本发明属于细胞保存技术领域，具体涉及一种自体脐带间充质干细胞冻存液及其制备和冻存方法。
背景技术：
细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，起到了细胞保种的作用。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。
细胞冻存时向培养基中加入保护剂，甘油或二甲基亚砜(dmso)，可使溶液冰点降低，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。加入血清和培养基，为细胞提供合适的渗透压、ph值和滋养成分，但是不同来源的血清蛋白，包括异种或异体来源，提高了细胞污染几率，且不符合临床细胞治疗制剂的安全标准。此外，间充质干细胞在冻存前被消化为悬浮单个细胞，脱离贴壁培养中胞外分泌形成的细胞基质，并且传统冻存剂中不包含模拟胞外基质的成分，使得冻存复苏后的细胞存活率较低。
细胞外基质的主要成分包括胶原、非胶原糖蛋白、弹性蛋白、氨基聚糖和蛋白聚糖。它可以影响细胞的存活、生长与死亡，决定细胞的形状，控制细胞的分化，参与细胞的迁移。
生物样本库中的细胞冻存流程，以服务于临床细胞治疗为目的，对细胞的安全性、外源蛋白污染和细胞数量、存活率提出更高的要求，因而急需一种适用于自体脐带间充质干细胞的冻存液，能够在新生儿分娩的同时获得足量的血液，提取自体血清，从而避免异种异体来源的血清蛋白污染，同时模拟细胞外基质微环境，提高冷冻复苏后的细胞存活率。
技术实现要素：
本发明的目的在于：针对上述现有技术中的不足，提供一种自体脐带间充质干细胞冻存液及其制备和冻存方法，能够有效避免异种异体来源的血清蛋白污染，模拟细胞外基质微环境，提高细胞复苏存活率，从而有利于其在生物样本库标准化操作和临床细胞治疗中的应用。
本发明采用的技术方案如下：
一种自体脐带间充质干细胞冻存液，冻存液由配合使用的a液和b液组成，a液与b液的体积比为6-9:1-3；
a液按照体积份数计，包括如下成分：65-75份含预添加物的基础培养基；预添加物与基础培养基的比为7-12mg：0.6-0.9ml；其中，预添加物按重量份数计，包括：4-6份巴戟天醇提取物、0.13-0.16份ⅰ型胶原、0.05-0.15份透明质酸钠和3-5份硫辛酸；
b液按照体积份数计，包括如下成分：15-25份自体血清。
进一步地，冻存液由配合使用的a液和b液组成，a液与b液的体积比为7:2；
a液按照体积份数计，包括如下成分：70份含预添加物的基础培养基；预添加物与基础培养基的比为9.25mg：0.7ml；其中，预添加物按重量份数计，包括：5份巴戟天醇提取物、0.15份ⅰ型胶原、0.10份透明质酸钠和4份硫辛酸；
b液按照体积份数计，包括如下成分：20份自体血清。
通过在基础培养基中添加成分，模拟细胞基质成分特性：
添加ⅰ型胶原：细胞基质和骨髓基质中占比最高的成分之一。添加透明质酸：使细胞彼此分离，使细胞易于运动迁移和增殖并阻止细胞分化。添加巴戟天提取物，其含有蒽醌苷类成分，能保护和提高脐带间充质细胞的自我复制和多向分化能力。添加硫辛酸，其为一种存在于线粒体的酶，能消除加速老化与致病的自由基。
而自体血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物。可为细胞的生长提供较好的生存环境。有效避免异种异体来源的血清蛋白污染。
进一步地，自体血清的具体制备步骤如下：
(1)在供体新生儿娩出时，结扎脐带近脐端，使脐动脉血聚集，在脐带靠近结扎端血管较为鼓起的部位刺入脐动脉，抽取脐带血，脐带血中不加抗凝剂；
(2)于37℃下静置血液凝固1-2h；
(3)将步骤(2)所得凝固血液放入4℃温度下过夜，使得血块固缩；
(4)当步骤(3)中血清自然析出后，在4℃，3000转/分条件下，离心10分钟，分离血清，弃去不溶物，即得。
进一步地，巴戟天醇提取物由以下方式制得：将巴戟天粉碎至颗粒直径为0.06-0.08mm，用95vt％的乙醇回流提取3次，每次1h，提取液减压回收乙醇，制得浓度为2g/ml混悬液。
进一步地，基础培养基为dmem/f12基础培养基。
上述的自体脐带间充质干细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：
将a液的各组分混合，制得a液，置于4℃中保存备用；
制得b液置于-80℃保存备用。
上述的自体脐带间充质干细胞冻存液进行冻存的方法，包括以下步骤：
(1)在37℃复苏b液；
(2)将b液与a液按照1-3:6-9的体积比混合，得到混合液；
(3)获得要冻存的细胞，按照1×107cells/0.9ml-1×107cells/1ml的浓度，使用步骤(2)所得混合液重悬细胞；
(4)按照二甲基亚砜与细胞悬液体积比为1-2:8-9，向细胞悬液中缓慢加入二甲基亚砜，混合均匀后，降温冻存即可。
进一步地，步骤(2)中b液与a液按照2:7的体积比混合。
进一步地，步骤(3)中浓度为1×107cells/0.9ml。
