刘宝将a；刘畅b翻译；王正航b,c审校
a北京大学肿瘤医院介入科;b北京大学肿瘤医院消化肿瘤内科；c中国临床肿瘤学会（CSCO）翻译小组
原文出处：Luchini, C., et al., ESMO recommendations on microsatellite instability testing for immunotherapy in cancer, and its relationship with PD-1/PD-L1 expression and tumour mutationalburden: a systematic review-based approach. Ann Oncol, .
本文节选自第3期《肿瘤学年鉴中文版-胃肠肿道瘤专刊》，经授权在聚焦oncology 上发表。文字有删减，如需阅读完整版，请与编辑部联系。
虽然MSI、TMB和PD-1/PD-L1表达是免疫治疗筛选患者的公认标志物，但有必要制订PD-1/PD-L1检测标准，确定不同肿瘤类型的TMB的阈值。为此，，ESMO转化研究和精准医学工作组成立专门的协作小组以基于系统综述的方法分析讨论了上述问题，制订了相应的共识建议。
本文是共识的第三部分内容，即关于MSI、TMB与PD-1/PD-L1表达的关系，作者特别指出对于MSI肿瘤，分析TMB或PD-1/PD-L1表达对于接受免疫治疗而言并非是必需的。具体分析内容请参阅正文。
有关共识中MSI/dMMR的概念及定义、MSI/dMMR的检测方法的具体建议详见下方链接，请点击阅读：
ESMO 共识：肿瘤免疫治疗中MSI定义及其检测方法的建议
MSI、PD-1/PD-L1表达与TMB的关系
由于MSI、TMB和PD-1/PD-L1表达都是与免疫治疗疗效正相关的生物标志物，为了说明阐明这些标志物的潜在关系特此开展系统综述。通过文献检索筛选出了158篇不重复的文章，在审查标题/摘要后排除其中126篇，最终确定32篇文章有资格进行全文审查。根据纳入和排除标准，共选择了18篇文章（共17个队列）进行系统综述。
流行病学和方法学数据：我们的荟萃分析包括了17篇文章，共涉及148,655名不同类型肿瘤患者。然而，在部分研究中，只有部分患者具有完整的研究参数（TMB、MSI和PD-1/PD-L1表达）的数据。大部分研究数据（10/17，59%）集中于消化系统肿瘤，但也包含针对许多肿瘤类型（超过100个肿瘤类型）中TMB、MSI和PD-1/PD-L1表达研究的大样本队列研究，确保了能深入分析广泛的肿瘤类型。绝大多数研究报告数据来自美国的患者，其次是亚洲和欧洲的患者。大部分的文献（59%）调查了原始的患者队列，但一些文献使用了来自外部（公共或私人）数据库的数据。
同一肿瘤的两项研究合并成一个包含TMB、MSI和PD-1/PDL1完整数据的患者队列。
有5项（29%）研究采用全外显子测序方法检测了TMB；其余12项（71%）研究采用肿瘤多基因panel检测，其中高TMB定义为至少≥17/ Mb或20/ Mb，测序长度至少覆盖1.2-1.5Mb。为了评估MSI状态，多数研究（82%）同时使用了IHC评估MMR状态和/或MSI-PCR以及NGS法评估微卫星状态。所有入选文章均检测了PD-L1表达，而PD-1仅在5篇（29%）研究中进行了检测。PD-1免疫染色最常使用的克隆为NAT105（60%的研究），PD-L1免疫染色使用最多的克隆为SP142（47%的研究）。然而这些标志物阳性结果的判读方法各不相同，最常用的方法是PD-1阳性细胞百分比，以及综合染色强度和阳性肿瘤细胞百分比的整合阈值以建立的PD-L1阳性的判读方法。为了避免报告数据受到任何偏倚的影响，本研究使用了Newcastle-Ottawa量表（NOS）来评估研究的质量。NOS中位评分8.05（NOS评分：最大为9，若评分<6则存在偏移风险；评估过程未展示），表明研究质量较高，偏倚风险非常低。
