肿瘤异质性经常被视为遗传进化的结果，但也有其他的机制，如：表观遗传修饰、转录变化和蛋白质水平或蛋白质修饰的改变肿瘤细胞和/或微环境。总体来说，异质性包括时间异质性和空间异质性。时间异质性是来自于原发灶和转移灶之间的异质性，比如原发为HER2-阴性乳腺癌患者存在HER2+转移灶。空间异质性指肿瘤存在不同的肿瘤克隆，在原发灶或者转移灶。通常组织活检是进行异质性分析的重要方法，但有一些区域如肺脏，大脑，骨骼比较难进行组织活检。液体活检，成为一种创伤小，不受取材区域限制的活检方法。液体活检，肿瘤细胞数量有限，故单细胞技术（基因水品和蛋白质水平）的发展，大大拓宽了液体活检的使用范围。
大约前，液体活检（liquid biopsy ，LB),概念出现，并逐渐被诊断和治疗的医师广泛接受。液体活检的样本来自于原发灶，转移途中的肿瘤，或者淋巴结及其他组织的转移灶。传统方法，因为分析手段的灵敏度不够，通常是样本富集后进行分析，富集样本的结果无法充分体现肿瘤异质性信息。
事实上，由于较小的亚克隆可能更难在同时携带不同数量白细胞进入CTC富集组分中检测，因此，分离单个CTC是检验肿瘤异质性的首选方法。随着过去5年来单细胞分析技术的发展，外周血单个细胞分辨率的CTCs分析可以提供一种独特的微创方法来描述和监测个体患者肿瘤异质性的动态变化，包括基因组，转录组，蛋白质组，功能等。除CTCS外，循环肿瘤DNA(ctDNA)分析已广泛应用于肿瘤治疗过程中基因组肿瘤的进化，通过广泛的测序工作来评估基因异质性。此外，血浆中的其他肿瘤衍生产物，如无细胞微RNA(MiRNAs)、细胞外小泡(Evs)或经肿瘤治疗的血小板，也具有潜在的临床意义。
液体活检分析的生物标志物类别
循环肿瘤细胞(CTCS)：CTCS从原发肿瘤中释放出来，转移到血液中。CTC可以通过使用针对细胞表面抗原的抗体(例如，EpCAM)或物理捕获装置，通过依赖标签和不依赖标签的方法来富集。CTCs的下游分析包括DNA、RNA和蛋白质水平的分子特征，以及利用细胞培养或CTC衍生异种移植(Cdx)进行的功能测试。
循环肿瘤DNA(CtDNA)：无细胞DNA(CfDNA)主要通过肿瘤细胞和正常细胞的凋亡或坏死而释放，但活性分泌可能发挥额外的作用。血液中cfDNA的大部分来源于造血细胞，但肿瘤源性cfDNA(CtDNA)的浓度很低(cfDNA的<5%到<0.1%)，这取决于肿瘤的类型和阶段。ctDNA可通过针对突变或结构基因组畸变的敏感分子检测。
无细胞微RNA(MiRNA)和其他非编码RNA(NcRNAs)：MiRNAs)和SiRNAs介导转录后RNA沉默；小核RNAs(SnRNA)调节剪接；小核仁RNA(NoRNA)参与核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)和snRNA处理P-element-induced-wimpy testis (piwi)-interacting RNAs (piwiRNAs）调节染色质修饰和转座子抑制。miRNAs和其他ncRNAs由肿瘤和宿主细胞通过细胞外小泡(EVS)或与血浆蛋白结合的方式释放到血液中。
细胞外囊泡（EVs)：EVs 包括所有任何细胞分泌或衍生的膜囊泡，它们在细胞- 细胞通信中发挥作用。外泌体和微囊泡是 EVS 的两大类，区别在于它们的释放机制，大小和内容物 (miRNA 、 mRNA 、 DNA 等) 。开发更好的分离技术，区分肿瘤来源和宿主细胞来源是现在主要考虑的方向。
肿瘤教育血小板：肿瘤细胞和血小板之间的交叉连通在肿瘤进展中起作用。血小板可释放RNA信号复合物通过微粒(血小板衍生微粒)到它细胞，占据了EVs的70-90%。肿瘤细胞可以直接刺激血小板蛋白合成和血小板信号传导，称之为肿瘤教育。已被用作液体活组织生物标志物。
