马军兴1桑英1贾中明2
1 山东第一医科大学附属肥城医院肥城市人民医院普外科 271600；2 滨州医学院附属医院乳腺外科 271600
通信作者：贾中明，Email:jxoc3181903@ 电话:18678325256
【摘要】目的本研究旨在通过检测乳腺癌组织中AXIN2基因启动子区甲基化状态，分析其与乳腺癌相关危险因素、临床病理特征及mRNA表达间的关系，探讨其在临床应用中的价值。方法选取1月至12月在山东第一医科大学附属肥城市人民医院普外科经手术切除治疗的84例女性乳腺癌患者的乳腺癌组织和癌旁组织、检测组织的AXIN2基因启动子的甲基化状态和mRNA表达量，使用不同浓度的甲基转移酶抑制剂（5-Azacytidine，5-Aza）处理人乳腺癌ZR-75-1细胞，且进行乳腺癌相关危险因素和临床病理特征的收集与分析。结果乳腺癌组织的AXIN2基因启动子甲基化阳性率（40.5%）显着高于癌旁组织的甲基化阳性率（19.0%）（χ2=10.401，P=0.001）。AXIN2甲基化阳性率与乳腺癌患者的初产年龄（χ2=5.467，P=0.019）、是否有人工流产史（χ2=8.372，P=0.006）有关；AXIN2甲基化阳性率与是否发生淋巴结转移（χ2=5.338，P=0.021）、ER表达状态（χ2=9.141，P=0.002）及PR表达状态（χ2=6.918，P=0.009）有关。此外，乳腺癌组织的AXIN2基因mRNA相对表达量（00.22±0.03）显着低于癌旁组织的mRNA相对表达量（0.46±0.06）（t=3.527，P﹤0.001）；甲基化阳性乳腺癌组织的mRNA相对表达量（0.13±0.02）显着低于甲基化阴性乳腺癌组织的mRNA相对表达量（0.29±0.04）（t=3.616，P﹤0.001）。ZR-75-1细胞使用5-Aaz处理后，AXIN2基因mRNA相对表达量显着升高（t=3.824，P﹤0.001）。结论AXIN2基因启动子区DNA甲基化与乳腺癌发生机制有关，在临床中有一定应用价值。
【关键词】乳腺癌；AXIN2；DNA甲基化
基金项目：山东省自然科学基金项目（ZRMH033）
乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤之一，遗传因素在乳腺癌的发生、发展中起到重要作用[1]。近年来，表观遗传学修饰尤其是DNA甲基化异常在乳腺癌发病中的作用备受研究者关注[2]。研究表明Wnt/β-Catenin信号途径的异常激活在乳腺癌的发生、 发展机制中发挥着重要作用。此外，许多研究已证实对Wnt/β-Catenin信号具有调控作用的多种基因启动子区甲基化与乳腺癌的发生、 转移密切相关， 如DACT2基因[3-4]、ALX4基因[5]、APC基因[6]等。AXIN2作为一种重要的肿瘤抑制因子，能以构架蛋白的形式对Wnt/β-Catenin信号途径发挥负性调控作用[7]。目前，许多研究报道AXIN2基因启动子区DNA甲基化与结肠癌[8]、肝细胞癌[9]等恶性肿瘤的发生、发展有关。但迄今，AXIN2基因启动子区甲基化在乳腺癌中的作用，鲜有研究报道。本研究旨在通过检测乳腺癌组织中AXIN2基因启动子的甲基化状态，分析其与乳腺癌相关危险因素、临床病理特征及mRNA表达间的关系，探讨其在临床应用中的价值。
01材料与方法1.1一般资料
选取1月至12月在山东第一医科大学附属肥城市人民医院普外科经手术切除治疗的84例女性乳腺癌患者作为研究对象，术中取乳腺癌组织及癌旁正常组织（距癌组织边缘≥5cm），所取组织离体后立即置入-196℃液氮中保存待用。患者的平均年龄为（49.7±6.93）岁，范围为28~76岁。所有患者术前均未接受放、化疗等其他抗肿瘤治疗，均经组织病理学确诊为乳腺浸润性导管癌，且无其他肿瘤史。依据美国癌症联合委员会制定的乳腺癌国际TNM标准进行分期[10]。此项研究通过了医院伦理委员会的批准（批号：KB171203），研究对象均签署书面知情同意书。
1.2方法
1.2.1 DNA提取和亚硫酸氢盐修饰本研究采用基因组DNA提取试剂盒（CWBIO，Cat.No.CW0550）提取组织全基因组DNA。应用EZ DNA Methylation Gold试剂盒（EZ，Catalog Nos.D5005）对200~500ng DNA进行处理。
