【编者按】干扰素-γ（IFN-γ）传统上被认为是一种炎性细胞因子，在抗肿瘤免疫中起着核心作用。虽然它已被临床用于治疗多种恶性肿瘤，但在肿瘤微环境（TME）中低水平的IFN-γ增加了免疫治疗过程中肿瘤转移的风险。越来越多的证据表明IFN-γ可以诱导肿瘤的进展，然而其背后的机制尚不清楚。今年7月，Cancer Research（IF＝8.378）发文首次揭示了IFN-γ以剂量依赖方式诱导肿瘤干性以及加速多种癌症类型患者的肿瘤进展。
研究发现，低水平的IFN-γ通过细胞间粘附分子-1(ICAM-1)-PI3K-Akt-Notch1轴诱导肿瘤干细胞特性，而高水平的IFN-γ通过激活JAK1-STAT1-半胱氨酸蛋白酶途径诱导非小细胞肺癌（NSCLC）凋亡。ICAM-1的抑制消除了低剂量的IFN-γ在体内外诱导的NSCLC细胞的茎样特性。该项研究创新性地发现了IFN-γ以一种剂量依赖方式激活不同信号通路来调控肿瘤细胞的干性形成和凋亡，并提出ICAM-1可作为TME中低表达IFN-γ患者的治疗靶点，为肿瘤治疗提供了新的见解[1]。
【研究背景】
（1）IFN-γ被广泛认为是一种重要的抗肿瘤细胞因子，主要由活化的T细胞、NK细胞和NKT细胞产生。在与异源二聚体IFNGR1/IFNGR2受体复合物结合后，IFN-γ启动下游信号转导事件的激活级联，特别是经典的JAK-STAT信号转导，以及多个IFN-γ诱导基因的转录，这两者都能诱导肿瘤细胞的细胞周期阻滞和凋亡[2]。
（2）然而，矛盾的是，有研究报道IFN-γ信号通过诱导炎症反应、免疫抑制或其他未知机制来促进肿瘤的发生和转移。小鼠模型中，持续低水平的IFN-γ促进了多种类型肿瘤的发展。（3）临床上，虽然IFN-γ已被用于许多抗癌临床试验，但在肿瘤部位产生的低水平IFN-γ已被证明在免疫治疗过程中增加了肿瘤转移的风险。不幸的是，在这些先前的研究中，IFN-γ介导癌症进展的分子机制没有完全表明。（4）值得注意的是，最近的研究描述了IFN-γ与肿瘤干细胞（CSC）之间的密切关系。IFN-γ能够诱导SCs休眠和转移性CSCs的产生。研究表明，IFN-γ可能通过诱导肿瘤细胞干性参与肿瘤进展，但其确切机制尚不完全清楚。（5）据报道，CSCs在多种癌症类型的肿瘤发生、转移、复发和多药耐药中起着关键作用。CSC是自我更新的、多能的、免疫特权的、高致瘤性和长寿的恶性细胞的一小部分。高度保守的信号通路，如Notch和/或Wnt通路的持续激活，部分决定了CSC的茎样特性和致瘤性。此外，上皮-间充质转化（EMT）也被证实为CSCs的一个特征，EMT是在肿瘤侵袭和转移过程中经常被激活的一个重要的发育过程[3]。
（6）最近，建立了“CSC免疫学”的新概念，它是指CSC的特性需依赖于特定的免疫环境[4]。研究表明，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可分泌CXCL12、IL6和IL8，通过上调NF-κB来促进肿瘤细胞的干性，而MSCs分泌IL6来吸引更多的MSCs，同时还产生拮抗剂Gremlin1，以促进未分化状态。周围肿瘤细胞产生IL4募集Th2，产生TNF-α上调NF-κB信号通路，促进肿瘤微环境的形成，而肿瘤细胞产生M-CSF、GM-CSF和G-CSF，从而诱导肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、髓源性抑制细胞(MDSCs)、肿瘤相关中性粒细胞(TANs)和树突状细胞(DCs)的扩增。TAM产生TNFα和TGF-β，促进NF-κB依赖或转TGF-β依赖的EMT，从而增强CSC的可塑性。TGF-β还可以直接与NF-κB信号通路相互作用，进一步增强癌细胞的干性，而由TAMs产生的TGF-β募集了Treg细胞。 此外，TAM，Treg和缺氧环境通过抑制CD8+T细胞和NK细胞的细胞毒性和巨噬细胞吞噬功能来抑制免疫监测。同时，低氧增加ROS，促进肿瘤细胞存活，并通过TGF-β信号通路诱导EMT。低氧和ROS均可诱导CSCs表达HIF-1α，直接促进EMT。此外，缺氧还通过下调c-Myc表达抑制细胞增殖，增强肿瘤细胞干性。低氧通过促进TGF-β和Wnt信号通路促进未分化状态，进一步促进癌细胞的干性。在缺氧条件下，内皮细胞产生TF促进血管生成。CSCs和肿瘤相关成纤维细胞（Cancer associated fibroblast，CAFs）产生CXCL12促进血管生成，缺氧使CSCs和内皮细胞产生VEGF，进一步诱导血管生成。CAF产生TNC（体内粘合素-C）和HGF（肝细胞生长因子），以增强用于维持CSC特性的Wnt和Notch信号通路。CAF还产生MMP（基质金属蛋白酶）2、3和9，与CSC产生的MMP10一起，这些MMPs促进ECM降解和重塑，从而增强EMT和CSC状态[5]。