循环肿瘤细胞单细胞分析精度的表征技术
DNA：从单个CTC中鉴定基因组通常需要全基因组扩增(WGA)才能产生足够数量的DNA模板；然而，WGA可能会产生技术伪像，例如等位基因脱落、覆盖缺失、覆盖均匀性降低或等位基因不平衡。第三代测序方法现在允许对非扩增的DNA进行测序，并将在未来有利于CTC的单细胞分辨分析。荧光原位杂交(FISH)允许直接显示特定的CTC表型与基因组畸变之间的联系，并首次用于评估循环细胞肿瘤起源。它可以直接应用于CTC富集样本，而不需要进行单细胞分离来分析它们的遗传异质性。原位DNA测序方法在这一意义上也是很有吸引力。如果有足够的DNA，最近的技术可研究表观遗传水平异质性，包括通过启动子甲基化分析、核小体定位或单细胞中的高级染色质构象。
RNA：单细胞 RNA 测序方法包括逆转录、 cDNA 扩增和测序文库准备工作。逆转录过程中高表达转录本的捕获和 3 ‘覆盖偏差是当前的限制。转录后，必须扩增微小的 cDNA ，这可能导致扩增偏差；在外部 mRNA 的反向转录或插入过程中使用独特的分子标识符(“条形码”) 可以改善这种情况，提高mRNA 分析的质量。大多数研究仅限于 mRNAs ，尽管小的非编码 RNA 代表另一个重要调控水平。
蛋白质：免疫细胞化学方法检测CTCs中的多种蛋白仍具有挑战性，主要是由于敏感性和交叉反应性问题。最近，单细胞western blot分析允许在一个CTC中同时测定12种蛋白，流式细胞术与质谱相结合可以在单细胞分辨率对40种以上的蛋白质进行检测。
代谢物：代谢重编程是癌症的一个标志，但由于其极端动态和不稳定的特性，在单个细胞中仍然很难研究。然而，在微流控装置中，pH值波动或乳酸浓度的检测已经被用来鉴别假定的CTCs，而不需要进行表面抗原标记。
不同的肿瘤细胞传播途径对异质性的贡献
肿瘤细胞在原发病变中的传播通常表现为通过淋巴管进入区域淋巴结，或通过血管直接扩散到肺、肝、脑或骨骼等遥远的部位。然而，最近两项利用基因工程小鼠乳腺癌模型的研究表明，这两种传播途径可以同时发生。肿瘤细胞可以侵入淋巴结内的血管，通过进入血液循环退出淋巴结，然后继续传播和定植肺部。这种转移扩散的新途径为关于淋巴结在癌症进展中的作用的长期争论带来了有趣结果，因为它暗示了区域淋巴结可以是远处转移的潜在种子。另外，用受影响的淋巴结进行肿瘤扩散的微创检测 。此外，开拓性的工作表明，肿瘤细胞的传播不一定是从原发肿瘤到淋巴结和/或远处部位的单向过程，因为CTCs可以再循环回到其肿瘤生长的原始部位，这是一种称为肿瘤自种的现象，肿瘤肿块之间进行双向肿瘤细胞交换，是异质性的另一个动态成分。
肿瘤细胞可以通过与原发肿瘤内转移的肿瘤微环境(TMEM)相互作用进入血管，从而促进肿瘤细胞进入血管。然而，不能排除肿瘤细胞也可以随机进入循环，从而导致CTCs数量的巨大异质性。肿瘤和器官特异性血管壁组合物,及血管分布的解剖因素，比如血-脑屏障的影响。血-脑屏障似乎阻碍了CTCS和CTDNA向外周血中的释放，如与其他转移性部位相比，脑转移患者的检出率较低。尽管如此，即使在胶质母细胞瘤等原发性脑肿瘤患者中，CTCs也能跨越血脑屏障。这种传播途径在胶质母细胞瘤患者中的生物学意义仍有争议。颅内外转移的罕见发生可能是由于CTCS的转移起始特性不足或诊断为这种致命肿瘤的患者的平均寿命短所致。尽管如此，在小鼠胶质母细胞瘤模型中的实验数据表明，CTCs具有肿瘤干细胞样表型，并通过肿瘤自体播种促进局部肿瘤的发生和复发。因此，可以推测脑肿瘤细胞可能很好地适应大脑的特定微环境，而它们可能具有较低的可塑性以适应颅外器官的微环境条件。总的来说，尚不清楚是否所有器官都以相同的频率释放CTC，肿瘤微环境在何种程度上发挥了决定CTC释放速率的作用。
通过单细胞分析血液中循环肿瘤细胞异质性
