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易基因｜基于DNA甲基化的CD8+肿瘤浸润性淋巴细胞标记可评估结直肠癌的免疫反应和预后

时间：2021-03-20 09:41:27

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介绍

结直肠癌(CRC)是世界范围致死率较高的癌症类型之一，免疫治疗在治疗结直肠癌方面发挥着越来越重要的作用。免疫检查点抑制剂可以促进T细胞攻击肿瘤细胞，延长患者生存期。同时，由于结直肠癌免疫反应的异质性，其免疫治疗仍具有巨大挑战性。肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)与肿瘤免疫应答相关，可用于预测患者的免疫治疗反应和生存期，其中CD8+TIL可以杀死肿瘤细胞，被认为影响结直肠癌的预后、免疫治疗反应和生存结果的重要因素。

DNA甲基化是组织特异性的，在组织分化中起着决定性的作用。因此，DNA甲基化在不同组织和器官的细胞中是不同的，它有可能成为识别不同细胞的标志物。其中，中等CpG密度区的甲基化是高度保守的，可以区分不同来源的组织类型。此外，在淋巴细胞激活和增殖过程中，部分甲基化区域(PMD)会发生低甲基化，在这些区域中CpG的甲基化可能会将免疫细胞与其他免疫细胞区分开来，这可以通过solo-WCGW来预测。对此，作者开发了一种新的检测方法，通过利用这些低CpG密度的甲基化来开发生物标记物。

在这项研究中，作者的目的是分析免疫细胞和结肠上皮细胞的全基因组DNA甲基化图谱，以确定CD8+T细胞特异的差异甲基化位置(DMP)。然后，作者通过使用这些DMP构建CD8+MeTIL评估系统来分析CD8+TIL和结直肠癌以及其他癌症生存结果的关系。最后，作者开发了一种基于qPCR的检测方法，样本来自于福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的肿瘤组织，提取其中少量DNA即可进行检测。

结直肠肿瘤中CD8+TIL的DNA甲基化特征

这项研究的整体思路和人群队列设计如图1所示。为了发现CD8+MeTIL特征，作者首先利用EPIC芯片（即850K芯片）分析基因组甲基化数据，将CD8+T细胞的甲基化特征与肿瘤和正常结直肠上皮细胞以及其他人源免疫细胞(包括CD4+T细胞、B细胞、粒细胞和单核细胞)的甲基化特征进行了比较，作者鉴定出了73个CD8+T细胞特异性的DMP。

图1

在分析这些特异性DMP生物学特性时发现，大多数CpG位于基因内区域(80.6%)，包括CD8A、CD8B、CD96等CD8+T细胞功能基因，少数为基因间CpG(19.2%)。作者进行了GO分析，发现大多基因富集在免疫相关功能上(图2C)。这一发现证实了已鉴定的CpG与CD8+T细胞有一定的相关性。

接下来，作者对这73个CpG的基因组特征进行了分析。大多数位于低CpG密度区(60.3%，44个探针)和中等CpG密度区(34.2%，25个探针)，少数(5.5%，4个探针)位于高CpG密度区(CpG岛)(图2B)。根据已有的基因组注释，其中6个CpGS是Sole-WCGW CpGS，10个CpGS位于共同的PMD中。

作者应用最小绝对收缩和选择算子(LASSO)机器学习的方法，从73个CD8+T细胞特异性CpG中选择出了最具代表性的CpG，命名为CD8+MeTIL score，包括位于CpG低密度区的三个CpG(cg02430840、cg06113913和cg12673499)。将CD8+MeTIL值与β值及相关系数进行套索回归分析，得出CD8+MeTIL值为：

