本发明涉及一种新型荧光染料accublue在核酸适配体检测法中的应用，属于分析检测领域。
背景技术：
核酸适配体的检测方法是近年来食品、药品检测方法中研究的热点及重点。核酸适配体(aptamer)是能够与药物，无机或有机分子、蛋白等目标物发生高亲合性和特异性结合的一类单链核苷酸(dnaorrna)。通常由10~100个碱基组成。由于单链核苷酸空间结构的多样性，通过链内碱基互补配对和氢键作用，使自身形成g-四链体、凸环等复杂的三级结构。核酸适配体可与靶标发生高特异性，高亲和力的结合，且核酸适配体可被多种标记物进行标记，连接生物传感器后，核酸适配体检测法可在基础研究、分析检测以及药物的研发与临床诊断中应用。核酸适配体的检测方法中，主要利用对核酸适配体进行纳米物质、荧光物质、相关酶类材料、生物素及特定用途的蛋白质的修饰，而后通过酶联免疫反应、放射免疫测定、荧光方法等进行检测。
近年来，基于核酸适配体的荧光传感器已有较多的报道，但对于具有广泛应用性的荧光染料的研究较少。目前发现并常用的picogreen、sybrgreen等染料具有在游离或是与单链dna共存的情况下，只发出微弱的荧光，而与双链dna共存时，荧光强度显著增强的特性，基于此种染料构建的适配体的免标记检测技术，无需特殊的荧光染料，也无需特殊的空间构象，因而应用范围十分广泛。然而上述两种染料都具有膜穿透性，当目标物为细菌、细胞时，则会与细胞核内的dna发生结合，从而对检测结果产生极大的干扰，因而不适合用于细菌或细胞的检测。
因此本发明中提出一种新型的荧光染料accublue，它不但具有在游离状态，与单链dna共存时只发出微弱的荧光，与双链dna共存时会与之发生结合使得荧光信号显著增强的特性，而且还不具有膜穿透性，从而不会与细胞核内的dna发生识别，因此可广泛的应用于构建不同物质的核酸适配体荧光检测中。该方法的建立，可为生物检测，食品安全、污染物分析，致病菌检测以及药物研究等领域提供一种快速、便捷、经济、高效的切实可行的检测方式，打开检测领域新一扇大门。
为了更为清晰的介绍本专利涉及的检测方法，本发明以动物源性食品中的恩诺沙星的检测为示范例进行试验，实验结果表明，动物源性食品（奶粉、牛肉、虾肉）中的恩诺沙星残留检测线性范围为20～1000μg/l，检出限为9.96μg/l。检测方法可用于恩诺沙星的检测。该方法因利用新型荧光染料accublue，具备经济、快速、灵敏、准确等优点，可广泛用于检测各类食品危害物，为保障食品安全提供了新思路，新方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提出一种新型荧光染料，可应用于核酸适配体检测法中。该染料可与核酸适配体发生高亲和高特异性的结合，用于检测多种物质。
为实现上述目的，本发明是通过以下的技术方案实现的。其特点是：
适配体与目标物在室温下孵育一段时间后形成适配体-目标物的复合物，接着将与适配体互补的dna和accublue染料加入到该复合物中，这样未能与目标物结合的游离的适配体则会与互补dna杂交形成双链dna(dsdna)，accublue染料能够插入到dsdna中从而引起荧光信号的显著增强。理论上，目标物的浓度越高，体系中未能与目标物结合的游离的适配体则越少，这样能够与互补dna杂交形成的dsdna也就越少，使得插入到dsdna中的accublue染料也越少，从而荧光信号就越小，据此可进行定量分析。
其中所述适配体包括但不局限于人工合成或pcr扩增后单链化获得。
所述目标物包括但不局限于蛋白质、有机物、生物污染物、抗生素，腺苷，毒素、致病菌等。
本发明的优点：
本发明所述的检测方法中的核酸适配体可因目标物的改变而改变，核酸适配体的来源可根据使用者的需求进行定制或筛选，具有灵活的可变范围。
accublue作为一种无膜穿透性的荧光染料，可与核酸适配体进行高亲和力结合，不仅适用于蛋白质、有机分子、无机分子等的检测，还可应用于细胞或致病菌等的检测，检测方法适用性更加广泛。
基于accublue的核酸适配体检测方法简单便捷，应用范围广，灵敏度高，造价低，经济适用。
附图说明
结合附图对本发明是具体实施方式进行进一步详细说明
图1.基于核酸适配体与荧光染料accublue检测恩诺沙星的原理图
图2.本发明方法检测不同浓度的恩诺沙星与荧光变化的线性曲线图
具体实施方式：
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
以下实例将本发明的操作方法进行具体化，但不能作为本发明的限定。
实施例1：本发明的检测方法在检测恩诺沙星中的应用