另一个导致CTC异质性的实质性原因是癌细胞的多种侵袭和传播策略。肿瘤细胞可以作为单个细胞传播，例如通过间充质或阿米巴单细胞迁移，或者通过集体迁移作为簇，其中细胞- 细胞粘附保持完整。相反，这些不同的传播机制也可能导致肿瘤异质性。最具特征的传播机制是单细胞。上皮间充质转换(EMT)在获得侵袭性和运动性表型方面的贡献已被广泛报道，但在基于捕获上皮细胞粘附分子(EpCAM)等上皮抗原的ctc富集方法方面引起了争议。此外，在肿瘤进展中，也描述了第二种类型的运动转移，即间充质-阿米巴转变。阿米巴样单细胞迁移是典型的骨髓性白血病和淋巴瘤细胞、小细胞肺癌和小细胞前列腺癌，最近在黑色素瘤中观察到。而间充质迁移是由肌动蛋白聚合(由RAC活性驱动)驱动的，并且需要基于整合素蛋白的细胞-胞外基质粘附和基质金属蛋白酶的活性，阿米巴迁移独立于蛋白水解基质降解和与细胞外基质的粘附，但需要增强的细胞收缩性(由RhoA活性驱动)
CTC簇是一个新兴的研究方向。肿瘤患者不同类型的外周血ctcs聚集，但频率低于单个CTCs，而在上皮性肿瘤的原发病变中，集体迁移比单细胞移动更明显。团簇可能是在进入血液之前预先形成的，或者它们可能聚集在血流中。早期癌症患者的外周血中簇很少，这与团簇可能被困在肺和远隔器官的小毛细血管有关。EMT在CTC簇形成中的意义还不十分清楚。在对2例乳腺癌患者的一项原理性研究中，描述了间充质标记强阳性和上皮标记弱阳性。然而，其他的研究表明，编码细胞-细胞连接蛋白的基因在CTC簇中有很高的表达.例如，匹配的ctc簇和单个CTCs的RNA测序分解了31个CTC-簇相关基因，其中编码连接蛋白plak红蛋白的基因似乎是簇形成所必需的。此外，一种谱系追踪肿瘤模型揭示了EMT在多个癌组织中的保守性，包括上皮蛋白的重新定位，而不是转录抑制。
这一替代方案导致部分EMT出现新表型，促进集体肿瘤细胞迁移和形成CTCs簇。单个CTCS和CTC簇的DNA甲基化情况表明，与干细胞(Oct 4、Nang、sox 2和sin3a)和增殖相关的转录因子的结合位点在CTC簇中是被甲基化的，因此转录激活了。重要的是，作者建立了细胞连接成分的高表达与保留促进转移的干细胞样特征的能力之间的联系。有趣的是，美国FDA批准的药物能够分解CTC簇，从而减少转移。在一个单独的研究中，在CTC簇内的细胞连接和干细胞特性之间的联系。干细胞标记 CD 44 介导细胞间 CD 44 - CD 44 同质蛋白相互作用，参与细胞簇形成，随后 CD 44 - PAK2 相互作用激活 FAK 信号，另一种分子途径在肿瘤干细胞中起作用。总体而言，集群内的表型异质性似乎为在遥远的地点进行定植提供了生存优势。有簇的病人的预后确实更差。CTC簇的基因组组成可能对肿瘤异质性起作用。小鼠的细胞标记和混合研究表明，几乎所有CTC簇似乎具有低克隆性，而不是来源于单个迁移细胞的后代。例如，未来的挑战将是了解 CTC簇是否会增加癌症患者的肿瘤异质性。
CTCs鉴定转移起始细胞的表型特征
在远处部位开始转移定殖的那些CTCs，即循环癌症干细胞或转移起始细胞的鉴定是至关重要的。因此，应在转移能力方面对CTCS的表型进行分析。一些研究已经建立了干细胞与干细胞属性获取之间的联系，干细胞标记物(例如CD44)富集在具有不同肿瘤实体中的间充质特性的CTCs亚群中，在CTCs中引入另一个异质性水平。重要的是进一步评价CTCs在早期癌症患者中表达干细胞和EMs生物标志物的预后作用，并将数据与转移复发的临床结果联系起来。