cg02430840×0.28724+cg06113913×0.40171+cg12673499×0.45016

为了测试CD8+MeTIL评估系统的性能，作者使用三个CpG对细胞进行无监督聚类分析。通过评估这三种CpG，CD8+T细胞可以很好地与其他细胞类型区分开来(图2D)。具体的分类结果如图2E所示。接下来，作者试图用EPIC芯片数据调查45例SAH-SYSU结直肠癌病例中CD8+MeTIL评分中所选的三个CpG的甲基化特征与临床病理特征之间的关系(图2F)。作者发现，CD8+MeTIL评分较低且甲基化较少的三种CpGS与低频率微卫星不稳定性(MSI-H)、高分化的结直肠癌相关,这些结果与之前基于IHC的CD8+TIL相关性研究结果一致。

cg02430840×0.28724+cg06113913×0.40171+cg12673499×0.45016

图2

基于qPCR的CD8+MeTIL单碱基分辨率分析

作者建立了一种基于qPCR的分析方法(QASM)，以单碱基分辨率检测位于低CpG密度区域选定的三个CpG的甲基化。如图3A所示，每个CpG的甲基化和非甲基化等位基因可以通过探针被量化，其中甲基化百分比可以由两个探针的信号比来表示。

为了验证这种基于qPCR的方法确定CD8+MeTIL评分的有效性，作者接下来将QASM分析的结果与SAH-SYSU队列中的EPIC芯片和焦磷酸测序的结果进行了比较。基于qPCR的甲基化百分率和基于EPIC芯片的甲基化百分率在每个CpG中呈线性相关(图3B；n=45，r=0.5225-0.7274，p<0.001)。此外，QASM法测定的甲基化百分率与焦磷酸测序测定的甲基化百分率呈线性相关(图3C；n=12，r=0.7170-0.9411，P<0.01)。QASM分析产生的CD8+MeTIL分数与EPIC芯片和焦磷酸测序产生的分数呈线性相关(图3；n=45和12，r分别为0.7357和0.9025；P<0.001)。因此，QASM法是测定CD8+MeTIL评分的一种可靠的技术方法。

为了用CD8+MeTIL评分测定CD8+TIL的分布，作者首先用QASM方法检测了结直肠癌组织(n=45)及其周围正常组织(n=44)、正常(NCM460)和癌变(RKO、SW48、HCT8和HCT15)结肠上皮细胞以及代表结直肠癌组织主要成分的多种免疫细胞(CD4+T细胞、单核细胞和B细胞)中3种CpG的甲基化百分率。与其他细胞相比，CD8+T细胞的CD8+MeTIL评分明显降低(图4A)，并与EPIC芯片数据集的结果一致，进一步支持了基于qPCR的CD8+MeTIL评分准确性，可以用这种方法确定肿瘤样本中CD8+T细胞的丰度。

图3

用CD8+MeTIL方法评估CD8+TIL在结直肠癌中的分布

作者应用这种基于qPCR的CD8+MeTIL方法来评估肿瘤组织中的CD8+TIL，并将其与SAH-SYSU队列中IHC染色测定的CD8+TIL(CD8+PaTIL)进行比较(图4B、C)。CD8+PaTIL与CD8+MeTIL呈显著负相关(r=−0.6385，p=0.011)。

作者进一步比较了CD8+MeTIL评分和基于CD8+表达的TIL(CD8+ExTIL)，CD8+ExTIL是CD8B基因表达的分子特征，用于评估CD8+MeTIL。作者检测了编码部分CD8抗原的CD8B基因在SAH-SYSU队列中的mRNA表达。CD8+MeTIL评分与CD8B基因表达特征呈显著负相关(r=−0.4079，p=0.008；图4D)。总之，QASM法测定的CD8+MeTIL评分较低与结直肠癌组织中CD8+T细胞平均密度(CD8+PaTIL)和CD8B基因(CD8+ExTIL)表达增加相关。

接下来，作者根据CCFR队列中结直肠癌患者的分子特征，对QASM法测定的CD8+MeTIL评分的分布进行评估。MSI-H组CD8+MeTIL评分明显低于低频度微卫星不稳定/稳定组(77.8vs82.1，p<0.001)；此外，CIMP阳性肿瘤(78.5vs81.6，p=0.048)和右半结肠肿瘤(78.9vs82.1，p<0.001)的CD8+TIL评分明显低于CIMP阴性肿瘤和左半结肠肿瘤(图4E)。

