单细胞空间蛋白组分析是一项基于荧光标记抗体染色的超多标组织成像技术，该技术将多重蛋白表达谱的定性、定量信息与单细胞组织原位信息进行整合，可在一张病理切片上基于组织及细胞原位对多达60 种蛋白进行多种分析。
非因生物建立的单细胞空间蛋白组分析平台为临床病理组织的空间细胞生物学和蛋白功能深度分析提供了全新的分析手段，平台拥有350+ 经严格验证的抗体资源库，支持结合研究方向和研究热点设计灵活的整体实验方案，是肿瘤微环境、免疫学肿瘤生物学、神经生物学、病理标志物诊断的全新研究利器。
下面，我们通过一篇分析研究案例，来展示单细胞空间蛋白质组学分析的应用场景和应用价值，以及结合其他组学技术进行肿瘤微环境研究和新型诊疗标志物发现的研究模式。
01
研究背景
乳腺癌在形态学和分子水平上都存在瘤间异质性。代谢研究分析了2509例乳腺癌的体细胞突变、拷贝数改变和基因表达，并揭示了它们比以前所知的更具异质性，有10种临床上不同的亚型(1)。肿瘤异质性沿着两个轴发展：时间和空间。发生在同一肿瘤的不同区域的异质性被称为肿瘤内或空间异质性(2)，这种空间异质性可能是肿瘤治疗反应不佳的原因。时间异质性是指随着时间的推移，遗传多样性的程度不断增加。在乳腺癌中，这发生在三个转变过程中：原位癌到浸润性乳腺癌；原发性浸润性癌的演变；以及从原发性乳腺癌进展到转移性乳腺癌(3)。许多研究报道了导管癌主要克隆丰度的变化原位到浸润性导管癌，以及从原发癌到转移癌(4–9)。循环肿瘤细胞(CTC)被认为是最早可检测到的具有转移潜能的细胞；然而，由于空间和时间的异质性，CTC不能代表整个肿瘤。此外，全身性治疗在亚克隆细胞群上诱导影响肿瘤进展的选择压力(10)。与最初的诊断样品相比，治疗后的肿瘤在组成和行为上可能显著不同(11, 12)。
三阴性乳腺癌（TNBC，雌激素、孕酮和 HER2 受体表达阴性）是诊断时经常观察到转移的最侵袭性亚型之一，TNBC可以进一步分为多个亚类。TNBC具有显著的肿瘤内异质性、高突变负荷和广泛的基因组改变（13-16）。它们通常具有明显的免疫细胞浸润。一般来说，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的存在与良好的生存结局有关，尽管特定的亚群由于其抑制其他TIL的抗肿瘤功能的能力而与较差的生存率有关（17）。
02
研究目的
研究者之前使用高分辨率拷贝数分析对乳腺癌患者的CTC进行了表征（18）。研究者确定了在CTC中反复获得的90个基因组区域的特征基因集，这些基因大多数区域位于19号染色体上。目标是确定肿瘤细胞与CTC在患者原发性肿瘤和转移，治疗前后的比例;并识别这些区域中可能与转移过程相关的驱动基因。此外，鉴于肿瘤内异质性在乳腺癌中的重要性，以及癌症免疫治疗的重要性日益增加，研究者的第二个目标是研究TNBC中的肿瘤异质性（通过多光谱FISH和多重免疫荧光评估）是否与TIL浸润程度和总生存率相关。
03
实验设计
研究者选取原发性肿瘤及转移性肿瘤病例，利用多光谱FISH 分析、MxIF 等技术揭示了遗传亚克隆的功能潜力，这些亚克隆包含异质性原发性乳腺癌，并被选择用于CTC和治疗后乳腺癌转移。此外，他们揭示了肿瘤微环境中肿瘤异质性和宿主免疫反应之间的关系。
肿瘤异质性评价
肿瘤免疫微环境评价--单细胞空间蛋白质组分析（MxIF技术）
04
研究结果及研究结论
