干旱和高盐等渗透胁迫是影响植物生长和作物产量的重要环境因素。植物激素ABA在植物对逆境的适应性反应中起着重要作用。SnRK2家族被分为三个亚类，在渗透胁迫反应中起重要作用【1,2】。第III类 SnRK2s的功能研究较为清楚。它们可被ABA强烈激活，在渗透胁迫下作为ABA受体下游信号传导的重要正调控因子。激活的第III类SnRK2s通过激活下游bZIP型转录因子AREB/ABFs调节各种ABA反应【3,4】。另一方面，第I类SnRK2s也参与植物渗透胁迫响应的调控。与第III类SnRK2s不同，第I类SnRK2s在ABA积累前被渗透胁迫迅速激活，ABA不能激活这类蛋白【5】，这其中的调控机制仍然不清楚。
近日，Nature Communications在线发表了日本东京大学Kazuko Yamaguchi-Shinozaki研究组题为Plant Raf-like kinases regulate the mRNA population upstream of ABA-unresponsive SnRK2 kinases under drought stress的研究论文。该研究利用co-IP结合LC-MS/MS分析，鉴定出三个Raf激酶作用于第I类SnRK2s上游，通过磷酸化SnRK2s参与渗透胁迫下植物生长的调控。
为加深对ABA非依赖性渗透胁迫信号的理解，该研究首次鉴定了拟南芥中对ABA无反应的I类 SnRK2相互作用蛋白。因为在根和茎组织中具有较高表达水平，作者选择SRK2A和SRK2G作为研究对象，利用GFP作为标签进行co-IP并进行LC-MS/MS分析。先前的研究表明， I类SnRK2s的磷酸化/去磷酸化参与其激活，且Raf激酶在植物渗透胁迫反应的早期被磷酸化，因此该研究从1308个和774个候选蛋白中挑选3个B4-Raf激酶 RAF18、RAF20和RAF24作为可能的SnRK2s上游调控因子进行进一步验证。生化实验证明，在渗透胁迫下，RAF18、RAF20和RAF24三个激酶与SnRK2s在P-body中发生相互作用。体外磷酸化实验表明，三个Raf激酶在体外能磷酸化I类SnRK2s；质谱分析发现SRK2G的Ser-154是三个Raf激酶的直接磷酸化靶点之一。通过胶内激酶活性分析发现，在渗透胁迫下，Raf激酶三突变体中的I类SnRK2s激酶活性显着降低，单突或双突则无明显影响，说明三种激酶在渗透胁迫下对I类SnRK2s的活性具有冗余和正调节作用。与野生型相比，三突变体对干旱、盐及甘露醇处理均表现出生长迟缓的敏感表型，说明RAF18/20/24参与渗透胁迫下的植物生长调控。与此相对应，RAF18/20/24调控渗透胁迫反应相关基因的表达。
先前的研究表明，在渗透胁迫条件下， I 类SnRK2s通过磷酸化mRNA-decapping激活子VCS，调节mRNA含量【6】，作者认为RAF18/20/24可能也参与这一过程。转录组分析及定量PCR结果显示，渗透胁迫下，Raf三突变体与SnRK2s突变体有大量重合的差异表达基因，且一系列渗透胁迫调控基因在两种突变体中具有类似的表达模式，这些结果进一步证明Raf激酶通过调控I类SnRK2s激酶活性参与植物渗透胁迫响应的调节过程。
渗透胁迫下依赖ABA及不依赖ABA的信号途径示意图综上，该研究利用IP-MS成功鉴定了I类SnRK2s成员SRK2A和SRK2G上游激酶RAF18、RAF20和RAF24，并通过生化实验、表型鉴定及转录组分析确定它们渗透胁迫中的调节作用。下一步工作可寻找Raf激酶的上游调节组分，以进一步完善植物对渗透胁迫响应的分子机制。
此外，今年1月份，中科院上海植物逆境生物学研究中心王鹏程和朱健康研究组在Nature Communications在线发表题为A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants的研究论文，揭示了RAFs和SnRK2s组成的蛋白激酶级联途径介导的植物渗透胁迫的早期应答过程。
该研究通过胶内激酶分析（in-gel kinase assay）发现，除SnRK2外，另一组大分子量的蛋白激酶（100-130 kDa）也被渗透胁迫特异激活，研究人员将其命名为渗透胁迫激活的蛋白激酶（osmotic stress activated protein kinases, OKs）。渗透胁迫处理2分钟后OK即被迅速激活，且OK的激活不依赖于SnRK2。