（7）细胞间粘附分子-1(ICAM-1)是一种跨膜分子，是由白细胞、内皮细胞和上皮细胞表达的免疫球蛋白超家族的成员，参与许多重要的过程，包括白细胞内皮细胞移位，细胞信号转导，细胞-细胞相互作用，细胞极性和组织稳定性。细胞间黏附分子-1(ICAM-1)可被脂多糖和一些炎性细胞因子如IFN-γ和TGF-γ上调。ICAM-1在多种肿瘤中的促瘤作用已被证实，最近被用作晚期甲状腺肿瘤的工程嵌合抗原受体T细胞治疗的靶点，以及肝细胞癌(HCC)和食管鳞状细胞癌(ESCC)的CSCs标志物。在肺癌中，ICAM-1在CSCs中高表达，并负责肿瘤的发生和转移。这些研究支持ICAM-1在调节肿瘤细胞干性和进展中的潜在作用。【研究结果】一、非小细胞肺癌患者低水平IFN-γ表达与肿瘤干性相关
首先通过IHC染色研究了86例NSCLC组织中IFN-γ的实际分布情况（图A），发现在NSCLC组织中，低水平的IFN-γ表达占大多数（图B）。此外，低水平的IFN-γ表达与肿瘤的TNM分期、脑转移、化疗耐药密切相关，且低水平IFN-γ组的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）也比阴性组和高水平IFN-γ组短（图C，D）。通过IF染色发现，在NSCLC组织中，IFN-γ低的TME的肿瘤细胞上CD133（NSCLC中CSCs的标志物）和Vimentin（EMT的标志物）的表达远高于IFN-γ高的TME的肿瘤细胞（图E，F）。同时，通过IHC分析，86例NSCLC组织中IFN-γ与CD133或Vimentin呈显着负相关（图G，H）。
有趣的是，研究发现TIF中IFN-γ相对较低（约0.137ng/mL）的患者表现出肿瘤干细胞特性的增加，而IFN-γ含量为0.110ng/mL的患者（#4）表现出最高的CD133+干细胞百分率和最高的干性相关基因的表达。然而，在TIF中有高水平IFN-γ的患者表现出减少的茎样特性（图I）。综上提出初步假设：低水平的IFN-γ可能是诱导肿瘤干性的关键决定因素。
二、低剂量IFN-γ增强非小细胞肺癌细胞的干细胞特性
为了阐明低水平IFN-γ在诱导肿瘤干性中的作用，用不同剂量的重组人IFN-γ处理NSCLC细胞株A549和H460，共1-6天。正如预期的那样，随着IFN-γ剂量和处理时间的增加，细胞凋亡逐渐增加（图A）。有趣的是，研究发现在用相对低剂量的IFN-γ（≤0.2ng/mL）处理后，Annexin-V-CD133+细胞的频率随着时间的推移而显着增加，然而，在用相对高剂量的IFN-γ（≥100ng/mL）处理后，AnnexinV-CD133+细胞的百分比随着时间的推移而下降（图B），最后通过体外实验（3D培养（图C）、Western Blot检测CSC标志物（图D）及PCR检测干性相关基因表达（图E））及体内实验（图F-H）结果证实了低剂量的IFN-γ促进了NSCLC肿瘤细胞干性。
三、ICAM-1介导低剂量干扰素-γ诱导的非小细胞肺癌细胞的干细胞特性
为了探讨低剂量IFN-γ诱导NSCLC肿瘤细胞干性的分子机制，通过使用GCBI数据库搜索IFN-γ信号传导下游基因，采用RT-PCR检测下游基因在使用或不使用低剂量IFN-γ的A549和H460细胞中的不同表达水平。结果显示大多数下游基因，包括IFNGR1和IFNGR2，都显着上调，其中，ICAM-1对低剂量IFN-γ的基因表达上调最为明显（图A），并通过流式检测加以验证（图B）。此外，免疫荧光共定位分析显示ICAM-1在A549细胞中与CD133和Vimentin共表达，低剂量IFN-γ作用下显着增加（图C）。提示ICAM-1可能是低剂量IFN-γ诱导NSCLC肿瘤细胞干性所必须的。随后，采用IFN-γ联合或不联合ICAM-1抑制剂silibinin或ICAM-1-shRNA，通过体外实验（3D培养（图D、H）、Western Blot检测CSC标志物（图E、G）及PCR检测干性相关基因表达（图F、I）加以验证。
