二代测序（NGS）技术对血液肿瘤的诊疗具有重要意义，世界卫生组织（WHO）对《造血与淋巴组织肿瘤分类》内容进行了更新，依据NGS技术所发现的基因突变新增了一些血液肿瘤的类别。此外，美国国家综合癌症网络（national comprehensive cancer network，NCCN）血液肿瘤临床诊疗指南纳入的具有明确预后意义的突变基因也越来越多。国内临床实验室由于缺乏明确的技术要求，影响了血液肿瘤NGS检测的规范化及质量的提高。为了科学、合理地将NGS应用于血液肿瘤的筛查、诊断、疗效监测、预后评估和复发预测，项目组依据国内外指南及共识，组织血液学专业的临床及检验专家反复讨论，并多次到专家所在实验室现场调研，初步提出了血液肿瘤二代测序实验室检测规范化的建议，内容包括对人员资质的要求、实验室区域设置及环境要求、测序平台及方法的选择、测序平台及方法的性能验证/确认、分析前和分析中的要求、质量控制和结果报告的要求等。
相对于实体肿瘤，血液肿瘤中已经列入诊疗指南的分子指标更多，同时也对NGS的应用有着更为迫切的需求。此外，骨髓、外周血和淋巴结等新鲜肿瘤样本容易取材，容易获得高质量的肿瘤组织的核酸样本。本建议的提出旨在抛砖引玉，希望在此基础上更加广泛地收集临床医生与检验同道的意见，进一步明确并制订既满足临床需要又符合国情的技术要求，便于临床实验室规范操作，更好地服务于临床。
一、人员资质的要求
NGS是一项复杂的检测技术，涉及不同岗位人员的分工协作。由于不同岗位人员的职责不同、需要具备的能力也不同，需要针对不同岗位的人员资质分别制订要求。
1．检测人员：
应具备临床检验、分子生物学等专业背景，曾接受过NGS技术的理论和实验培训并经考核合格，同时参加了省级以上卫生行政部门组织的临床基因扩增实验室技术培训，并获得培训合格证书。
2．生物信息分析人员：
应具有生物信息学专业背景，并经相应培训考核合格后方可上岗。
3．报告分析人员：
报告分析人员应具有大学本科以上学历，同时具备临床医学（特别是血液学）、临床检验、分子生物学或遗传学专业背景，并经培训合格后上岗。最终报告应由中级职称及以上或硕士以上学历并具有相关专业背景的执业医师或授权签字人签发。
4．报告解读人员：
具有执业医师资质，接受过遗传咨询相关培训并获得合格证书，同时具备临床医学（特别是血液学）、临床检验、分子生物学或遗传学专业背景。
二、实验室区域设置及环境要求
NGS实验室的区域设置原则上需要满足《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》的要求，在不影响检测质量的前提下，分区可依据实际情况适当合并。NGS实验室分区的要求目前在业内存在一定争议，有专家认为分区设置必要性不大且浪费空间，项目组考虑到目前不同层级实验室的管理能力差异较大，为方便实验室进行质量管理，确保检测质量，建议实验室至少设置五个功能区：试剂存储和准备区、标本与文库制备区、文库扩增与检测区、测序区、数据分析与存储区。各区域的功能和相关要求如下。
1．试剂存储和准备区：
用于消耗品和试剂的存储和准备。消耗品和试剂应直接运送至该区域，不能经过文库制备区，试剂盒中的阳性对照及质控品不能保存在该区，应存储于标本与文库制备区。
2．标本与文库制备区：
用于核酸（RNA、DNA）提取与存储；文库制备和杂交捕获。应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。本区域设置正压条件（通常维持5 Pa的正压），以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。对具有潜在传染危险性的材料，应在生物安全柜内开盖和处理，同时应有明确的标本处理和灭活程序。若开展RNA测序检测，应设置RNA样本提取和样本制备特定区域。