TMB、MSI 和 PD-L1 之间的关系及维恩图：我们通过文章中可提取的数据以及从维恩图中提取的数据，比较了高TMB、MSI和肿瘤细胞PD-L1表达的相关性（在PD-1/PD-L1轴中，PD-L1表达是本次分析中唯一有合适数据的变量）。总的来说，4186名患者均至少有一种生物标志物阳性。值得注意的是，在所有瘤种中，2.9%的病例会同时出现TMB-H、MSI-H和PD-L1（所有瘤种，意指在选择的文章中的所涉及的瘤种），这一比例在结肠直肠腺癌（12.8%）和食管腺癌（14.6%）（非食管鳞状细胞癌，而是与Barrett上皮化生相关的腺癌）中更高（P<0.05）。如果我们考虑TMB-H和/或MSI-H，在“所有瘤种”、“非小细胞肺癌”和“黑色素瘤”中，相较于TMB-H、MSI-H和PD-L1同时存在的比例，（TMB-H和/或MSI-H）与PD-L1表达同时存在的比例明显升高，分别从2.9%上升到11.9%、0.5%上升到12.7%、0.0%上升到32.0%。这是由于相较于结直肠（13.4%）和食管胃腺癌（14.6%），MSI-H合并PD-L1阳性的病例在“所有瘤种”（3.4%）及NSCLC（0.7%）中比例较低（所有差异P<0.05），或是由于黑色素瘤中缺乏MSI-H病例。最后，与“所有瘤种”组、黑色素瘤组和NSCLC组相比，TMB-H和MSI-H的重合率在结直肠癌（44.2%）、食管胃腺癌（27.7%）和子宫内膜癌（31.0%）中比例较高（所有差异P<0.05）。
▲图1. 免疫治疗中微卫星不稳定性（MSI；字母 A 表示 MSI 组）、高肿瘤突变负荷（TMB；字母 B 表示高 TMB 组）和 PD-L1 表达（字母 C 表示 PD-L1 表达组）之间的关系。以MSI 和/或高 TMB 和/或 PD-L1 阳性病例占病例总数（4186 例患者=100%）的百分比表示。高TMB定义为在至少1.2-1.5 Mb测序长度每Mb的突变数在17 或 20 个以上。CRC，结直肠癌；ECA，子宫内膜癌；EGA，食管胃腺癌；MEL，黑色素瘤；NSCLC，非小细胞肺癌。
共识小组针对肿瘤类型的结论提要：为了进一步说明MSI状态在特定肿瘤类型中可基于一种可靠的原理进行检测，共识小组整理了一份MSI检测的汇总表（表2）。针对这部分内容的文献检索，最初发现了205篇文献。在筛选了所有论文的全文之后，共整理汇总了6篇文章。另一篇手工检索到的论文调查了1万多名肿瘤患者的MSI状态，也用于这项分析 。
如表2所示，最需要通过IHC 评价MMR蛋白状态或进行MSI-PCR或NGS检测的肿瘤类型为：子宫内膜癌、肠癌（结直肠和小肠）、胃癌、食管癌（腺癌而非鳞癌）、卵巢癌和胶质母细胞瘤。对于MSI发生率较低、IHC和MSI-PCR可靠性数据较少的肿瘤类型，应使用NGS进行MSI检测。值得注意的是，MMR缺陷更易在不同肿瘤类型的早期疾病阶段（定义为<IV期）被检测到，而在晚期和转移性肿瘤中比例降低。事实上，表2中所示的百分比数据（纳入所有分期的肿瘤）主要来自于早期肿瘤。与此同时，晚期的MSI肿瘤事实上由早期的MSI肿瘤而来。表2的归纳报告的是那些可能出现MSI并且能成为免疫治疗潜在目标瘤种的最重要的肿瘤类型。