图4

CD8+MeTIL在结直肠癌和多发性肿瘤预后中的价值

考虑到CD8+T细胞浸润在肿瘤免疫应答中的作用，作者试图测试CD8+MeTIL评分在预测结直肠癌预后中的作用。作者用QASM法测定SAH-SYSU(n=237)和CCFR(n=335)队列中的癌细胞CD8+MeTIL评分。在SAH-SYSU(图5A；HR=0.303，95% CI 0.109~0.842，p=0.022)和CCFR(图5C；HR=3.17，95% CI1.26~7.99，p=0.009)队列中，CD8+MeTIL评分低的患者OS明显好于CD8+MeTIL评分高的患者。在多变量Cox分析中，调整了年龄、TNM分期、KRAS突变和淋巴血管侵犯等其他显著危险因素后，进一步证实了这一结果。

接下来，作者探讨CD8+MeTIL评分是否可以在标记物预测分析中进一步对MSI-H/MSI-L/MSS患者进行分类。在生存分析中，根据SAH-SYSU和CCFR队列中的MS状态和CD8+MeTIL评分对患者进行分组。与预期一致，死亡风险可以通过CD8+MeTIL评分在每个微卫星亚组中进一步分层(图5B、D)。值得注意的是，MSI-H和CD8+TIL丰富(CD8+MeTIL评分低)的患者在两个队列中都有最好的OS，而MSI-L/MSS和CD8+TIL水平低(CD8+MeTIL评分高)在两个队列中都预示着OS较差。虽然这一评分是在结直肠癌中制定的，但作者利用EPIC甲基化芯片数据发现，CD8+MeTIL评分也与非小细胞肺癌的抗PD-1治疗反应和生存质量显著相关。

由于CD8+MeTIL标记是使用EPIC甲基化芯片数据在结直肠癌中开发出来的，作者使用TCGA中提供的450K甲基化芯片数据对其他癌症类型进行了生存分析。在24种癌症类型中的6种癌症(肺腺癌(p=0.033)，肺鳞癌(p=0.038)，结直肠癌(p=0.048)，宫颈鳞癌(p=0.044)，乳腺浸润性癌(p=0.011)，肾上腺皮质癌(p=0.033))中，低CD8+MeTIL评分与较好的生存结果显著相关(图5F)。综上所述，这些数据表明CD8+MeTIL评分可以预测多种癌症的生存结果。

图5

结论

肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，尤其是CD8+TIL可用于预测免疫治疗反应和预后。然而，目前对CD8+TIL的评估依赖于高度特异性的组织病理学方法。因此，在这项研究中，作者开发了一种基于DNA甲基化的CD8+MeTIL标记。通过使用从Illumina EPIC甲基化芯片中鉴定的CD8+T细胞特异性差异甲基化位点(DMP)构建CD8+MeTIL评估标准。采用免疫细胞、结肠上皮细胞和两个结直肠癌队列(n=282和335)，建立了一种基于PCR的DNA甲基化定量分析方法，在单碱基分辨(QASM)下检测不同的CD8+MeTIL信号。

作者建立的CD8+MeTIL标记的QASM检测方法可以完全定量、准确、简便地检测CD8+TIL的分布。QASM法测定的CD8+MeTIL与以组织病理学为基础的CD8+TIL和以基因表达为基础的免疫标记物有很强的相关性。此外，作者还进一步验证了这种方法在两个结直肠癌队列和与其他癌症的TCGA队列中对MSI/MSS状态和预后结果进行分层的能力，结果表明，低CD8+MeTIL评分(丰富的CD8+TIL)与MSI-H肿瘤相关，并预测这类患者会有更好的生存期。未来，CD8+MeTIL标记有可能成为一个具有重要临床诊断意义的生物标志物，能够为包括免疫治疗在内的多种治疗方法的选择提供帮助。

原文解读：