3．文库扩增与检测区：
文库扩增、文库检测与质控。为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的走动。所有经过检测的反应管不得在此区域打开。
4．测序区：
用于测序标本上机检测的区域。如Illumina测序平台的温度在22℃左右，且温度波动上下不超过3℃，湿度在30%~75%之间；Thermofisher测台的温度在20~25 ℃，运行温度不超过30℃，详细要求依照厂商说明书。
5．数据分析与存储区：
用于测序数据的分析与存储。数据应进行安全备份，并与互联网物理隔离。规定原始序列核心数据的保存期限。详细说明并记录数据存储路径。应说明数据库是否为云端存储以及数据库更新的程序和管理要求。
三、测序平台及方法的选择
采用不同测序平台及方法的NGS检测各有优缺点，建议实验室依据自身需求结合各平台及方法的性能特点合理选择。
1．测序平台及方法的选择：
至少应考虑如下因素：检测项目类型、待测标本类型、灵敏度要求（应与检测项目相匹配，如平均测序深度大于500×时，可认为≥5%的变异频率较为可信；检测微小残留病灶灵敏度期望达到0.1%甚至更高时，应增加测序深度，配合使用分子标签技术和优化对应的生物信息分析设置，以降低由于测序平台随机误差导致的假阳性结果）、周转时间（宜2周内发报告）、检测标本量、遗传变异的复杂性（对于阳性突变位点，若有必要，应做胚系验证）、生物信息支持的程度、实验室可获得的资源（如生物信息分析及数据存储的硬件设备）、设备购置及性能验证的经费、实验室建立并运行稳定可靠的工作流程的能力。
2．检测试剂的要求：
NGS所用试剂按来源分为商品化试剂和实验室自配试剂。（1）商品化试剂的要求：如条件允许且方法性能满足临床要求，宜优先选用经国家药品监督管理局审批的试剂，实验室应遵循厂家说明书的要求进行性能验证并有记录。（2）临床实验室自建项目（LDT）检测试剂/方案的要求：实验室应结合临床需求开展研究并有记录；针对建库方法、测序平台和分析工具、突变类型以及标本类型进行性能确认；建立满足临床需要的标准操作程序；应有完备的质量控制措施；应进行实验室间结果比对。
四、测序平台及方法的
性能验证/确认
实验室应对测序平台及方法进行验证/确认，并在检测流程变更时进行重新验证/确认。测序平台及方法的验证/确认包括实验操作程序的验证/确认与生物信息分析的验证/确认，两部分验证/确认应整合在一起分析。验证/确认实验可由常规实验室单独完成或由常规实验室与具备相应能力的实验室联合进行，应确保验证/确认实验的可靠性。
（一）实验操作程序的验证/确认
应在验证/确认实验中建立质量控制参数，包括但不限于以下内容：（1）文库制备，包括片段大小分布及文库的浓度；（2）文库稀释的终浓度；（3）足够的测序数据量和Q30达标的比例。
由于人类基因组变异的复杂性（包括胚系和体细胞突变），不可能通过进行一次NGS实验验证/确认标本中所有可能存在的突变的准确性和有效性，可用包含典型突变的标本进行验证/确认实验。
当用同样的实验流程对相同类型的变异进行多次实验时，多次实验得出的结果可以视为方法验证。对于常见病理突变的位点（如JAK2 p.V617F突变及其他血液肿瘤中常见的热点突变），应在验证/确认实验中加入这些常见突变以保证结果的可靠性。对于不同的样本类型，验证样本所需的最少数量，应依据文献报道和相关指南进行考虑。
实验操作部分性能验证/确认的指标至少包括精密度、分析灵敏度（含检出限、检测限）、分析特异性、准确性（适用时）等，分析灵敏度和特异性可以用对照样本中已知位点的信息同时结合一代测序进行验证。