共识小组强调，在免疫治疗决策框架内依序使用不同检测方法的决策树不能成为所有肿瘤的通用决策树，而应根据特定的肿瘤类型进行设计。
最后，应该根据肿瘤类型和家族史来对患者进行遗传咨询，以识别遗传性肿瘤综合征的患者。这可以通过外科医生、病理学家、肿瘤学家和遗传学家之间的直接合作和/或通过建立多学科团队来实施。
共识小组提出的开放性问题和观点
由于近年来免疫疗法在肿瘤治疗中取得的成功，明确肿瘤的MSI概况逐渐成为一种迫切的临床需要。在这份共识报告中，我们针对MSI的定义及其检测提出了具体建议。此外，我们探索了不同瘤种中MSI与TMB及PD-1/PD-L1表达的关系；同时，对于MSI肿瘤，我们需要指出分析TMB或PD-1/PD-L1表达对于接受免疫治疗而言并非是必需的。我们之所以用系统回顾的方法（进行研究），是因为它是探索某个主题最严谨的科学方法，并且可以得出具体的临床建议。在该方法的基础上，同时结合协作项目的成员以及ESMO TR和PM工作组成员之间达成的共识。
第一条共识建议包括与MSI概念相关的所有术语的定义。在文献中，MSI和相关概念有几种不同的定义，因此我们决定为所有这些概念提供基于专家共识的明确定义。深入理解所有这些术语的正确含义，是为进一步理解MSI肿瘤患者的理想基础。这些术语表不仅对肿瘤学家/临床医生有用，也能为病理学家、研究人员和药物研发人员提供帮助。
第二条共识建议是关于MSI的检测以及如何量化肿瘤中的MSI。回顾所有基于MSI的临床研究和现有的MSI检测指南，我们提供了基于专家共识的MSI检测建议。目前，对于林奇综合征相关肿瘤中，尽管我们认为IHC是确定dMMR及其相关的MSI状态的首选方法；但我们同样对常规临床实践中可以影响IHC分析的相关方面提供了具体的评述和推荐。IHC是全球大多数实验室广泛使用的技术，了解它的优点和局限性是正确应用这一重要工具来评估MSI状态的最重要方面。分子方法主要基于PCR，我们也提出了相应的检测建议。NGS是检测MSI的另一种潜在方法，其主要优点是可以确定肿瘤突变负荷以及发现其他潜在的治疗靶点。TMB、MSI和PD-1/PD-L1表达在预测免疫治疗的高反应率方面可能很重要，因此我们研究的最后一部分探讨了这个有趣的话题。
我们发现虽然PD-1/PD-L1的表达在所有的肿瘤类型中都表现出很大的变异性，但有一个共同的特点是，即使在MSI阴性和/或TMB-L病例中也会有表达。值得思索的一个重要方面是：可以在缺失MSI时存在TMB-H，而MSI-H同时TMB-L的情况却很少见（子宫内膜癌除外）（图1）。而高TMB和高MSI同时发生的比例较高，这已经在神经胶质瘤、结肠癌和食管胃腺癌中得到了印证。但在肛管癌和食管鳞状细胞癌中，关系却恰恰相反。
这些肿瘤类型有两个共同的重要危险因素：人乳头瘤状病毒（HPV）和吸烟。尽管HPV对TMB的影响仍存在争议，但与HPV阴性或不吸烟的肿瘤相比，HPV阳性的肿瘤和与吸烟相关的癌症被认为具有更高的TMB，这与MSI状态无关。因此，在肛管癌和食管癌中，这些原因不仅可以解释TMB与MSI之间缺乏相关性，而且还可以解释相当大比例的不受MSI状态影响的PD-L1表达。基因组分析表明，特定的突变特征可以独立于MSI状态而导致TMB-H。这些包括BRCA1/2（乳腺癌基因1和2）和APOBEC缺失、新抗原负荷、紫外线照射以及影响TP53和聚合酶e（POLE）的突变。
