.5％(w/v)、柠檬酸钠0.5％(w/v)和硫酸葡聚糖2％(w/v)；终止液包括：α-mem培养基96％(v/v)、胎牛血清2％(v/v)、盐酸硫胺素0.8％(w/v)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸1.2％(w/v)。(2)稀释液的制备：将人白蛋白、葡聚糖、透明质酸、海藻酸钠、胶原蛋白、甘油和儿茶素用无菌超纯水按比例配制，放入恒温振荡器，震荡10min，振荡均匀，得到稀释液；稀释液包括：人白蛋白5％(w/v)、葡聚糖4％(w/v)、透明质酸2.8％(w/v)、海藻酸钠2.2％(w/v)、胶原蛋白5％(w/v)、甘油1.8％(v/v)和儿茶素1％(w/v)；(3)脐带间充质干细胞因子精华液的制备：将步骤(1)得到的脐带间充质干细胞因子浓缩液和步骤(2)得到的稀释液按照体积比为1:1的比例混合，放入恒温振荡器，震荡10min，振荡均匀，得到脐带间充质干细胞因子精华液。实施例3一种含脐带间充质干细胞因子的精华液，包括：脐带间充质干细胞因子浓缩液50％(v/v)、人白蛋白1.5％(w/v)、葡聚糖1％(w/v)、透明质酸0.8％(w/v)、海藻酸钠0.7％(w/v)、胶原蛋白1.4％(w/v)、甘油0.5％(v/v)和儿茶素0.3％(w/v)。该精华液的制备方法包括如下步骤：(1)脐带间充质干细胞因子浓缩液的制备：a.脐带华通胶间充质干细胞的分离与培养：无菌取健康的人脐带组织，75％乙醇浸泡1min，将脐带组织两端各剪去1cm长度，剩余部分用生理盐水洗涤至澄清，剪成2cm的小段，生理盐水清洗3次，转移脐带组织至一新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没脐带组织1/2处，沿脐带组织静脉腔剪开，平铺后剔除1根静脉、2根动脉以及羊膜，取血管之间、血管与外膜之间的胶状物，即：华通胶，将华通胶剪碎至1mm3大小，转移至完全培养基中进行培养，将培养瓶放入37℃、5％co2培养箱中培养至80％-90％融合时进行细胞传代，每隔3天更换新鲜的培养基。b.间充质干细胞传代培养：吸弃步骤a中待传代细胞的培养液，于非细胞培养面加入10ml生理盐水，轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次，加入0.25％胰酶3ml，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育2min，待细胞变圆后加等量的终止液终止消化，快速震荡，用10ml移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml生理盐水，吹洗一次，汇入50ml离心管中，1200rpm，离心6min，弃上清，合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用完全培养基重悬，接种进行p1代培养，根据细胞数量铺瓶(t175瓶)，细胞密度为3×104/ml，每瓶体积为25ml，将培养瓶放入37℃、5％co2培养箱中培养至80％-90％融合时，继续进行传代培养，传代至p6代。c.脐带间充质干细胞因子浓缩液的制备：收集p2-p6代的细胞培养液，经0.22μm的滤膜过滤，然后通过分子量为50kd超滤膜进行干细胞上清液的浓缩，将浓缩液通过分子量为3kd的超滤膜，收集截留液，即为脐带间充质干细胞因子浓缩液；其中，完全培养基包括：达优mscmb培养基86％(v/v)、helios血清替代物8％(v/v)、白细胞介素21.5％(w/v)、柠檬酸钠1.5％(w/v)和硫酸葡聚糖3％(w/v)；终止液包括：α-mem培养基94％(v/v)、胎牛血清3.5％(v/v)、盐酸硫胺素1.2％(w/v)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸1.3％(w/v)。