还可能解开转移形成分子通路，使用CTC-衍生异种移植物(CDXS)或CTC衍生细胞系。然而，这些模型仍然难以反映通常在血液中有非常高水平的数百个CTCs，这些见于恶性的非小细胞肺癌患者（SCLC）较其他癌症患者平均多10倍以上CTCS。尽管如此，CDXS可以反应乳腺癌转移起始细胞的表型，如：表达EpCAM、CD44、CD47的CTC人群MET（因此，具有混合的、部分急救表型）引起骨、肺和肝转移，或表达HER2、表皮生长因子受体的CTCs（EGFR）、肝素酶和Notch1作为脑转移引发因素。比较乳腺癌患者脑转移相关ctc富集组分和其他转移部位ctc谱的表达谱，进一步证实Notch信号在脑转移中的重要性。
在结直肠癌中，表达血小板生成素受体的CTC由于其赖氨酸分解代谢的增强而表现出较强的肝定向性，并提示调节能量代谢和DNA修复的基因参与转移的发生和形成。对乳腺癌患者表达干细胞标记CD 44的CTCs的丰富组分进行转录分析，发现其代谢和/或有丝分裂活性降低，可能使CTCs在循环中存活。蛋白泛素化被鉴定为重要的调节途径，其对于来自黑色素瘤CDX的骨髓DTC的转移相关状态是重要的。总之，这些例子突出了CDX或ctc衍生细胞株在了解转移的开始和确定新的潜在治疗策略方面的潜力。重要的是，这些模型也可能有助于研究肿瘤的自然或治疗诱导的基因组进化和异质性的发展，只要它们是人类肿瘤的代表。然而，其它参数可确定癌症患者中转移的异质性模式，并使用CTCS研究其中的一些。在实验研究中探讨了与CTCs外渗有关的机制：例如，不同器官中的血液循环模式、靶器官毛细血管壁的结构、在ctcs粘附和滚动中起作用的分子或内皮连接中断等因素如何影响CTCs的外渗。此外，ctcs的取向还会受到肿瘤微环境“生态位”的影响，这些微环境允许需要适应这些条件的dtc的定植和生长。
从CTC基因分型特征了解肿瘤演化
肿瘤异质性被认为是肿瘤进化和耐药机制的出现的“燃料”，并且针对这一进化设定治疗策略。迄今为止，针对肿瘤异质性的综合研究依赖于分析来自多个活检点的数据。因此，关键的问题是CTCS的基因分型是否可以用来再现肿瘤异质性，但这需要克服CTC稀缺和样品量少的测序挑战。事实上，许多基因组研究都是针对ctcs的富集组分进行的。例如，在骨髓瘤中，骨髓肿瘤细胞和ctcs似乎具有相似的克隆结构，但是骨髓肿瘤细胞和ctcs之间不一致亚克隆突变致也被发现了。
随着以高精度的单细胞分辨率分离、鉴定和测序CTCs整体外显子的复杂集成技术的发展，在两例前列腺癌患者中，对单个CTCs和原发肿瘤的多个区域进行了比较。这个概念的证明数据表明CTCs的突变谱和明显的转移与一种特殊的转移非常相似原发肿瘤的区域，可能是潜在的转移-起始区。在某些情况下，可能更容易从CTCs区分肿瘤异质性，而不是原发肿瘤：例如，使用诊断性白细胞清除术(DLA)，对数百个ctc进行分析，发现了一个明显的肿瘤异质性，包括亚克隆拷贝数改变(Cnas)，肿瘤活检的大量分析不容易区分。
最近对转移性乳腺癌患者的单个和混合CTCs进行了个基因的测序。与转移性组织的对照显示，至少一个或多个反复的体细胞突变和CNA符合率为85%。总体上,这些数据支持CTC测序可以提供关于异质性的重要信息和转移性进化，可能会显示可用于预防或治疗转移漏洞。比较原发性肿瘤和转移的研究表明，转移扩散可以通过多个进展模型(平行进展和线性进展)和不同的方向(从原发肿瘤到转移，也可以双向地通过肿瘤生长的局部部位自我播种），在特定的肿瘤类型内，甚至在个别癌症患者中发生。这些研究也趋向于在转移形成过程中出现大的染色体畸变或CNAs的宏观进化转变的想法。在最近的一项试验研究中，CTCs的单细胞测序揭示了CNAs从原发肿瘤到CTCs的趋同进化，这一观点支持了转移传播不是随机过程的观点。在另一项针对结直肠癌患者的研究中，通过分析不同血液室中CTCs的存在情况以及肝和肺明显转移的模式，成功地识别了复发的染色体畸变并与转移级联的不同阶段相关。
肿瘤的定性演化(即时间和空间异质性)。
主要参考文献
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