验证/确认或再次验证/确认时，应由实验室主管审批并有书面记录。再次验证/确认实验需覆盖全部或部分步骤，视操作程序的修改程度而定。程序变化较大的例子如改变测序平台或富集方法，变化较小的例子如前期验证过的试剂换了新批号。实验数据应能充分证明当实验操作程序发生改变时，可以达到同等或可接受的性能指标。
（二）生物信息分析的验证/确认
实验室应建立生物信息分析的质量控制参数，包括但不限于：（1）碱基质量和所测序列与参考序列比对的评分；（2）所测序列比对的上靶率；（3）目标区域的序列覆盖度；（4）序列比对评分不足或测序覆盖度过低的目标区域；（5）与参考序列比对后得出的变异数量和类型；（6）外显子组和基因组测序中，所测到的碱基转换与颠换的比例。
实验室应建立生物信息分析标准操作程序（SOP）文件，指导分析、变异注释和标准结果报告流程。对于选用开源的或商用的生物信息分析软件分析NGS测序数据，实验室应根据检测项目确定使用合适版本的分析软件和分析参数，包括注释数据库及附属组件。
实验室同时应建立信息分析流程和相关数据库更新的管理监控流程，并保存更新流程的记录。
实验室应制订保存测序数据、中间处理数据及最后处理数据的相关文件。
实验室应将每份分析报告的分析数据和对应的生信分析流程文件同时保留。
五、分析前的要求
1．申请单：
内容至少包括患者身份识别信息、医师、医疗服务提供者、标本类型、申请的检验项目、标本采集、接收的日期和时间。
2．标本采集：
标本类型包括外周血、骨髓、组织标本、细胞穿刺液等。胚系验证的标本类型包括头发、指甲、口腔拭子。各实验室应制定相应的标本采集手册，供临床标本采集人员使用。初诊患者应在治疗前留取标本，若未留取，可使用初诊时的骨髓涂片进行检测。外周血白细胞计数正常的患者，抽取4~10 ml骨髓或外周血；若白细胞计数升高或降低，应适当调整采集标本量，使有核细胞总数达到1×107以上。采集外周血和骨髓的抗凝剂勿用肝素。
3．标本运送：
外周血或骨髓4℃冷藏条件下运送，标本与冰袋勿直接接触，宜24 h内送达检测实验室（如条件所限，应48 h内送达实验室）。若送检的标本为新鲜组织，应冷冻后采用干冰运输，保证送达实验室后仍处于冷冻状态。若送检的标本为石蜡切片，则至少需要4~5 μm厚且未染色的切片5张，室温运送。若送检的标本为蜡卷，则至少需要4 μm厚蜡卷8~10卷或6 μm厚蜡卷6卷，且同时需要送一张未染色的病理片或送一张HE染色片，室温运送。头发、指甲和口腔拭子保存于EP管或无菌管中室温运送。若标本为已提取好的DNA标本，在确认DNA质量合格的前提下，应在冷冻条件下运输。
4．标本接收：
实验室应制订标本接收程序，明确不合格标本的类型，如凝血、溶血、抗凝剂使用不当的标本及冷冻后标本；若患者信息识别或标本识别有问题、运送延迟或容器不适当、标本量不足，但标本对临床很重要或不可替代，仍要求实验室进行标本检测时，应在最终报告中说明情况，并在结果解释中给出警示。
5．标本处理：
各实验室应对不同类型的标本有相应的标本处理和核酸提取的SOP。应注意FFPE（石蜡包埋）标本由于福尔马林固定以及标本老化会导致C>T/G>A突变产生，从而引起NGS检测结果出现偏差，针对此问题，建议在提取FFPE标本的DNA时，用FFPE标本提取专用试剂盒和（或）在后续的生物信息分析中进行相应的过滤处理。
六、分析中的要求
至少包括但不限于如下内容：
1．明确分析目标区域：
如检测所包括的基因名列表，应分别注明每个基因中所检测的范围，如特定的位点、某一个或几个突变热点区域、编码区全长等。外显子组或基因组测序时，应注明所分析的位点或基因的列表。若分析内容属于基因编码区外的其他目标区域，如内含子、启动子、增强子或其他调控元件、多态性位点等，也应注明。
2．明确核酸提取、目标区域富集和建库的方法及试剂：