(2)稀释液的制备：将人白蛋白、葡聚糖、透明质酸、海藻酸钠、胶原蛋白、甘油和儿茶素用无菌超纯水按比例配制，放入恒温振荡器，震荡8min，振荡均匀，得到稀释液；稀释液包括：人白蛋白3％(w/v)、葡聚糖2％(w/v)、透明质酸1.6％(w/v)、海藻酸钠1.4％(w/v)、胶原蛋白2.8％(w/v)、甘油1％(v/v)和儿茶素0.6％(w/v)；(3)脐带间充质干细胞因子精华液的制备：将步骤(1)得到的脐带间充质干细胞因子浓缩液和步骤(2)得到的稀释液按照体积比为1:1的比例混合，放入恒温振荡器，震荡8min，振荡均匀，得到脐带间充质干细胞因子精华液。实施例4一种含脐带间充质干细胞因子的精华液，包括：脐带间充质干细胞因子浓缩液50％(v/v)、人白蛋白1.5％(w/v)、葡聚糖1％(w/v)、透明质酸0.8％(w/v)、海藻酸钠0.7％(w/v)、胶原蛋白1.4％(w/v)、甘油0.5％(v/v)和儿茶素0.3％(w/v)。该精华液的制备方法包括如下步骤：(1)脐带间充质干细胞因子浓缩液的制备：a.脐带华通胶间充质干细胞的分离与培养：无菌取健康的人脐带组织，75％乙醇浸泡1min，将脐带组织两端各剪去1cm长度，剩余部分用生理盐水洗涤至澄清，剪成2cm的小段，生理盐水清洗3次，转移脐带组织至一新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没脐带组织1/2处，沿脐带组织静脉腔剪开，平铺后剔除1根静脉、2根动脉以及羊膜，取血管之间、血管与外膜之间的胶状物，即：华通胶，将华通胶剪碎至1mm3大小，转移至完全培养基中进行培养，将培养瓶放入37℃、5％co2培养箱中培养至80％-90％融合时进行细胞传代，每隔3天更换新鲜的培养基。b.间充质干细胞传代培养：吸弃步骤a中待传代细胞的培养液，于非细胞培养面加入10ml生理盐水，轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次，加入0.25％胰酶3ml，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育1min，待细胞变圆后加等量的终止液终止消化，快速震荡，用10ml移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml生理盐水，吹洗一次，汇入50ml离心管中，1200rpm，离心6min，弃上清，合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用完全培养基重悬，接种进行p1代培养，根据细胞数量铺瓶(t175瓶)，细胞密度为2×104/ml，每瓶体积为25ml，将培养瓶放入37℃、5％co2培养箱中培养至80％-90％融合时，继续进行传代培养，传代至p6代。c.脐带间充质干细胞因子浓缩液的制备：收集p2-p6代的细胞培养液，经0.22μm的滤膜过滤，然后通过分子量为50kd超滤膜进行干细胞上清液的浓缩，将浓缩液通过分子量为3kd的超滤膜，收集截留液，即为脐带间充质干细胞因子浓缩液；其中，完全培养基包括：达优mscmb培养基86％(v/v)、helios血清替代物8％(v/v)、白细胞介素21.5％(w/v)、柠檬酸钠1.5％(w/v)和硫酸葡聚糖3％(w/v)；终止液包括：α-mem培养基92％(v/v)、胎牛血清5％(v/v)、盐酸硫胺素1.5％(w/v)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸1.5％(w/v)。(2)稀释液的制备：将人白蛋白、葡聚糖、透明质酸、海藻酸钠、胶原蛋白、甘油和儿茶素用无菌超纯水按比例配制，放入恒温振荡器，震荡6min，振荡均匀，得到稀释液；稀释液包括：人白蛋白3％(w/v)、葡聚糖2％(w/v)、透明质酸1.6％(w/v)、海藻酸钠1.4％(w/v)、胶原蛋白2.8％(w/v)、甘油1％(v/v)和儿茶素0.6％(w/v)；(3)脐带间充质干细胞因子精华液的制备：将步骤(1)得到的脐带间充质干细胞因子浓缩液和步骤(2)得到的稀释液按照体积比为1:1的比例混合，放入恒温振荡器，震荡6min，振荡均匀，得到脐带间充质干细胞因子精华液。实施例5一种含脐带间充质干细胞因子的精华液，包括：脐带间充质干细胞因子浓缩液50％(v/v)、人白蛋白2.5％(w/v)、葡聚糖2％(w/v)、透明质酸1.4％(w/v)、海藻酸钠1.1％(w/v)、胶原蛋白2.5％(w/v)、甘油0.9％(v/v)和儿茶素0.5％(w/v)。