将恩诺沙星配成1g/l的enr母液备用。然后分别稀释成质量浓度为0，20，50，100，500，1000和2000μg/l的溶液。取10μl不同浓度的enr溶液与10μl10nmol/lenr核酸适配体-2溶液在孔内混匀，25℃孵育10min，再加入10μl10nmol/l互补链dna-2溶液，25℃继续反应10min，然后加入200μlaccublue溶液，检测荧光强度。当enr核酸适配体的量一定时，enr浓度越大，体系中能与互补链结合的核酸适配体就越少，形成的dsdna越少，accublue识别dsdna产生的荧光强度f值就越小。溶液中没有enr药物存在时，核酸适配体完全与其对应的互补链结合，荧光强度f0最大，f0为定值，f/f0的值与f值的大小成正比，f越大，f/f0就越大。因此，在最优的实验条件下，该方法的标准曲线为y=-0.1868x+1.186（如图2），r2=0.9457。检出限为9.96μg/l，线性范围为20～1000μg/l。
所述基于新型荧光染料accublue的核酸适配体检测动物源性食品中恩诺沙星的方法中，所述的恩诺沙星适配体序列为：
5’-cccatcagggggctaggctaacacggttcggctctctgagcccgggttatt
tcaggggga-3’；由生工生物工程(上海)有限公司合成。
实施例2：本发明的检测方法在检测奶粉、虾肉和牛肉中恩诺沙星的应用
奶粉：称取脱脂奶粉5.0g，加入10ml的1×pbs，放置于25ml的离心管内，14000rpm离心20min，取出上清作为空白样品。
虾肉和牛肉：选取可食用部分剁碎混匀，准确称取5.0g肉样，加入无水硫酸钠5.0g研磨，研磨均匀后倒入10ml离心管中，加入提取溶剂(4ml乙腈、0.04ml冰乙酸)，高速涡旋2min，于3000rpm离心12min，取出上清液；将残渣重复上述操作再提取1次，合并上清液，用氮气吹干，再用tris缓冲液溶解残渣，备用。
向空白样品中添加恩诺沙星终浓度为200μg/kg、500μg/kg、1000μg/kg和每个浓度作3个平行，经优化好的方法处理后，测定荧光强度值，每次测定重复3次。根据公式计算添加回收率。检测结果如表1所示。
表1荧光法测定样品的加标回收结果(n=3；µg/kg)
技术特征：
1.一种新型荧光染料accublue在核酸适配体检测中的应用，其特征在于包括以下内容：适配体与目标物在室温下孵育一段时间后形成适配体-目标物的复合物，接着将与适配体互补的dna和accublue染料加入到该复合物中，这样未能与目标物结合的游离的适配体则会与互补dna杂交形成双链dna(dsdna)，accublue染料能够插入到dsdna中从而引起荧光信号的显著增强。
2.理论上，目标物的浓度越高，体系中未能与目标物结合的游离的适配体则越少，这样能够与互补dna杂交形成的dsdna也就越少，使得插入到dsdna中的accublue染料也越少，从而荧光信号就越小，据此可进行定量分析。
3.根据权利要求1所述的一种新型荧光染料accublue在核酸适配体检测中的应用，其特征在于：
（1）新型荧光染料accublue具有在游离或是与单链dna共存的情况下，只发出微弱的荧光，而与双链dna共存时，荧光强度显著增强的特性，且不具有膜穿透性。
4.（2）其中所述适配体包括但不局限于人工合成或pcr扩增后单链化获得。
5.（3）所述目标物包括但不局限于蛋白质、有机物、生物污染物、抗生素，腺苷，毒素、致病菌等。
技术总结
本发明涉及一种新型荧光染料AccuBlue在核酸适配体检测法中的应用。将荧光染料AccuBlue在自身游离状态，或与单链DNA共存时只发出微弱的荧光，与双链DNA共存时会与之结合使得荧光信号显著增强的特性，与核酸适配体的高亲和力和高特异性的特性结合，建立基于AccuBlue的核酸适配体检测方法。同时，由于AccuBlue不具膜穿透性，不会与细胞核内的DNA发生识别，不会发生干扰反应，本发明所述方法可应用于生物检测，食品安全、污染物分析，致病菌检测以及药物研究等多个领域，对无机有机分子、蛋白质、致病菌、生物毒素等进行高效、快速、特异性强的检测。本发明所述方法克服了现有技术造价高，干扰大，应用范围有局限性的不足，具有简单便捷，应用范围广，灵敏度高，造价低，经济适用的优点。
技术研发人员：王向红;张雪娇;郝怡环;桑亚新
受保护的技术使用者：河北农业大学
技术研发日：.08.09
技术公布日：.02.21
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