四、低剂量IFN-γ通过ICAM-1-PI3K-Akt-Notch1轴诱导非小细胞肺癌细胞干性和高剂量IFN-γ通过JAK1-STAT1-Caspase途径介导细胞凋亡
为了探索了低剂量IFN-γ介导的肿瘤细胞干性所涉及的信号通路，作者选择了几种CSC相关的信号激活抑制剂，包括PI3K，Akt，Notch1，STAT3，p38和ERK1/2抑制剂，预处理A549和H460细胞后1h使用低剂量IFN-γ。
有趣的是，RT-PCR结果显示，与DMSO相比，没有任何抑制剂对ICAM-1的表达产生明显影响，但PF04691502，AZD5363和LY3039478部分逆转了A549和H460细胞升高的肿瘤干性（图A、B）。流式细胞术和Western Blot分析也观察到类似的结果，表明PF04691502，AZD5363和LY3039478对低剂量干扰素-γ处理的A549和H460细胞中ICAM-1的表达没有影响，但与DMSO（二甲基亚砜）处理组（阳性对照）相比，显着地阻断了CSC标志物的表达增加（图C、D）。综上假设PI3K-Akt和Notch1通路可能作为ICAM-1的下游信号通路参与低剂量IFN-γ诱导NSCLC肿瘤细胞干性。
随后的Western blot分析显示，与对照组相比，低剂量IFN-γ处理后Akt和Notch1的激活显着上调，而silibinin或ICAM-1-shRNA对ICAM-1的抑制可以有效地减少活化（图E、F）。随后通过PROMO网站预测CD133启动子的结合位点，并采用ChIP验证Notch1直接调控NSCLC中CD133的转录（图H、I）。
接下来，文章还探索了与低剂量干扰素γ相比，高剂量IFN-γ处理的细胞表现出更高的JAK1，STAT1，caspase3和caspase7活性（图J），在用不同剂量的IFN-γ处理后，发现ICAM-1敲除对A549和H460细胞的凋亡没有影响（图K），而JAK1，STAT1，caspase3和caspase7的激活随着IFN-γ剂量的增加而增加（图L）。
此外，抑制JAK1(Ruxolitinib)，STAT1(氟达拉滨)和caspase(Z-VAD-FMK)显着减弱高剂量IFN-γ介导的凋亡（图M）Western blot分析表明，p-JAK1表达仅被Ruxolitinib抑制，p-STAT1表达被Ruxolitinib和Fludarabine抑制，而caspase 3和7被Ruxolitinib，Fludarabine和Z-VAD-FMK抑制（图N）。综上表明高剂量IFN-γ通过ICAM-1依赖性方式激活JAK1-STAT1-Caspase信号通路，促进NSCLC细胞凋亡。
五、低剂量IFN-γ以ICAM-1依赖的方式促进非小细胞肺癌的肿瘤生长和肺转移
接下来，作者进一步用NOD-SCID小鼠作为另一种动物模型来评价低剂量IFN-γ的促瘤效应和ICAM-1在这一过程中的作用。通过稳定建立荧光素酶-shScramble感染（对照）、荧光素酶-shICAM-1感染细胞系，并将其皮下注射到NOD-SCID小鼠体内。每组小鼠进一步瘤内注射PBS或低剂量IFN-γ。我们发现shICAM1细胞异种移植肿瘤生长明显低于shScramble细胞的异种移植肿瘤（图A、B）。
此外，低剂量IFN-γ处理可显着提高shScramble细胞异种移植瘤中ICAM-1+CD133+肿瘤细胞量，但对shICAM-1细胞异种移植瘤中的ICAM1+CD133+肿瘤细胞无明显影响（图C），通过IHC染色，ICAM1，CD133和Vimentin的表达也得到了类似的结果（图D-G），说明ICAM-1对于低剂量IFN-γ介导的免疫缺陷小鼠的肿瘤生长是必不可少的。同时，还研究了低剂量IFN-γ对NSCLC细胞转移生长的影响以及ICAM-1在这一过程中的作用（图H-K），结果表明，低剂量IFN-γ在体内亦可通过ICAM-1介导NSCLC细胞的肺转移。
六、CD133+肿瘤细胞显着上调ICAM-1，后者与非小细胞肺癌患者不良预后密切相关