为了确定感兴趣区域的优先级，研究者进行了三种过滤方法，从CTC中90个经常获得的区域以及这些区域中的1，386个基因中进行选择（18）。研究者使用Oncomine基因表达数据库从125个乳腺癌数据集中选择在肿瘤与正常组织中过表达的基因，共23，364例。研究者还进行了癌症异常值谱分析，以选择在较小的肿瘤亚型（子集包括组织学亚型、淋巴结受累、转移、生存率降低、肿瘤大小增加和复发）中过表达的基因。基于对当前文献的回顾，研究者进一步选择了具有较高表达或表征功能的基因，这些基因与侵袭性肿瘤行为（细胞运动/侵袭、内渗、抗失巢性凋亡、存活、化学抵抗和转移）相关。研究者选择了八个染色体区域（和151个基因），它们可能与肿瘤细胞扩散更密切相关。研究者利用多光谱FISH来量化肿瘤的异质性。分析肿瘤以评估单个细胞中多个基因组区域的拷贝数。异质性使用香农多样性指数（H）进行量化，该指数在对数尺度上提供了给定位置不同信号群组的度量。使用这种方法，研究者检查了先前表征了CTC患者的预处理匹配原发性乳腺肿瘤中八个区域的异质性，以及后处理的转移样本。
研究发现，原发性乳腺癌异质性增加与转移有关。A）低H指数的肿瘤在大多数肿瘤细胞中具有相同的基因组异常区域（CTC突变特征基因集），如在单个肿瘤细胞中观察到的FISH信号均匀所示；具有高H指数的肿瘤具有CTC突变特征基因集区域组合的高异质性；一些肿瘤细胞显示单个/少量 FISH 信号，而另一些则显示多个 FISH 信号。B）研究者在9例患者中评估了肿瘤的两个空间上分开的区域的H指数。总体而言，空间异质性相关系数为中等（r = 0.57，P = 0.048）；然而，空间异质性相关系数在一些患者中非常显著。例如，患者8在两个地理上分离的肿瘤块（肿瘤块1，H1 = 1.52；肿瘤块2，H2 = 2.53（ΔH = 1.01）之间表现出高度的肿瘤内或空间异质性。C）研究者对ΔH与原发性乳腺肿瘤转移的关系进行评估发现，无论肿瘤的平均 H 指数（Havg）高低，较高的肿瘤内或空间异质性与远处转移相关。
图1 原发性肿瘤当中CTC突变特征基因集异质性分析
接下来，研究者对转移性肿瘤当中CTC突变特征基因集异质性分析进行了分析。A）研究者对原发性乳腺癌（n = 19）或转移性乳腺癌（n = 41）的肿瘤之间的异质性进行比较，发现没有显著差异。B）研究者对原发性乳腺癌（n = 19）和转移性乳腺肿瘤（n = 41，UHN队列）的克隆组成进行比较，发现转移性肿瘤中存在CTC突变特征基因集的细胞比例明显更高（平均比率为83% vs 57%）。与原发性肿瘤相比，在转移性肿瘤中以更高的频率观察到获得≥4个CTC特征突变区域的克隆（Multiple Region Gained，简称MRG克隆）。C）原发性肿瘤具有较大比例的“单个区域获得”克隆，而转移性肿瘤具有更大比例的“多个区域获得”（“MRG”克隆）克隆。与治疗前相比，MRG克隆在治疗后原发性肿瘤中的比例也更大。P1，P2是指来自两个不同患者的两个原发性肿瘤，每个肿瘤具有两个空间上独立的区域。M1，M2是指来自两个不同患者器官的多种不同转移。
图2 转移性肿瘤当中CTC突变特征基因集异质性分析
同时，研究者发现一些肿瘤细胞克隆表现出对特定器官的偏好，暗示了具有这些CTC特征突变基因集的肿瘤细胞的器官特异性传播途径。值得注意的是，在乳房中复发的肿瘤具有非常高比例的MRG克隆(28%，n = 9; 图3A)。这与远处转移部位的亚克隆比例范围(1%–15%；图3B)甚至在原发性乳腺癌中的亚克隆比例范围(5%–18%；图3A)，形成鲜明对比。在稳定的MCF7细胞系中进行体外迁移、锚定无关生长和集落形成试验验证表明，与仅单基因过表达的肿瘤细胞相比，具有MRG过表达谱的肿瘤细胞提高了锚定独立生长和集落形成能力。相比之下，大多数肿瘤细胞系显示出增加的迁移能力(图3C)。
图3 MRG克隆在转移性肿瘤中的分析
