Single cell genomic characterization reveals the cellular reprogramming of the gastric tumor microenvironment单细胞基因组特征揭示胃癌肿瘤微环境中细胞重编程
一.研究目的肿瘤微环境(TME)可以影响细胞状态和功能，不同TME对免疫治疗产生截然不同的影响。基于单细胞分辨率有利于识别肿瘤内异质性和肿瘤间异质性，更好表征TME中不同细胞特点。因此，作者使用单细胞转录组测序手段对胃癌，胃肠上皮化生，配对正常组织和外周血样本进行分析，为筛选胃癌的潜在免疫治疗标志物和靶标奠定理论基础。二.方法解读 1.组织处理和单细胞测序：1.1 样本来源：胃癌(7)+胃肠上皮化生(1)；配对正常组织(8)+PMBCs(2)1.2 制作高质量单细胞悬液：组织解离样本+PBMC1.3 测序方式：10x Genomics1.4 数据质控和统计细胞：>200个基因，线粒体基因占比<20％或UMI数量处于异常范围基因：>3个细胞2.分析流程(Seurat包)2.1 标准化：NormalizeData (scale.factor = 10000)2.2 识别高可变基因：FindVariableGenes (x.low.cutoff = 0.0125，x.high.cutoff = 6,y.cutoff = 0.5)2.3 消除批次效应：ScaleData (nUMI)，例如通过设定UMI阈值以去除doublets (即两个或两个以上的细胞悬浮在一个液滴中)2.4 PCA分析：RunPCA2.5 聚类分析：FindClusters (resolution = 0.8；前20个PC)2.6 UMAP降维：RunUMAP2.7 识别Cluster标记的差异基因表达：FindAllMarkers/FindMarkers (至少25％的细胞中检测到的基因；使用Wilcoxon秩和检验；在Bonferroni校正后p<0.05时，log FC为0.25)2.8 合并数据集：在去除 (DoubletFinder) MergeSeurat2.9 可视化：DoHeatmap；FeaturePlot；DimPlot；DotPlot；VlnPlot2.10 Sub-Cluster分析：SubsetData (do.clean=TURE)--->检测可变基因--->使用UMI消除测序深度影响--->PCA分析--->聚类--->UMAP2.11 谱系分析：轨迹推断2.12 下游分析：差异分析；通路富集；CellPhoneDB(推断细胞之间相互作用)；CNV分析和可视化2.13 多重免疫荧光：验证组织中存在特定细胞(细胞标志物阳性)三.结果解读1.胃癌与肠上皮化生队列和单细胞转录组谱作者从7例胃癌(GC）患者和1例肠道上皮化生(GIM)患者的手术切除或内镜活检中获得组织(包括配对正常组织，图1A)。IHC显示GC肿瘤具有肠道，弥漫性或混合性特征(图1B)。基于scRNA-seq，作者获得了来自GC或GIM的32,407个单细胞转录谱，配对正常组织中18,657和PBMCs中5,103个单细胞转录谱。为了确定基因表达的变化，作者对每个单独数据集采取了一系列分析步骤，包括数据质控(QC)，主成分分析(PCA)和聚类。作者采用统一流形逼近和投影(UMAP)来降维，并可视化Cluster。使用Bonferroni校正后的p<0.05作为cut-off，将差异表达基因(DEGs)鉴定为在Cluster中大于25％的细胞中表达且logFC大于0.25的基因。作者将每个Cluster的DEGs与各种细胞类型已知标记基因进行了比较后对Cluster进行定义：上皮细胞(表达PGC，TFF1，MUC5AC，EPCAM，GIF，CHGA)，成纤维细胞(THY1，DCN，COL4A1，FAP)，内皮细胞(PECAM，ENG，VWF，SELE)，免疫细胞(PTPRC)，[CD4+T细胞(CD3D，CD4，IL7R)，细胞毒性T细胞(CD3D，CD8A，CD8B)，Treg细胞(FOXP3，IL2RA)，NK细胞(NKG7，GNLY)，B细胞(MS4A1)，浆细胞(免疫球蛋白基因)，肥大细胞(TPSAB1)和巨噬细胞(CD68，CD14，FCGR3A)。此外，分析不同细胞中特异基因有助于识别doublets (图1C，D)。2.合并数据集并联合分析为了识别所有样本和患者之间的相似和差异性，作者将GC，GIM，配对正常组织和PBMCs 的scRNA-Seq数据汇总到一个数据集中，并基于文库制备和测序深度消除批次效应。聚类分析后确定了40种不同的簇，这些簇对多种特异性细胞类型，包括上皮，基质(成纤维细胞，内皮细胞)，淋巴细胞，巨噬细胞和肥大细胞，并在所有患者样品中均发现(图1E)。此外，每种细胞类型都有多种不同的转录状态。为了进行其他表征，作者汇总了样本中每种细胞类型的数据，并进行了聚类分析。