该精华液的制备方法包括如下步骤：(1)脐带间充质干细胞因子浓缩液的制备：a.脐带华通胶间充质干细胞的分离与培养：无菌取健康的人脐带组织，75％乙醇浸泡1min，将脐带组织两端各剪去1cm长度，剩余部分用生理盐水洗涤至澄清，剪成2cm的小段，生理盐水清洗3次，转移脐带组织至一新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没脐带组织1/2处，沿脐带组织静脉腔剪开，平铺后剔除1根静脉、2根动脉以及羊膜，取血管之间、血管与外膜之间的胶状物，即：华通胶，将华通胶剪碎至1mm3大小，转移至完全培养基中进行培养，将培养瓶放入37℃、5％co2培养箱中培养至80％-90％融合时进行细胞传代，每隔3天更换新鲜的培养基。b.间充质干细胞传代培养：吸弃步骤a中待传代细胞的培养液，于非细胞培养面加入10ml生理盐水，轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次，加入0.25％胰酶3ml，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育3min，待细胞变圆后加等量的终止液终止消化，快速震荡，用10ml移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml生理盐水，吹洗一次，汇入50ml离心管中，1200rpm，离心6min，弃上清，合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用完全培养基重悬，接种进行p1代培养，根据细胞数量铺瓶(t175瓶)，细胞密度为5×104/ml，每瓶体积为25ml，将培养瓶放入37℃、5％co2培养箱中培养至80％-90％融合时，继续进行传代培养，传代至p6代。c.脐带间充质干细胞因子浓缩液的制备：收集p2-p6代的细胞培养液，经0.22μm的滤膜过滤，然后通过分子量为50kd超滤膜进行干细胞上清液的浓缩，将浓缩液通过分子量为3kd的超滤膜，收集截留液，即为脐带间充质干细胞因子浓缩液；其中，完全培养基包括：达优mscmb培养基90％(v/v)、helios血清替代物7％(v/v)、白细胞介素20.5％(w/v)、柠檬酸钠0.5％(w/v)和硫酸葡聚糖2％(w/v)；终止液包括：α-mem培养基94％(v/v)、胎牛血清3.5％(v/v)、盐酸硫胺素1.2％(w/v)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸1.3％(w/v)。(2)稀释液的制备：将人白蛋白、葡聚糖、透明质酸、海藻酸钠、胶原蛋白、甘油和儿茶素用无菌超纯水按比例配制，放入恒温振荡器，震荡9min，振荡均匀，得到稀释液；稀释液包括：人白蛋白5％(w/v)、葡聚糖4％(w/v)、透明质酸2.8％(w/v)、海藻酸钠2.2％(w/v)、胶原蛋白5％(w/v)、甘油1.8％(v/v)和儿茶素1％(w/v)；(3)脐带间充质干细胞因子精华液的制备：将步骤(1)得到的脐带间充质干细胞因子浓缩液和步骤(2)得到的稀释液按照体积比为1:1的比例混合，放入恒温振荡器，震荡9min，振荡均匀，得到脐带间充质干细胞因子精华液。对比例1与实施例3的区别仅在于，一种含脐带间充质干细胞因子的精华液，包括：脐带间充质干细胞因子浓缩液50％(v/v)、人白蛋白3％(w/v)、葡聚糖0.3％(w/v)、透明质酸1.5％(w/v)、海藻酸钠0.3％(w/v)、胶原蛋白3％(w/v)、甘油0.2％(v/v)和儿茶素1％(w/v)。对比例2与实施例3的区别仅在于，一种含脐带间充质干细胞因子的精华液，包括：脐带间充质干细胞因子浓缩液50％(v/v)、人白蛋白0.5％(w/v)、葡聚糖2.5％(w/v)、透明质酸0.3％(w/v)、海藻酸钠1.5％(w/v)、胶原蛋白0.5％(w/v)、甘油1％(v/v)和儿茶素0.1％(w/v)。对比例3与实施例3的区别仅在于，完全培养基包括：达优mscmb培养基75％(v/v)、helios血清替代物15％(v/v)、白细胞介素20.3％(w/v)、柠檬酸钠2.7％(w/v)和硫酸葡聚糖7％(w/v)。