然后，研究者研究了TNBC肿瘤异质性与其他临床特征的关系。研究者收集了一个由n = 192名在UHN上诊断为TNBC的患者组成的队列，并提供了生存结果数据，并从每个肿瘤的空间独立区域收集了两个核心，以评估TNBC中存在的空间异质性。基于8基因CTC特征的ΔH评分分布显示，大多数肿瘤（68/105）的ΔH评分等于或小于0.50，极少数（14/105）大于1.00（图4）。使用中位数评分（ΔHmedian = 0.32）将肿瘤分为高肿瘤内异质性和低肿瘤内异质性。结果显示，两个队列之间的空间H评分（ΔH）存在显著差异（P <0.001），表明原发性肿瘤之间的异质性存在显著差异。
图4 原发性TNBC空间H指数分布分析
为了对原发性TNBC中的肿瘤相关免疫细胞(TIL)浸润情况进行分析，研究者开发了一组TIL标记物，使用单细胞空间蛋白质组分析技术(MxIF技术)（图5A）评估了TIL亚群之间的关系，并确定了几个显著的共定位群体(图5B)。其中，细胞毒性T细胞(Tc)和辅助性T细胞(Th)细胞表现出最强的相关性(R = 0。72, P < 0。001).其他重要的相关性包括细胞毒性和调节性T细胞（Tr;R = 0.42，P <0.001），辅助和调节性T细胞（R = 0.33，P <0.001）以及B和辅助T细胞（R = 0.24，P = 0.012）。此外，基质中PD-L1 +细胞的存在与辅助细胞（R = 0.24，P = 0.012）和调节性T细胞（R = 0.33，P <0.001）相关。总体而言，特定TIL亚型存在显着的共定位，主要在T淋巴细胞亚类之间。
研究者使用Pearson相关性测试用于评估每个原发肿瘤的ΔH与TIL密度之间的关系（n = 105;图 5C），为具有显著关系的TIL（B和辅助T细胞）生成了总TIL密度评分。结果发现，总TIL群体与肿瘤内异质性之间存在很强的正相关（R = 0.38，P <0.0001）。B细胞密度与空间ΔH指数呈显著正相关（P <0.001）。Kaplan-Meier生存分析显示，B细胞密度与良好结局显著相关（P = 0.0004），B细胞密度高的肿瘤的生存率为78%（高于中位数），B细胞密度低的肿瘤的生存率为52%。研究者根据B淋巴细胞浸润程度对评估的肿瘤进行分组并进行生存分析，生存分析表明，与低浸润组相比，高浸润组的患者结局更好。然后根据ΔH指数和B细胞密度的评价组合，将相应肿瘤的B细胞密度和空间H指数分为4个队列。与其他三组相比，具有高ΔH和低B细胞密度的肿瘤具有最差的结果（P <0.01；图 5D）。这些发现表明，当与肿瘤内异质性一起评估时，B淋巴细胞在预测患者生存结局方面发挥作用。
图5 原发性TNBC中的肿瘤相关免疫细胞(TIL)浸润情况和生存率相关分析
参考文献
1.Curtis C , Shah SP , Chin S-F , Turashvili G , Rueda OM , Dunning MJ , et al .The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumors reveals novel subgroups. Nature ;486：346–52.
2.Waclaw B , Bozic I , Pittman ME , Hruban RH , Vogelstein B , Nowak MA .A spatial model predicts that dispersal and cell turnover limit intratumor heterogeneity.Nature ;25：261–4.
3.Zardavas D , Irrthum A , Swanton C , Piccart M .Clinical management of breast cancer heterogeneity.Nat Rev Clin Oncol ;12：381–94.