进一步地，步骤(4)中二甲基亚砜与细胞悬液体积比为1:9。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明中，自体血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物。生长因子主要有，血小板类生长因子、表皮生长因子类(表皮生长因子，egf、转化生长因子，tgfα和tgfβ)、成纤维细胞生长因子(αfgf、βfgf)、类胰岛素生长因子(igf-ⅰ、igf-ⅱ)、神经生长因子(ngf)、白细胞介素类生长因子(il-1、il-1、il-3等)、红细胞生长素(epo)、集落刺激因子(csf)等，可为细胞的生长提供较好的生存环境。
2、本发明通过在基础培养基中添加成分，模拟细胞基质成分特性。ⅰ型胶原，是细胞基质中占比最高的成分之一，添加其作为冻存液成分，可提高冻存环境与细胞基质相似度，模拟组织微环境，从而提高细胞存活率；透明质酸，也是组织间质的重要成分之一，使细胞彼此分离，使细胞易于运动迁移和增殖并阻止细胞分化；巴戟天醇提取物，其含有蒽醌苷类成分，能保护和提高脐带间充质细胞的自我复制和多向分化能力；硫辛酸，其为一种存在于线粒体的酶，能消除加速老化与致病的自由基。
3、本发明冻存液在保证细胞状态的前提下，能够有效避免异种异体来源的血清蛋白污染，提高了细胞复苏存活率，有利于其在生物样本库标准化操作和临床细胞治疗中的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为采用实施例1的冻存剂冻存一个月的100倍放大图；
图2为采用常规冻存剂冻存一个月的100倍放大图；
图3为采用实施例1的冻存剂冻存六个月的100倍放大图；
图4为采用常规冻存剂冻存六个月的100倍放大图；
图5为采用实施例1的冻存剂冻存十二个月的100倍放大图；
图6为采用常规冻存剂冻存十二个月的100倍放大图；
图7为细胞复苏率图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本发明较佳实施例提供的一种自体脐带间充质干细胞冻存液，冻存液由配合使用的a液和b液组成；
a液按照体积份数计，包括如下成分：70份含预添加物的基础培养基；预添加物与基础培养基的比为9.25mg：0.7ml；其中，预添加物按重量份数计，包括：5份巴戟天醇提取物、0.15份ⅰ型胶原、0.10份透明质酸钠和4份硫辛酸；
b液按照体积份数计，包括如下成分：20份自体血清。
其中，自体血清的具体制备步骤如下：
(1)在供体新生儿娩出时，结扎脐带近脐端，使脐动脉血聚集，使用50ml注射器针管，插上5ml注射器针头，在脐带靠近结扎端血管较为鼓起的部位刺入脐动脉，抽取血液30ml(不加抗凝剂)；
(2)37℃下，让血液凝固1到2小时；
(3)将步骤(2)所得放入4℃冰箱过夜(让血块固缩)；
(4)当步骤(3)中血清自然析出后，4℃，3000转/分，离心10分钟，分离血清，弃去不溶物，一般情况下，可收获约4.5ml自体血清，分离效率15％；
将步骤(4)所得血清移至一干净试管，并分装成小份，储藏在-80℃。
其中，巴戟天醇提取物由以下方式制得：将巴戟天400g粉碎至颗粒直径为0.07mm，用95vt％的乙醇回流提取3次，每次1h，提取液减压回收乙醇至浸膏状，4℃保存。使用时制成2g/ml混悬液。
其中，基础培养基为dmem/f12基础培养基。
实施例2
本发明较佳实施例提供的一种自体脐带间充质干细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：
按比例称量各组分，并将a液的各组分混合，制得a液，置于4℃中保存备用；制得b液置于-80℃保存备用。
实施例3
本发明较佳实施例提供的一种自体脐带间充质干细胞冻存液进行冻存的方法，包括以下步骤：
(1)在37℃复苏b液；
(2)将b液与a液按照2:7的体积比混合，得到混合液；
(3)消化收集并离心，获得要冻存的细胞团块，按照1×107cells/0.9ml的浓度，使用步骤(2)所得混合液重悬细胞；
(4)按照二甲基亚砜与细胞悬液体积比为1:9，向细胞悬液中缓慢加入二甲基亚砜，混合均匀后，降温冻存即可。
实验例
将第一代人源脐带间充质干细胞在分别使用本发明实施例1的冻存剂和常规冻存剂进行冻存，常规冻存剂成分与本发明实施例1的冻存剂成分接近，为dmem/f12培养基、胎牛血清和二甲亚砜的体积比为7:2:1的冻存剂，分别冻存1个月、6个月和12个月后复苏培养48小时，其100倍放大图如图1-6所示。
由图可见，本发明的冻存剂在细胞冻存一年后复苏的贴壁培养扩增，形态饱满，呈长梭形，涡旋状分布。与使用常规冻存剂相比，无显著形态学差异。
分别对使用本发明实施例1的冻存剂和常规冻存剂冻存的细胞的细胞复苏存活率进行了测试，结果如图7所示，并分别对各个时间点间、组间差异进行了统计分析(t检验法)，结果如下表1和表2所示。
表1各时间点细胞复苏率的统计分析
表2实施例1组和对照组的统计分析