如基于多重PCR法富集的方法建库，所采用的建库试剂盒及厂家；基于探针捕获法富集的方法建库，所采用的建库试剂盒及厂家。
3．多标本同时上机测序：
应有相应的分子标签用于区分不同的测序标本，应明确不同的检测标本和分子标签的一一对应关系。
七、室内质量控制
质量控制参数用来监控和评价每一次上机检测的结果，并且用于周期性的评价（如每月或每季度）。应由实验室主管或指定人员对失控情况进行检查和确认。
1．采用已知阴性和阳性质控品进行室内质控：
（1）阴性质控品：不是指突变阴性的标本，而是采用无模板对照（no template control，NTC）作为阴性质控品。阴性质控品需包含在所有的扩增步骤中，以证实在标本和试剂中没有核酸的污染。（2）阳性质控品：应使用弱阳性质控品，包括至少一个已知突变位点，最好变异百分比接近检测下限，以证实低百分比的突变可在每批次中检出。质控品无需在每批检测中包括所有突变类型，至少加入一个已知突变位点的质控品（实验室最好有多个突变的质控品，并在日常检测中轮流使用）。
2．明确实验数据的接受和拒绝标准：
测序应根据检测项目建立对应的数据质量控制指标（以PGM平台为例），包括：（1）针对整体测序数据的指标，如关键信号值，质控序列/阳性对照的测序平均读长等以判断测序实验是否成功；（2）针对每个样品的测序数据质控指标，如样品的最小数据量（单个标本的测序数据量应满足要求，血液肿瘤要求最低测序深度≥500×）、平均长度、平均覆盖深度、均一度以及在靶率均≥70%[对于捕获方法建库的情况，要求在靶率≥70%，对于target测序，特别是小panel的测序（例如多重扩增的建库方法）得到的目标序列的在靶率≥90%]，以判断数据质量是否达到分析的需求。
八、室间质量评价
实验室应参加相应检测项目的室间质量评价/能力验证。实验室可参加国内或国外开展的室间质量评价/能力验证，若无法实现，应通过与其他实验室（如已获认可的实验室、使用相同测序平台的实验室）比对的方式，判断检验结果的可接受性。
九、结果报告
结果分析团队应由生物信息分析人员、基因变异解读人员和临床血液学专业人员组成。
对序列变异的解释和报告应遵循专业组织的推荐和指南。
报告中应清晰地说明所有病理意义或高度可疑有病理意义的阳性结果。报告推荐使用人类基因组变异学会（human genome variation society，HGVS）的标准格式和命名规则报告基因突变，报告中应包括测序深度和变异频率，同时依据权威指南并结合患者病情对突变的临床意义予以分析和说明。临床意义不太明确，但是已有权威文献报道的基因变异，解释时注明文献来源，说明其相关药物及临床意义，并注明仅供研究使用。临床意义完全不明确的变异，可不列入报告中，若列入报告中，则应明确指出目前尚不清楚该变异的临床意义，报告的结果仅供研究使用。
报告中需对检测范围、检测下限等进行说明，并对检测的局限性，如哪些区域缺乏足够的覆盖深度，可能导致突变漏检以及对结果可能有影响的因素进行说明。
报告需经审核后发出。
十、信息系统
信息系统的功能（包括数据分析、存储、传输及安全性等）应满足临床需要。
生物信息分析流程应包括所有的算法、软件、脚本、参考序列和数据库，可以是内部的，供应商开发的或开放源代码。实验室应有记录NGS生物信息分析步骤的书面程序用来分析、解释、报告NGS检测结果。对于每一份报告应能追踪其测序数据产生的生物信息分析步骤的版本。
实验室应规定原始序列核心数据的保存期限，并在医生要求或患者检测需要时允许实验室间重新分析、重新注释及重新解释。
实验室应确保NGS数据内部和（或）外部存储、转移的保密性以及数据的完整性。
来源：中华医学杂志, ,99(41) : 3204-3208.
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