免疫治疗是近年来肿瘤治疗领域最成功的方法之一。以 Opidvo 和 Keytruda 为首的免疫检查点抑制剂在临床上获得了极大成功的同时，它们的有效性和耐药性的问题也逐渐浮出水面。越来越多的研究表明，免疫治疗效果不仅依赖于获得性免疫，还和固有免疫有很大关系。固有免疫又被称作非特异性免疫或先天性免疫，是特异性免疫的基础。研究者们发现，固有免疫在很多病种中发挥非常重要的作用，因此关注点也逐渐从浸润免疫细胞（Infiltrating Cells）转向了固有免疫细胞（Resident Cells）。下面就由我们抛砖引玉，为您介绍一下单细胞方向的相关研究。
质谱流式
说起固有免疫，目前研究较多的当属神经胶质瘤，因为小胶质细胞本身就属于单核巨噬细胞来源的固有免疫细胞。以色列的 Asya Rolls 教授团队在这方面进行了非常多的工作。他们发表了利用质谱流式分析脑部免疫细胞的分类方法，相关结果和实验方法发表在和的 Nature Neuroscience 和 Nature Protocol[1-2]上。在研究中，研究者基于 CyTOF 质谱流式平台，使用44种细胞marker抗体对小鼠样本进行了标记。通过对比小鼠脑部和外周血样本的免疫细胞组分，研究者对免疫细胞进行了非常精确的分型（图1）。研究发现，脑室内的固有细胞中 CD45 分子的表达量很低，但是活化的小胶质细胞中 CD45 的表达量会上升，而 CD44 则相对来说表达稳定，因此 CD44 比 CD45 更加适合作为区分固有免疫细胞和浸润免疫细胞的 marker。该研究为后续的脑部免疫系统的研究奠定了坚实的基础，相关的研究方法发表在的 Nature Protocol [2]上。
图1 部分 marker 的表达分布。上：SPADE 分型图；下：tSNE 分型图和流式二维图。
单细胞转录组
近年来单细胞转录组取得了极其巨大的突破。相较于质谱流式，虽然单细胞转录组测序价格依然较高、细胞通量较低，但是能够获得完整的细胞谱系信息，更适合细胞发育分化和功能的研究。加州大学神经科学中心的 Marie E Burns 教授团队利用单细胞转录组技术，对视网膜病变小鼠的的浸润免疫细胞进行了研究，相关结果发表在3月的 Scientific Reports 上。
图2 CD11b+CD45+细胞的单细胞转录组tSNE图。左：细胞可被分为四大类：1)静息的小胶质细胞；2)活化的小胶质细胞；3)单核细胞；4)巨噬细胞。右：更加细致的细胞亚群定义。 图3 不同样本中，不同 cluster 的表型差异。上：不同 cluster 的细胞所占整体的比例。下：不同 cluster 的细胞的差异基因 在本研究中，研究者使用流式细胞仪分选到了 CD11b+CD45+细胞，并对其进行了单细胞转录组测序（图2）。这些细胞可以被大致分为四类：静息的小胶质细胞、活化的小胶质细胞、单核细胞和巨噬细胞。通过对各个亚群的进一步分析，研究团队证明，小胶质细胞激活、单核细胞浸润并分化为巨噬细胞可以迅速发生。 多组学研究 从上面两篇论文的结果上，相信一些老师已经发现，二者在细胞类型方面的结论并不完全一致。在质谱流式论文的结果中，固有小胶质细胞是一群 CD45 低表达，激活后才会表达上调的细胞；而在单细胞转录组的文章中，对照组视网膜 CD45+ 的免疫细胞中，固有的静息状态小胶质细胞占比则高达72.4%。这一方面可能是因为两篇文章研究的组织类型不同，另一方面也可能是转录组与蛋白组的表达存在差异。当然，两篇文章的研究起点也不同。质谱流式的文章分析了脑部的全部免疫细胞，而单细胞转录组的文章则研究了分选后的 CD45+CD11b+细胞。因此，基于这些原因，多组学相互印证的论文也逐渐成为了一个趋势。 1月，Padmanee Sharma 教授团队在 Nature Medicine 上发表了关于胶质母细胞瘤的文章，证明了病人脑部存在一群 CD73hi的浸润巨噬细胞。这群细胞与小胶质细胞存在明显差异，并且能够高表达各种促炎因子、免疫抑制和缺氧相关基因。在接下来动物模型中对这群细胞进行抑制，能够增强 PD-1 免疫治疗的效果[4]。研究者首先对多种肿瘤样本进行质谱流式检测进行筛选，发现目标细胞亚群后，随后使用单细胞转录组分析其基因谱，并结合动物实验和数据库生存期数据，最终证明了这是一群在免疫治疗中非常有临床意义的细胞。