图1. 分析流程，细胞聚类和注释3.分类肿瘤，正常和化生上皮细胞群作者识别出肿瘤，化生和正常上皮细胞之间的差异，源自不同患者的肿瘤上皮细胞间差异以及单个肿瘤内的亚克隆异质性。从综合数据集中对上皮细胞进行重新聚类分析，发现了三个亚类。第一个亚类由正常胃上皮细胞组成-超过80％来自正常胃样品(normal；图2A，B，C)。第二个亚类由肿瘤特异性上皮细胞组成(GC 1型)，这些细胞中约有98％来自肿瘤样本。值得注意的是，GC 1型组中的每个簇在一名患者占主导地位–这表明GC肿瘤间存在异质性，同样提示每个肿瘤都具有独特的转录特性。第三类涉及源自GC上皮细胞以及正常组织(GC 2型)，包含来自P6649患者约58％具有胃上皮化生但没有GC的细胞，这些细胞可能代表具有与肿瘤上皮和化生上皮重叠的转录特征。
为了对胃癌与正常上皮细胞的高精度分类，作者采用scPred基于转录数据对肿瘤和正常组织的上皮细胞进行分类，结合分解基因表达矩阵的方差结构来识别有限的信息特征，并使用机器学习方法来估计这些特征对细胞分类的影响。结果表明scPred和Seurat的分析结果相一致(图2D)。4.肿瘤和正常上皮的CNV差异使用scRNA-seq，可以通过分别分析基因表达的相应增加或减少来检测染色体水平的扩增或缺失。为了识别肿瘤和正常上皮的CNV差异，作者将每个患者的normal与GC 1型或GC 2型组进行了比较(图2E)。在P6207患者的GC 1型，7p，7q，8q和9q中检测到CNV扩增，而在10p中出现CNV缺失。P6342患者的肿瘤出现20q的CNV扩增和4q的CNV缺失。对于具有化生和P6592的患者P6649，样品仅包含少量细胞，其拷贝数变化明显。这些CNA结果进一步证实了GC数据集中正常和肿瘤上皮细胞之间的区别。5.肿瘤内异质性和肿瘤间异质性作者分析了不同患者的GC 1型和GC 2型细胞的各种致癌通路。图2F显示激活水平的显着差异，证实了肿瘤间转录异质性。有趣的是，这些激活程度并未根据MSI和MSS分子亚型之间的差异进行聚类。个别患者的肿瘤包含GC 1型和GC 2型细胞的多个簇，表明肿瘤内异质性。通路分析将每个患者的肿瘤将这些簇分为三到五个亚群，从而确认了亚克隆结构(图2G)。例如，P6207中的异质性以细胞周期，KRAS通路，WNT激活的差异为特征(图2G)。基于这些结果，作者假设这些亚群可能为肿瘤提供明显的生长优势。
图2.上皮细胞间转录异质性6.TME重编程导致除M1和M2之外的巨噬细胞状态与正常胃组织相比，肿瘤免疫微环境(TME)中巨噬细胞具有明显的基因表达变化。巨噬细胞分为M1或M2型，具有抗肿瘤和促肿瘤作用。然而，作者观察到巨噬细胞的基因表达特征不符合M1或M2型。作者在所有患者中检测到了11个不同的簇，观察到了髓系谱系细胞的各种亚类(图3A-D)。九个单核巨噬细胞簇由CD14，FCGR3A，CD68的标记基因表达定义；两个树突状细胞(DC)簇由CLEC4C，ID2，IRF4和CD83的标记基因表达定义(图3C)。值得注意的是，与正常胃组织相比，巨噬细胞在肿瘤中明显富集(图3E)。作者检查了巨噬细胞簇中M1(CCL19，TNF，CCL5)和M2(MRC1，CCL18，CCL13，CD163)型标志基因的表达(图3F)。M1/M2型巨噬细胞的标志基因均不能分群。而且，这些基因在同一簇中共表达，这表明转录异质性独立于 M1/M2型巨噬细胞。图3G表明转录异质性与HSP家族基因，THBS1，趋化因子(CCL20，CCL18，CCL3)，MMP9，补体家族和细胞周期调控基因的表达差异有关。PBMC中的单核细胞与肿瘤或正常组织内的巨噬细胞呈现分离，表明具有转录异质性(图3B，D)。作者对组织中的巨噬细胞和PBMC中的单核细胞进行轨迹推断(图3H)。单核细胞以单个轨迹状态存在，大多数组织巨噬细胞沿两个不同状态分化。这表明浸润肿瘤的巨噬细胞不同于单核细胞，但与正常组织内的巨噬细胞保留了一些基本的相似性。DC可分为2种亚群，其中一个具有浆细胞样DC的标志基因，如IL3RA(CD123)和CLEC4C(CD303)–该亚类主要在PBMC中检测到(图3C，图3D)。另一种具有活化DC的标志基因，如CD83，CCR7，IL7R和ID2以上结果提示即巨噬细胞存在于由一组特定基因而非M1/M2型巨噬细胞调节功能状态。