通过定量磷酸化组学研究，研究人员比较分析了野生型和SnRK2十突变体中渗透胁迫诱导的磷酸化变化。甘露醇处理后，RAF家族蛋白激酶的磷酸化迅速增加，且B亚组蛋白激酶的分子量与OK一致。利用CRISPR-Cas9技术，研究人员进一步构建了RAF基因家族成员的多突变体。对突变体的检测表明，B4亚组的7个成员特异地调控了不依赖于ABA的SnRK2（SnRK2.1/4/5/9/10）的激活，而B2和B3亚组的12个成员特异地调控了依赖于ABA的SnRK2.2/3/6的激活。B4-RAF的多突变体对渗透胁迫超敏感。
进一步研究发现，OK能直接与SnRK2相互作用并磷酸化SnRK2s。其中B4亚组RAF特异磷酸化SnRK2.1/4/5/9/10，而B2和B3亚组RAF特异磷酸化SnRK2.2/3/6。RAFs能磷酸化SnRK2蛋白激活环（activation loop）的多个位点。已知SnRK2.6蛋白S171和S175两个保守的磷酸化位点对于SnRK2.6的激活是必须的。该研究证实了RAF家族蛋白激酶对于这一位点磷酸化，而不是SnRK2的自磷酸化介导了渗透胁迫对SnRK2的激活。该研究还初步证实了RAFs家族蛋白激酶对于ABA诱导的SnRK2的激活也是必需的，B亚组RAFs的14突变体对ABA不敏感。
综上所述，该研究揭示了RAF-SnRK2级联途径是渗透胁迫的早期信号途径，为深入了解植物感受和应答渗透胁迫的分子机制提供了线索。同时，通过高通量磷酸蛋白组学鉴定未知蛋白激酶的探索和多基因家族的大规模敲除也为相关领域的研究提供参考。
王鹏程研究组博士研究生蔺祯、工作人员刘晓磊、朱健康组中国农业大学访问学者李媛、博士后张正静是本文的共同第一作者。朱健康院士和王鹏程研究员是本文的共同通讯作者。该研究得到中国科学院先导项目、国家自然科学基金的支持。
参考文献
1. Mustilli, A. C., Merlot, S., Vavasseur, A., Fenzi, F. & Giraudat, J. Arabidopsis OST1 protein kinase mediates the regulation of stomatal aperture by abscisic acid and acts upstream of reactive oxygen species production. Plant Cell 12, 3089–3099 (2002).
2. Yoshida, R. et al. ABA-activated SnRK2 protein kinase is required for dehydration stress signaling in Arabidopsis. Plant Cell Physiol. 43, 1473–1483 (2002).
3. Furihata, T. et al. Abscisic acid-dependent multisite phosphorylation regulates the activity of a transcription activator AREB1. Proc. Natl Acad. Sci. USA 103, 1988–1993 ().
4. Fujii, H. & Zhu, J. K. Arabidopsis mutant deficient in 3 abscisic acid-activated protein kinases reveals critical roles in growth, reproduction, and stress. Proc. Natl Acad. Sci. USA 106, 8380–8385 ().
5. Yoshida, R. et al. The regulatory domain of RK2E/OST1/SnRK2.6 interacts with ABI1 and integrates abscisic acid (ABA) and osmotic stress signals controlling stomatal closure in Arabidopsis. J. Biol. Chem. 281, 5310–5318 ().
6. Soma, F. et al. ABA-unresponsive SnRK2 protein kinases regulate mRNA decay under osmotic stress in plants. Nat. Plants 3, 16204 ().
论文链接：
/10.1038/s41467-020-15239-3
/10.1038/s41467-020-14477-9
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