有趣的是，在胃癌患者中，MUC16突变可能与更高的TMB、更好的生存结局和免疫反应相关。最后，其他肿瘤内源性和外源性的因素同样影响MSI、TMB、PD-1/PD-L1表达之间复杂的相互作用，例如肿瘤浸润淋巴细胞和微生物菌群。
在TMB-L、微卫星稳定、甚至无PD-1/PD-L1表达的肿瘤中，免疫治疗的有效率变化极大，这表明免疫治疗的应答也可能受到其他生物标志物的驱动。值得注意的是，在胃癌中Epstein-Barr病毒（EBV）独立于TMB和MSI，在预测免疫治疗反应中起关键作用。在有淋巴样间质的胃癌中，PD-L1在肿瘤细胞中的表达独立于MSI，甚至独立于EBV的存在。黑素瘤和非小细胞肺癌也表现出一定的特征。事实上，Vanderwalde等最近报道，在黑素瘤中没有MSI病例，但TMB-H与PD-L1表达之间的重合率非常显著（32%）。同样，在非小细胞肺癌，MSI也非常罕见（1.1%）；尽管在非小细胞肺癌中 PD-L1和高TMB已经证明是独立的，但PD-L1阳性病例非常高（75%，总人群是高TMB和/或MSI和/或PD-L1阳性者）。虽然TMB、MSI和PD-1/PD-L1表达是免疫检查点阻断治疗的重要指标，但还需要进一步的研究来发现新的标记物来预测免疫治疗的反应。
该系统综述中最重要的一个方面是提出NGS的实用性，它不仅能用于评估MSI，还可以评估TMB，而且产生有望用于免疫检查点阻断治疗的数据。值得注意的是，也可以使用为靶向治疗设计的panel进行TMB检测，从而避免了全外显子或全基因组测序的高成本。NGS还可以确定MSI状态；最近开发的一种“MSI sensor”将NGS与生物统计学相结合，用于描述肿瘤样本中的MSI。本系统综述中选取的两项研究已经应用了该方法。
在免疫治疗的框架下，对于那些不属于Lynch综合征的瘤种和罕见的瘤种，NGS是最有前途的MSI检测方法，而我们对于使用IHC和/或MSI-PCR进行MSI检测知之甚少。有趣的是，NGS最有前途的应用之一是在免疫治疗过程中对患者进行监测。事实上，Cabel等人将NGS应用于PD-1单抗治疗期间循环肿瘤DNA的研究，证明它可能是一种能够评估免疫检查点抑制剂疗效的有价值的工具。
总之，本文对MSI的定义和检测提出了专家共识的建议。此外，在研究TMB、MSI和PD-1/PD-L1表达之间的关系时，我们强调，它们的发生率和作用可能因肿瘤类型的不同而异，且可能受到多个因素的影响。虽然MSI、TMB和PD-1/PD-L1表达是免疫治疗筛选患者的公认标志物，但有必要制订PD-1/PD-L1检测标准，确定不同肿瘤类型的TMB的阈值。为此，成立了ESMO TR&PM小组以阐明这些问题。此外，对于特定的肿瘤类型或TMB-L、微卫星稳定或PD-1/PD-L1低表达的患者，免疫检查点抑制剂的有效率也可能很高。这需要我们寻找需要新的免疫治疗疗效的潜在预测因子。如前所述，NGS可能是应用当前认知的一个决策性工具，同时也可能为这一主题提供了新的见解。事实上，我们需要探索新的临床研究模式，不仅用于评估药物疗效，而且也用于测试不同的NGS方法的临床用途，以及如何改善这些癌症患者的预后。在这方面，我们的共识推荐可能是一个强有力的起点。
参考文献（略）
本文刊选自第3期《肿瘤学年鉴中文版-胃肠肿道瘤专刊》，经授权在聚焦oncology 上发表。本文为全文翻译，微信版有删减，如需阅读全文，请与编辑部联系。
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