对比例4与实施例3的区别仅在于，终止液包括：α-mem培养基90％(v/v)、胎牛血清6％(v/v)、盐酸硫胺素0.5％(w/v)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸3.5％(w/v)。一、细胞因子浓度变化检测使用elasia试剂盒对实施例1-5和对比例3-4中脐带间充质干细胞浓缩前和浓缩后的表皮生长因子、血管内皮生长因子和血小板源生长因子的含量和回收率进行检测，得到表1：表1细胞因子含量和回收率变化由表1可知，本申请中细胞上清液使用超滤膜过滤浓缩了40倍左右，实施例1-5中细胞因子浓度和回收率均较高，表皮生长因子、血管内表皮生长因子和血小板源生长因子的回收率分别在97.72-98.12％、96.60-97.47％和98.05-99.30％范围内，其中，实施例3中细胞因子浓度和回收率最高，对比例3-4中细胞因子浓度和回收率均小于实施例3。上述结果表明本申请中制备方法的优化显著提高了间充质干细胞因子浓缩液中间充质干细胞因子的含量和回收率。二、精华液效果测试找寻35名面部有皱纹、色斑，皮肤暗淡或皮肤松弛的受试者，随机分为7组，每组5人，分别试用实施例1-5和对比例1-2中精华液，连续使用两个月，观察受试者皮肤状况，根据表2进行评分，得到表3：表2评分依据面部情况分数区间(分)面部皱纹、色斑明显/皮肤暗沉、粗糙1-3面部皱纹、色斑轻微/皮肤轻微变白、变光滑4-6面部皱纹、色斑明显变轻，皮肤变白、变光滑7-9面部无皱纹、色斑/皮肤明显变白、变光滑10表3精华液效果测试评分实例分数(分)实施例18.4实施例28.5实施例39.2实施例48.7实施例58.7对比例15.5对比例25.7注：表中数据为平均值。由表3可知，实施例1-5分数值较高，均在8分以上，其中，实施例3分数最高，为9.2分，对比例1-2分数均较低，分别为5.5分和5.7分，表明在本申请保护范围内的精华液具有美白淡斑、修复皮肤、减少皱纹和延缓衰老等功效，而改变精华液的配比则对其效果产生影响。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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技术特征：
1.一种含脐带间充质干细胞因子的精华液，其特征在于，所述的精华液包括：脐带间充质干细胞因子浓缩液50％(v/v)、人白蛋白1％-2.5％(w/v)、葡聚糖0.5％-2％(w/v)、透明质酸0.5％-1.4％(w/v)、海藻酸钠0.4％-1.1％(w/v)、胶原蛋白1％-2.5％(w/v)、甘油0.3％-0.9％(v/v)和儿茶素0.2％-0.5％(w/v)。
2.根据权利要求1所述的精华液，其特征在于，所述的精华液包括：脐带间充质干细胞因子浓缩液50％(v/v)、人白蛋白1.5％-2.5％(w/v)、葡聚糖1％-2％(w/v)、透明质酸0.8％-1.4％(w/v)、海藻酸钠0.7％-1.1％(w/v)、胶原蛋白1.4％-2.5％(w/v)、甘油0.5％-0.9％(v/v)和儿茶素0.3％-0.5％(w/v)。
3.一种根据权利要求1-2任意一项所述精华液的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)脐带间充质干细胞因子浓缩液的制备：
a.脐带华通胶间充质干细胞的分离与培养：将人脐带组织用75％乙醇浸泡，组织两端各剪去1cm，剩余部分用生理盐水洗涤至澄清，剪成小段，生理盐水清洗3次，沿脐带组织静脉腔剪开，平铺后剔除静脉、动脉和羊膜，取血管之间、血管与外膜之间的胶状物，即：华通胶，将华通胶剪碎，转移至完全培养基进行原代细胞培养，培养至80％-90％融合时进行细胞传代；
b.间充质干细胞传代培养：吸弃步骤a中待传代细胞的培养液，加入生理盐水洗涤组织贴壁面，加入0.25％胰酶，37℃孵育1-3min，待细胞变圆后，加终止液终止消化，快速震荡，吹打细胞，吸出细胞悬液，加入生理盐水洗涤，离心，收集沉淀，用完全培养基重悬沉淀，接种至完全培养基进行p1代培养，细胞生长至80％-90％融合时，继续进行传代培养，传代至p6代；