相关解读详见小编以前的一篇文章“”。在另一篇 Noel F C C de Miranda 教授的文章中，研究者分析了结直肠癌（CRC）组织的固有和浸润免疫细胞，文章发表在4月的 Gut 上。目前绝大多数 CRC 相关研究的关注点都是细胞毒性 T 细胞，极少有综合的无偏分析驻留细胞和浸润细胞的论文。 图4 文章[5]研究思路 文章中，研究人员将CRC患者分为错配修复缺陷(MMR-deficient，MMR-d)和错配修复正常(MMR-proficient，MMR-p)的两群（特别提一句，Keytruda 被批准用于微卫星高度不稳定/错配修复缺陷型(MSI-H/dMMR)患者，是 FDA 历史上第一例按照基因缺陷，而不是发病组织批准的抗癌药物）。通过质谱流式平台，研究人员对含有36个蛋白标记的890万个细胞进行单细胞分析，最终将其分为了7大类、220小类细胞亚群。通过10x单细胞转录组对这7个大群进行验证。通过对比两种不同类型的 CRC 数据，研究人员发现肿瘤特异性的活化的 CD8+ T 细胞和 γδT 细胞在 MMR-d CRC 中富集，ICOS+ 和 CD4+ T 细胞在两种类型的 CRC 中均有富集。更关键的是，在MMR-d CRC中，存在一群固有的Lin–CD7+CD127–CD56+CD45RO+先天淋巴细胞（ILC）与免疫应答密切相关。单细胞转录组数据表明其高表达细胞毒性分子。相关结果又进一步得到了免疫荧光实验的支持。最后，研究人员将所有样本的数据综合到一起，在整个免疫系统的水平对其进行了相关性分析。斯皮尔曼相关性分析结果显示出，在 MMR-d CRC 中，上述的 ILC 细胞亚群与 CD103+PD-1+ CD8、γδT 以及 Th 细胞存在非常强的相关性，说明这群细胞可能在肿瘤进展中起到关键作用。 图5 全身免疫系统中先天和适应性免疫细胞亚群的相关性，每种组织类型取了前10个特异性的免疫细胞亚型。 诺禾致源质谱平台助力科研，质谱流式检测限时优惠中，详情请见助力科研 | 质谱流式检测限时优惠 参考文献：[1]Korin B. et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain’s immune compartment. Nat Neurosci. Sep;20(9):1300-1309[2] Korin B. et al. Mass cytometry analysis of immune cells in the brain. Nat Protoc., Feb;13(2):377-391 [3] Kaitryn E. Ronning et al. Molecular profiling of resident and infiltrating mononuclear phagocytes during rapid adult retinal degeneration using single cell RNA sequencing. Sci Rep. Mar 19;9(1):4858[4] Goswami S. et al. Immune profiling of human tumors identifies CD73 as a combinatorial target in glioblastoma. Nat Med. Jan;26(1):39-46[5] Natasja L de Vries et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. Apr;69(4):691-703[6] Gate D. et al. Clonally expanded CD8 T cells patrol the cerebrospinal fluid in Alzheimer’s disease. Nature. Jan;577(7790):399-404 更多精彩内容： (点击即可阅读) 为你读文献为你分享资源为你分析研究思路为你提供最前沿的科研动态学霸，逗逼，科学家，文艺青年同在 点它，分享点赞在看都在这里
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