4.Rashid-Kolvear F , Pintilie M , Done SJ .Telomere length on chromosome 17q shortens more than global telomere length in the development of breast cancer.Neoplasia ;9：265–70.
5.O'Connell P , Pekkel V , Allred DC , Fuqua SAW , Osborne CK , Clark GM .Analysis of loss of heterozygosity in 399 premalignant breast lesions at 15 genetic loci.J Natl Cancer Inst 1998;90：697–703.
6.Radford DM , Phillips NJ , Fair KL , Ritter JH , Holt M , Donis-Keller H .Allelic loss and the progression of breast cancer.Cancer Res 1995;55：5180–3.
7.Radford DM , Fair KL , Phillips NJ , Ritter JH , Steinbrueck T , Holt MS , et al .Allelotyping of ductal carcinoma in situ of the breast：deletion of loci on 8p, 13q, 16q, 17p and 17q.Cancer Res 1995;55：3399–405.
8.Heselmeyer-Haddad K , Berroa Garcia LY , Bradley A , Ortiz-Melendez C , Lee W-J , Christensen R , et al .Single-cell genetic analysis of ductal carcinoma in situ and invasive breast cancer reveals enormous tumor heterogeneity yet conserved genomic imbalances and gain of MYC during progression.Am J Pathol ;181：1807–22.
9.Hernandez L , Wilkerson PM , Lambros MB , Campion-Flora A , Rodrigues DN , Gauthier A , et al .Genomic and mutational profiling of ductal carcinomas in situ and matched adjacent invasive breast cancers reveals intra-tumor genetic heterogeneity and clonal selection.J Pathol ;227：42–52.
10.Yates LR , Gerstung M , Knappskog S , Desmedt C , Gundem G , Van Loo P , et al .Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing.Nat Med ;21：751–9.
11.Mroz EA , Rocco JW .The challenges of tumor genetic diversity.Cancer ;123：917–27.
12.Caswell-Jin JL , McNamara K , Reiter JG , Sun R , Hu Z , Ma Z , et al .Clonal replacement and heterogeneity in breast tumors treated with neoadjuvant HER2-targeted therapy.Nat Commun ;10：657.
13.Peshkin BN , Alabek ML , Isaacs C .BRCA1/2 mutations and triple negative breast cancers.Breast Dis ;32：25–33.
14.Huen MSY , Sy SMH , Chen J .BRCA1 and its toolbox for the maintenance of genome integrity.Nat Rev Mol Cell Biol ;11：138–48.
15.Carraro DM , Koike Folgueira MAA , Garcia Lisboa BC , Ribeiro Olivieri EH , Vitorino Krepischi AC , de Carvalho AF , et al .Comprehensive analysis of BRCA1, BRCA2 and TP53 germline mutation and tumor characterization：a portrait of early-onset breast cancer in Brazil.PLoS One ;8：e57581.
16.Brianese RC , Nakamura KDDM , Almeida FGDSR , Ramalho RF , Barros BDDF , Ferreira ENE , et al .BRCA1 deficiency is a recurrent event in early-onset triple-negative breast cancer：a comprehensive analysis of germline mutations and somatic promoter methylation.Breast Cancer Res Treat ;167：803–14.
17.Savas P , Salgado R , Denkert C , Sotiriou C , Darcy PK , Smyth MJ , et al .Clinical relevance of host immunity in breast cancer：from TILs to the clinic.Nat Rev Clin Oncol ;13：228–41.
18.Kanwar N , Hu P , Bedard P , Clemons M , McCready D , Done SJ .Identification of genomic signatures in circulating tumor cells from breast cancer.Int J Cancer ;137：332–44.
非因解读 | 单细胞空间蛋白质组分析技术揭示乳腺癌循环肿瘤细胞(CTC)与肿瘤异质性及肿瘤免疫的关系
如果觉得《非因解读 | 单细胞空间蛋白质组分析技术揭示乳腺癌循环肿瘤细胞(CTC)与肿瘤异质性及》对你有帮助，请点赞、收藏，并留下你的观点哦！