图3.TME中巨噬细胞的重编程7.TME中耗竭T细胞具有高CXCL13表达和增殖特点细胞毒性CD8+T淋巴细胞(CTL)分布在五个不同簇中，检查了每个簇的主要来源(配对正常组织，肿瘤组织或PBMCs)，未致敏(naive)标志基因(CCR7，SELL)，组织效应记忆标志基因(CD69，ITGAE，ITGA1)和细胞毒性标志基因(GZMB，GZMA，PRF1，IFNG， NKG7)(图4A，B)。CTLs的亚组可分为肿瘤naive CTLs(簇0)，正常效应CTL(簇1)，PBMC效应CTL(簇19)和肿瘤效应CTL(簇6、22)。在TME中，具有耗竭T细胞(TEx)的2个CTL亚组(簇6和22)在具有低表达水平PRF1和IFNG（颗粒酶）图4B。此外，TEx的2个CTL亚组(簇6和22)表达了多个免疫检查点基因(PDCD1，TIGIT，CD96，HAVCR2（TIM3），LAG3，CTLA4，VSIR)；这些免疫检查点基因的表达水平作为衡量免疫抑制程度的指标。此外，这些细胞还表达了多种共刺激分子(ICOS，TNFRSF18（GITR），CD27，TNFRSF9，CD40，CD226，TNFRSF4)(图4B)。图4C显示TEx的2个CTL亚组(簇6和22)具有低细胞毒性，高耗竭和高增殖表型(簇22)。簇6则显示出具有较低的耗竭和增殖能力，并且CXCL13的表达明显较高。为进一步验证上述结果，作者通过多重免疫荧光染色(图4D)，在所有样品中检测到了这些细胞谱系，如效应T细胞(CD45RO，CD3阳性)，耗竭型T细胞(PD-1，CD45RO，CD3阳性)。
图4. 细胞毒性T细胞间转录异质性8.成纤维细胞，周细胞和内皮细胞的TME重编程作者对所有样本中的基质细胞进行聚类分析和注释，确定了成纤维细胞(THY1，DCN，COL4A1，FAP)，内皮细胞(PECAM，ENG，VWF，SELE)和周细胞(RSG5，PDGFRB)(图5A，5C)。与正常细胞相比，所有三种细胞均富集在肿瘤组织中(图5B，5D)。为了确定正常与肿瘤组织中基质细胞的表型差异，肿瘤特异性成纤维细胞，周细胞和内皮细胞表达了多种细胞外基质(ECM)核心相关成分(图5E)。肿瘤或正常组织的基质细胞具有明显不同的调节基因或调节子。例如，肿瘤特异性内皮细胞具有更高活性的SOX18和SOX7(已知的多种内皮细胞的的调节基因)。此外。肿瘤特异性成纤维细胞中具有高活性的EGR2基因(影响纤维化)。以上结果区分了基质细胞在基因表达程序及其调控因子上的差异。
图5.基质细胞间转录异质性9.TME中细胞通讯可能影响细胞状态作者发现TME的细胞间通信网络可能会影响细胞状态。首先，基于CellPhoneDB进行了无偏向的配体-受体相互作用分析，推断细胞之间相互作用(图6A)。结果显示基质细胞是最核心的相互作用细胞之一，基质细胞与上皮细胞之间的细胞通讯是通过各种整合素受体与胶原蛋白，纤连蛋白和THBS1配体的相互作用(图6B)。成纤维细胞是WNT配体的重要来源，而在肿瘤上皮，内皮细胞，成纤维细胞和周细胞上表达相应的受体。LGR4-RSPO3相互作用可能调节干性(图6C)进一步验证了作者先前研究中RSPO3源于胃癌的成纤维细胞。自分泌和旁分泌Notch信号是血管生成的已知调节剂，Notch信号传导的相互作用在内皮细胞和成纤维细胞中也很重要(图6D)。血管内皮细胞和周细胞上的血管生成受体KDR，FLT1，FLT4，PDGFB，TEK与各自的配体具有明显相互作用(图6E)。相互作用组中有19种细胞因子，包括趋化因子，白介素，肿瘤坏死因子(TNF)及其相应的受体，这些细胞因子可影响免疫细胞的状态。
图6. TME中细胞-受体配体互作网络到这里文章的主要内容就介绍完了，作者利用单细胞测序对胃癌的TME进行了详细的分析，并鉴定出肿瘤内和肿瘤间同一种类型细胞的异质性。例如巨噬细胞内的转录异质性(不依赖于M1和M2型巨噬细胞)；细胞毒性T细胞内的转录异质性(具有肿瘤耗竭T细胞型亚组的转录学特点)。此外，联合单细胞测序和配体受体互作分析，表征了TME专有的细胞间通讯。文章中单细胞测序的常规分析方法主要为质控，标准化和归一化，降维，聚类，寻找差异基因，谱系分析(轨迹推断)；但后续分析值得我们学习，如联合CellPhoneDB推断细胞间受体和配体的互作；联合拷贝数变异分析；对Cluster进一步分类(Sub-Cluster)等。
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