1.2.2 甲基化特异性PCR（methylation special PCR，MSP）AXIN2基因启动子甲基化和非甲基化引物（美国Invitrogen公司）的引物序列为：甲基化引物5"-GTTTTTTTGGAGTTGATGGTAT-3"（正向引物），5"-AAATCTAAACTCCCTACACACTT-3"（反向引物）；非甲基化引物5"-GATTAATCGCTGTGTACGTCAGA-3"（正向引物），5"-TAGCCTATACGCTGCTCACACCT-3"（反向引物）。总反应体系25μI，包括DNA 2μI，DNA聚合酶混合物12.5μI，ddH2O 8.5μI，上、下游引物2μI。PCR反应条件如下95℃预变性10min，95℃变性30s，甲基化引物62℃退火30s，非甲基化引物55℃退火30s，72℃30s，共40个循环，72℃终延伸10min，反应产物经凝胶电泳回收测序，EB染色后观察结果。若甲基化引物扩增阳性，非甲基化引物扩增阴性，提示为甲基化阳性；若非甲基化引物扩增阳性，甲基化引物扩增阴性，提示为甲基化阴性；若甲基化引物扩增阳性，且非甲基化引物扩增阳性，提示为部分甲基化，仍然认为甲基化阳性。
1.2.3 荧光定量PCR检测AXIN2基因的mRNA表达量AXIN2和内参基因CTBP1的引物序列如下：AXIN2（F）：5"-CTGGCTCCAGAAGATCACAAAG-3"，（R）：5"-ATCTCCTCAAACACCGCTCCA-3"；内参GAPDH（F）：5"-TTCACCGTCAAGCAGATGAGAC-3"，（R）：5"-CTGGCTAAAGCTGAAGGGTTCC-3"。总反应体系15μI。包括E×12TaqMan ⑧基因表达检测液0.75μI，TaqMan PCR反应混合液7.5μI，cDNA模板3μI，再加ddH2O至15μI。反应条件如下：95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，共进行40个循环。以凝胶成像仪观察及分析电泳结果。采用标准曲线法对AXIN2基因mRNA的表达进行相对定量分析，采用2-△△CT法计算结果。
1.2.5 甲基转移酶抑制剂（5-Azacytidine，5-Aza）处理人乳腺ZR-75-1细胞将ZR-75-1细胞培养于RPMI1640培养液中，培养条件为37℃、5%CO2、湿度﹥90%。培养至细胞融合率达75%左右，取细胞分别加入含有5μmol/L和10μmol/L浓度5-Aza的培养液，对照组添加不含有5-Aza的培养液，每24h更换一次新鲜培养液，72h后收集细胞，检测其AXIN2 mRNA表达量
1.2.6 乳腺癌相关危险因素和临床病理特征的收集查阅资料得到乳腺癌发生的已知相关危险因素，包括年龄、月经初潮年龄、生育次数、初产年龄和流产史等[11-12]。通过问询方式收集84例患者的上述乳腺癌相关危险因素。术后查阅患者病历资料，记录患者肿瘤组织的临床病理特征，包括肿瘤TNM分期、肿瘤最大径及是否有淋巴结转移等。所有肿瘤组织的雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesteerone receptor，PR）、Cerb-B-2、Ki67及P53基因表达情况均为本院病理科采用免疫组化染色检测的结果。
1.3统计学处理
统计学分析过程采用SPSS 20.0软件。使用均数±标准差
描述符合正态分布的定量数据，采用t检验进行两组资料间比较，采用SNK-q检验进行多组资料间比较；采用频数表示定性资料，使用χ2检验进行组间比较。P﹤0.05表示差异有统计学意义。
02结果2.1乳腺癌组织和癌旁组织AXIN2基因启动子甲基化状态比较
乳腺癌组织的AXIN2基因启动子区甲基化阳性率为40.5%（34/84），显着高于癌旁组织的甲基化阳性率19.0%（16/84），差异有统计学意义（χ2=10.401，P=0.001）（表1）。
2.2AXIN2基因启动子甲基化与乳腺癌相关危险因素间的关系
AXIN2基因启动子甲基化与乳腺癌患者的初产年龄和流产史有关：初产年龄≥35岁的患者甲基化阳性率显着高于初产年龄﹤35岁的患者（χ2=5.467，P=0.019）；有人工流产史的患者甲基化阳性率显着高于无人工流产史的患者（χ2=8.372，P=0.006）。而AXIN2基因启动子甲基化与患者的年龄、月经初潮和生育次数间无关（P均﹥0.05）。（表2）
2.3AXIN2基因启动子甲基化与乳腺癌临床病理特征间的关系
在84例乳腺癌组织中，AXIN2基因启动子甲基化的阳性率与淋巴结转移、ER和PR表达有关。发生淋巴结转移者的甲基化阳性率显着高于未发生淋巴结转移者（χ2=5.338，P=0.021）；ER阳性患者的甲基化阳性率显着高于ER阴性者（χ2=9.141，P=0.002）；PR阳性者的甲基化阳性率显着高于PR阴性者（χ2=6.918，P=0.009）。AXIN2基因启动子甲基化阳性率在不同TNM分期、肿瘤大小、Cerb-B-2、P53及Ki67表达差异无统计学意义（P均﹥0.05）（表3）。
