比利时Biocartis公司的Idylla System（中文商标“弈景”）使用石蜡包埋组织样本（FFPET）检测肿瘤基因突变，可以直接上样FFPET，仪器全自动运行。期间提纯好核酸后，不需要额外测定核酸浓度，直接扩增检测。这么神奇，肿瘤基因突变检测不需要测定核酸浓度，直接PCR。这时，我们不得不介绍一下功能强大的PlexPCR技术。
PlexPCR技术来自于SpeeDx公司，该公司成立于，是一家总部设在澳大利亚的私营公司。SpeeDx专注于超越简单的检测分子诊断解决方案，致力于提供全面的分子检测信息，以改善患者管理。其技术主要应用于呼吸道感染疾病、性传播疾病等。PlexPCR技术的用户包括Biocartis、Cepheid、GSK、LabCorp、ROCHE等全球知名企业。
PlexPCR包含两项专利技术：PlexZyme和PlexPrime。与其他基于probe的方法相比，这种技术能够实现高性能和可靠的多重qPCR。下面我们就详细介绍一下PlexPrime和PlexZyme技术。
（一）PlexPrime
是一种创新性的核酸扩增方法，它可以创造出与亲本序列明显不同的扩增产物。通过联合使用PlexPrime和PlexZyme技术可以在高灵敏度和特异性的性能下进行多重突变检测。PlexPrime具有以下特点：
多重兼容性：在一个反应里检测多种突变全能性：适用于非保守易变异等难度大的序列高特异性：使用插入序列显著提高了亲本序列和扩增产物的差异PlexPrime引物由三部分组成
5 区域将引物固定在靶标的一个特定位置上；3’区域引入一个与突变碱基匹配碱基，从而选择性地放大靶标序列；插入序列作为一个桥接结构，它既可以作为特殊序列插入到靶标，并复制到扩增产物里，同时这个插入序列会进一步增加3 区域的选择压力，提高特异性。
图1 PlexPrime引物结构
PlexPrime引物的这种独特特性使其非常适合：
在多重反应下检测和识别突变或单核苷酸多态性。a)插入序列增加了3’区域的扩增匹配严格性，使得扩增的特异性更强；b)PlexPrime引物扩增产物包含的插入序列与亲本序列具有明显不同的8-15个碱基，而不是简单的1个或2个碱基，这使得它们在多重反应中很容易被识别。检测含有非保守区域的核酸序列。a)插入序列“跳过”非保守区域，替换非保守序列并生成“一般性”的扩增子。b)从那些新的“一般性”扩增子可以获得同等和有效的扩增。（二）PlexZyme
PlexZyme由两种被称为”partzymes”的DNA寡核苷酸组成，它们在PlexPrime引物的扩增产物上进行组装，形成功能活性。它们对PlexPrime引物的扩增产物的检测具有特异性，因为它包含了匹配靶标基因的独特的插入序列的特殊序列。PlexZyme技术提供高性能和可靠的qPCR检测，是整个SpeeDx产品组合背后的关键驱动。在PlexZymeqPCR过程中，PlexPrime引物引物扩增靶标序列产生的扩增产物，可以作为PlexZyme组装的模板。一旦”partzymes”组装成PlexZyme酶，通用探针与PlexZyme酶结合后裂解产生荧光。PlexZyme具有以下特点：
高灵敏度：能够检测到＜10个拷贝的靶标；适合定量：从106到10个拷贝良好的动态检测范围；高特异性：2个引物和2个”partzymes”与扩增产物形成4个结合点；高灵活性：独立于目标序列的探针设计，可以使用一套特征良好的通用探针。PlexZyme酶(以前称为MNAzymes)本质是一种具有催化功能的DNA复合物PlexZyme针对靶标和探针的双特异性最大限度地减少了假阳性信号的机会，而通用探针的使用使得多重反应性能更易稳定。
图2 未组装的PlexZyme酶
具有有活性功能的PlexZyme酶由两种DNA寡核苷酸组成，称为“partzymes”。每个部分酶只包括催化核心的一部分，催化核心两侧有与靶序列结合的感应臂和与通用探针结合的基板臂。
图3 “partzymes”组装后形成有活性功能的的PlexZyme酶
“partzymes”本身是没有活性的，然而当与靶标结合后会形成有活性的PlexZyme酶。
图4 PlexZymes催化通用探针的裂解，产生可以实时监测的荧光信号
PlexZymeqPCR的许多特性，使其具有优越的多重性。例如”partzymes”的灵活性使其可以通过简单调整”partzymes”的感应臂来与新的靶标结合，保留原来的基板臂，仍然适用原来的探针。在多重反应中，探针亦可用不同的荧光基团进行标记，从而可以同时实时监测检测各个靶标序列所对应的荧光信号。PlexZyme酶的高度多元性可以最大限度地提高qPCR仪器的输出。
最后，让我们通过两幅图看一下PlexPCR是如何工作的。
图5 PlexPrime引物扩增
在PCR过程中，插入序列的补体(c-Insert)和一个碱基错配被整合到PlexPrime扩增产物中。
图6 ”partzymes”识别靶标组装成PlexZyme裂解荧光探针
PlexZyme对PlexPrime扩增产物的检测是特异性的，因为它包含了针对靶标基因的独特插入序列。PlexZyme酶催化探针的裂解，产生与靶标基因存在相对应的荧光信号。
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