c.脐带间充质干细胞因子浓缩液的制备：收集p2-p6代的细胞培养液，经过微滤膜、超滤膜过滤浓缩，收集截留液，得到脐带间充质干细胞因子浓缩液；
所述的完全培养基包括：达优mscmb培养基80％-90％(v/v)、helios血清替代物7％-12％(v/v)、白细胞介素20.5％-2％(w/v)、柠檬酸钠0.5％-2％(w/v)和硫酸葡聚糖2％-4％(w/v)；
所述的终止液包括：α-mem培养基92％-96％(v/v)、胎牛血清2％-5％(v/v)、盐酸硫胺素0.8％-1.5％(w/v)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸1.2％-1.5％(w/v)；
(2)稀释液的制备：将人白蛋白、葡聚糖、透明质酸、海藻酸钠、胶原蛋白、甘油和儿茶素用无菌超纯水按比例配制，震荡5-10min均匀，得到稀释液；
(3)脐带间充质干细胞因子精华液的制备：将步骤(1)得到的脐带间充质干细胞因子浓缩液和步骤(2)得到的稀释液按照体积比为1:1的比例混合，震荡5-10min均匀，得到含脐带间充质干细胞因子的精华液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的完全培养基包括：达优mscmb培养基86％-90％(v/v)、helios血清替代物7％-8％(v/v)、白细胞介素20.5％-1.5％(w/v)、柠檬酸钠0.5％-1.5％(w/v)和硫酸葡聚糖2％-3％(w/v)。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的终止液包括：α-mem培养基92％-94％(v/v)、胎牛血清3.5％-5％(v/v)、盐酸硫胺素1.2％-1.5％(w/v)和4-羟乙基哌嗪乙磺酸1.3％-1.5％(w/v)。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的稀释液包括：人白蛋白2％-5％(w/v)、葡聚糖1％-4％(w/v)、透明质酸1％-2.8％(w/v)、海藻酸钠0.8％-2.2％(w/v)、胶原蛋白2％-5％(w/v)、甘油0.6％-1.8％(v/v)和儿茶素0.4％-1％(w/v)。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的稀释液包括：人白蛋白3％-5％(w/v)、葡聚糖2％-4％(w/v)、透明质酸1.6％-2.8％(w/v)、海藻酸钠1.4％-2.2％(w/v)、胶原蛋白2.8％-5％(w/v)、甘油1％-1.8％(v/v)和儿茶素0.6％-1％(w/v)。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的原代细胞培养和传代细胞培养所用的培养条件为37℃，5％co2，湿度为95％，每隔3天更换新鲜的培养基。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤b中所述接种的细胞密度为2-5×104/ml。
10.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤c中所述超滤膜是通过分子量为50kd和3kd的超滤膜。
技术总结
本发明公开了一种含脐带间充质干细胞因子的精华液及其制备方法，涉及皮肤保养品技术领域。该精华液包括脐带间充质干细胞因子浓缩液、人白蛋白、葡聚糖、透明质酸、海藻酸钠、胶原蛋白、甘油和儿茶素，具有美白淡斑、修复皮肤、减少皱纹和延缓衰老等功效。该精华液的制备方法简单快速，通过优化其制备方法，显著提高了间充质干细胞因子浓缩液中间充质干细胞因子的含量和回收率，提高了脐带间充质干细胞的增殖能力，有效缩短了精华液的制备时间，可适用于规模化生产。
技术研发人员：郑春兵;王成;文乐;陈玲玲;王健
受保护的技术使用者：湖南源品细胞生物科技有限公司
技术研发日：.10.10
技术公布日：.02.28
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