2.4乳腺癌组织和癌旁组织中AXIN2基因的mRNA表达水平
AXIN2基因mRNA相对表达量乳腺癌组织为0.22±0.03，显着低于癌旁组织的0.46±0.06（t=3.527,P﹤0.001）（图1）；在乳腺癌组织中，甲基化阳性乳腺癌组织的mRNA相对表达量为0.13±0.02，显着低于甲基化阴性乳腺癌组织的mRNA相对表达量0.29±0.04（t=3.616,P﹤0.001）（图2）。
2.5不同浓度5-Aza处理后ZR-75-1细胞AXIN2基因mRNA的表达
分别给予5.0μmol/L（低浓度）和10.0μmol/L（高浓度）的5-Aza处理ZR-75-1细胞，对照组不使用5-Aza处理，72h后检测AXIN2基因的mRNA相对表达量。结果显示，低浓度组和高浓度组的mRNA表达水平均显着高于对照组（P均﹤0.05），且高浓度组的mRNA表达水平显着高于低浓度组（P﹤0.05）（图3）。
03讨论
基因启动子区DNA甲基化异常是肿瘤中经常发生的事件，甲基化异常升高能导致多种调节基因的转录沉默，从而降低相关基因的表达，而甲基化降低可促进转录激活因子和RNA多聚酶与靶序列的结合，从而促使相关基因的高表达、近年来，DNA甲基化，尤其是乳腺癌重要信号通路相关基因的DNA甲基化，在乳腺癌发生、发展中的作用成为研究热点[13]。研究显示，Wnt/β-Catenin信号通路与乳腺癌的发病机制有关，该通路的异常激活使得c-myc和cyclin D1转录增强，其在乳腺癌的发生、发展中起到关键作用[14]。当使用Wnt/β-Catenin信号通路抑制剂阻断该通路时，乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力显着降低[15-16]。研究表明Wnt/β-Catenin信号通路相关基因的启动子区甲基化与乳腺癌的发生、转移密切相关，如DACT2基因甲基化可通过激活Wnt/β-Catenin信号促进乳腺癌发展[3-4]，而ALX4基因甲基化可阻断Wnt/β-Catenin信号激活从而抑制乳腺癌的进一步发展[5]。AXIN2也是Wnt/β-Catenin信号通路的一 个重要的抑制因子， 该基因低表达可促使Wnt/β-Catenin信号激活，从而参与到肿瘤发展中。
本研究结果表明，乳腺癌组织的AXIN2基因启动子甲基化阳性率（40.5%）显着高于癌旁组织的甲基化阳性率（19.0%），这与其他肿瘤研究中的结果一致。刘欣[9]在肝细胞癌中发现AXIN2基因DNA甲基化水平显着高于正常肝细胞，Kandimalla等[8]在结肠癌中也发现AXIN2基因甲基化水平显着升高，且可作为结肠癌复发的预测标志物。我们检测了乳腺癌组织和癌旁组织的AXIN2基因mRNA表达水平，结果发现mRNA在乳腺癌组织中的表达显着低于在癌旁组织中的表达；在乳腺癌组织中，甲基化阳性组织的mRNA表达水平也显着低于甲基化阴性组织的mRNA表达水平，这表明AXIN2基因甲基化异常升高与mRNA降低表达有关。此外，通过使用不同浓度的甲基化抑制剂2-Aza处理人乳腺癌ZR-75-1细胞，发现AXIN2 mRNA表达显着上调，这进一步验证了乳腺癌中AXIN2基因启动子区甲基化异常可通过调控基因转录水平，从而参与到乳腺癌的发生机制中。
此外，本研究探讨了AXIN2基因启动子甲基化与乳腺癌相关危险因素及临床病理特征间的关系。结果显示，初产年龄越高，甲基化阳性率也显着增高，有过人工流产史的患者甲基化阳性率显着高于无人工流产史的患者。我们还发现发生淋巴结转移者的AXIN2甲基化阳性率显着高于未发生淋巴结转移者，这表明AXIN2启动子甲基化可能与疾病进展有关。此外，ER阳性患者的甲基化阳性率显着高于ER阴性者，PR阳性者的的甲基化阳性率显着高于PR阴性者。众所周知，乳腺癌组织中ER及PR是评估乳腺癌预后的重要指标，也与内分泌治疗的疗效有关[13]，本研究结果提示AXIN2启动子甲基化可能与乳腺癌的预后有关，但是否可作为乳腺癌预后标志物，还需在未来的研究中进一步探究。
综上所述，AXIN2基因启动子区DNA甲基化与乳腺癌的发生、发展有关，在临床上有一定应用价值。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献略
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