最后，作者检测了ICAM1在临床样品中的表达水平。流式细胞术分析显示NSCLC患者肿瘤组织的肿瘤细胞ICAM-1的表达高于邻近正常组织的上皮细胞（图A），与CD133-肿瘤细胞相比，CD133+肿瘤细胞中ICAM-1+细胞的频率也显着升高（图B），IHC染色结果显示，86例NSCLC组织中ICAM-1与CD133（图C、E）和Vimentin（图D、F）呈强正相关。高水平ICAM-1患者的OS（图G）和PFS（图H）更差。值得注意的是，IFN-γ高ICAM-1高表达患者的OS（图I）和PFS（图J）比IFN-γ低ICAM-1高表达的患者更好，这支持了ICAM-1可能只在IFN-γ-低的而不是在IFN-γ高的TME中介导肿瘤进展或肿瘤干性的观点。
【研究结论】
（1）在非小细胞肺癌中，低剂量的IFN-γ较好地通过ICAM-1-PI3K-Akt-Notch1途径诱导肿瘤干性，而高剂量的IFN-γ主要通过JAK1-STAT1-半胱氨酸蛋白酶途径介导细胞凋亡；
（2）同时，ICAM-1的抑制有效地阻断了低剂量IFN-γ在体内外诱导的肿瘤细胞干性；
（3）首次揭示了IFN-γ诱导肿瘤干性的剂量依赖性效应，并以剂量依赖性的方式明确了IFN-γ激活的不同的分子机制。
【后语】
IFN-γ在调节抗肿瘤免疫中的作用目前是存在争议的，在肿瘤的早期阶段，往往是处于一种“热肿瘤”样的肿瘤免疫微环境，此时有大量CD8+T细胞、NKT细胞的浸润，通过分泌高水平的IFN-γ、颗粒酶来诱导肿瘤细胞凋亡和坏死。然而，随着肿瘤的发生发展，尤其是对于晚期肿瘤，肿瘤微环境中的CD8+T细胞大部分会逐渐发生T细胞耗竭，同时一些免疫抑制效应细胞浸润也开始增加，如Treg细胞，此时抗肿瘤免疫功能受损，IFN-γ分泌显着减少，不足以诱导大量肿瘤细胞凋亡，往往处于“冷肿瘤”样免疫抑制微环境，肿瘤出现进展，但其背后机制尚不明确。该文创新地揭示了IFN-γ会以一种剂量依赖方式激活不同信号通路调控肿瘤细胞的干性形成和凋亡，表明了IFN-γ在发挥抗肿瘤作用过程中存在两面性，即低剂量IFN-γ诱导CSC，而高剂量IFN-γ会诱导凋亡。值得注意的是，文章所使用的动物模型均是免疫缺陷鼠，可能也是考虑到在免疫活性鼠的许多细胞和组织也会产生未知的IFN-γ，很难精确控制IFN-γ表达水平。
该研究成果的发表有力的刺激“CSC免疫学”的进一步研究，CSCs很好地补充了现有的肿瘤免疫逃逸模型，连接着癌症免疫编辑的三大要素：消除、平衡和逃逸（即肿瘤复发），提高对肿瘤控制或逃逸机制的理解可能有助于设计合适的治疗策略。同时，CSCs也对化疗和放疗有高度的抵抗力。研究显示，放疗可诱导肿瘤微环境IFN-γ的产生，从而影响抗肿瘤免疫功能，那能否通过IFN-γ途径影响CSC干性，有待进一步研究。
撰稿/编辑：李上标/郑志浩
审校：朱晓霞
参考文献
[1] Song M, Ping Y et al. Low-Dose IFNγ Induces Tumor Cell Stemness in Tumor Microenvironment of Non-Small Cell Lung Cancer. Cancer Res. Jul 15;79(14):3737-3748.
[2] Platanias LC. Mechanisms of type-I- and type-II-interferon-mediated signalling.Nat Rev Immunol. May;5(5):375-86.
[3] Ruiu R, Tarone L, Rolih V et al. Cancer stem cell immunology and immunotherapy: Harnessing the immune system against cancer"s source. Prog Mol Biol Transl Sci. ;164:119-188.
[4] Bruttel VS, Wischhusen J. Cancer stem cell immunology: key to understanding tumorigenesis and tumor immune escape? Front Immunol. Jul 29;5:360.
[5] Plaks V, Kong N, Werb Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells? Cell Stem Cell. Mar 5;16(3):225-38.
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