可以看出，共测试了1个月、6个月和12个月的三个时间点，各个时间点内的组间存在显著性差异，且包含全部三个时间点样本的实施例1组与对照组间的差异性极其显著。说明本发明的冻存液对细胞复苏率的提高具有显著作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：
1.一种自体脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液由配合使用的a液和b液组成，a液与b液的体积比为6-9:1-3；
所述a液按照体积份数计，包括如下成分：65-75份含预添加物的基础培养基；预添加物与基础培养基的比为7-12mg：0.6-0.9ml；其中，预添加物按重量份数计，包括：4-6份巴戟天醇提取物、0.13-0.16份ⅰ型胶原、0.05-0.15份透明质酸钠和3-5份硫辛酸；
所述b液按照体积份数计，包括如下成分：15-25份自体血清。
2.根据权利要求1所述的自体脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液由配合使用的a液和b液组成，a液与b液的体积比为7:2；
所述a液按照体积份数计，包括如下成分：70份含预添加物的基础培养基；预添加物与基础培养基的比为9.25mg：0.7ml；其中，预添加物按重量份数计，包括：5份巴戟天醇提取物、0.15份ⅰ型胶原、0.10份透明质酸钠和4份硫辛酸；
所述b液按照体积份数计，包括如下成分：20份自体血清。
3.根据权利要求1或2所述的自体脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述自体血清的具体制备步骤如下：
(1)在供体新生儿娩出时，结扎脐带近脐端，使脐动脉血聚集，在脐带靠近结扎端血管较为鼓起的部位刺入脐动脉，抽取脐带血，脐带血中不加抗凝剂；
(2)于37℃下静置血液凝固1-2h；
(3)将步骤(2)所得凝固血液放入4℃温度下过夜，使得血块固缩；
(4)当步骤(3)中血清自然析出后，在4℃，3000转/分条件下，离心10分钟，分离血清，弃去不溶物，即得。
4.根据权利要求1或2所述的自体脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述巴戟天醇提取物由以下方式制得：将巴戟天粉碎至颗粒直径为0.06-0.08mm，用95vt％的乙醇回流提取3次，每次1h，提取液减压回收乙醇，制得混悬液。
5.根据权利要求1或2所述的自体脐带间充质干细胞冻存液，其特征在于：所述基础培养基为dmem/f12基础培养基。
6.权利要求1-5中任一项所述的自体脐带间充质干细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将a液的各组分混合，制得a液，置于4℃中保存备用；
制得b液置于-80℃保存备用。
7.采用权利要求1-5中任一项所述的自体脐带间充质干细胞冻存液进行冻存的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在37℃复苏b液；
(2)将b液与a液按照1-3:6-9的体积比混合，得到混合液；
(3)获得要冻存的细胞，按照1×107cells/0.9ml-1×107cells/1ml的浓度，使用步骤(2)所得混合液重悬细胞，得到细胞悬液；
(4)按照二甲基亚砜与细胞悬液体积比为1-2:8-9，向细胞悬液中缓慢加入二甲基亚砜，混合均匀后，降温冻存即可。
8.根据权利要求7所述的自体脐带间充质干细胞冻存液进行冻存的方法，其特征在于：所述步骤(2)中b液与a液按照2:7的体积比混合。
9.根据权利要求7所述的自体脐带间充质干细胞冻存液进行冻存的方法，其特征在于：所述步骤(3)中浓度为1×107cells/0.9ml。
10.根据权利要求7所述的自体脐带间充质干细胞冻存液进行冻存的方法，其特征在于：所述步骤(4)中二甲基亚砜与细胞悬液体积比为1:9。
技术总结
本发明公开了一种自体脐带间充质干细胞冻存液及其制备和冻存方法，冻存液由配合使用的A液和B液组成，A液与B液的体积比为6‑9:1‑3；所述A液按照体积份数计，包括如下成分：65‑75份含预添加物的基础培养基；预添加物与基础培养基的比为7‑12mg：0.6‑0.9mL；其中，预添加物按重量份数计，包括：4‑6份巴戟天醇提取物、0.13‑0.16份Ⅰ型胶原、0.05‑0.15份透明质酸钠和3‑5份硫辛酸；所述B液按照体积份数计，包括如下成分：15‑25份自体血清。使用本发明的冻存液能够在新生儿分娩时同步获得足量的血液用于分离自体血清，从而有效避免异种异体来源的血清蛋白污染，同时模拟细胞外基质微环境，提高细胞复苏存活率，从而有利于其在生物样本库标准化操作和临床细胞治疗中的应用。
技术研发人员：纪慧娇;肖占刚;赵曰水;钟鲜梅;鲁道源
受保护的技术使用者：西南医科大学
技术研发日：.11.27
技术公布日：.02.28
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