by 鸭蛋
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/10.2147/CMAR.S191565
知识点积累
RNA m6A甲基化修饰
N6-甲基化腺苷酸结构示意图
多变量Cox比例风险回归模型
由英国统计学家D.R.Cox于1972年提出，主要用于肿瘤和其他慢性病的预后分析，也可用于队列研究的病因探索。Cox回归模型能处理多个因素对生存时间影响的问题。
在进行Cox回归分析前，如果样本不多而变量较多，建议先通过单变量分析（KM法绘制生存曲线、Logrank检验等）考察所有自变量与因变量之间的关系，筛掉一些可能无意义的变量，再进行多因素分析，这样可以保证结果更加可靠。即使样本足够大，也不建议把所有的变量放入方程直接分析，一定要先弄清楚各个变量之间的相互关系，确定自变量进入方程的形式，这样才能有效的进行分析。单因素分析后，应当考虑应该将哪些自变量纳入Cox回归模型。一般情况下，建议纳入的变量有：1）单因素分析差异有统计学意义的变量（此时，最好将P值放宽一些，比如0.1或0.15等，避免漏掉一些重要因素）；2）单因素分析时，没有发现差异有统计学意义，但是临床上认为与因变量关系密切的自变量。
实验结果
1.基因表达谱：5个基因上调
作者利用四个HCC的数据集来分析，分别是TCGA-HCC，GEO数据库的两个数据集（GSE14520、GSE63898）和162个HCC患者样本（含癌样本和正常样本，文中称为GDGH数据集）。
对RNA m6a相关基因进行基因表达量分析，发现5个基因（METTL3、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、EIF3）在四个数据集中均上调。
2.生存曲线分析：METTL3和YTHDF1低表达预后好
对1中5个基因进行生存曲线分析，得到METTL3和YTHDF1高低表达组有显着性差异且低表达预后好。Fig2中，A、C、E为METTL3的生存曲线；A&B为TCGA数据集，C&D为GDGH，E&F为GSE14520。
3.免疫组化染色：METTL3、YTHDF1在HCC患者中高表达
取了10个患者样品，作免疫组化染色分析，发现METTL3蛋白主要分布在核内（Fig3 A&B），YTHDF1蛋白主要分布在胞浆（Fig3 C&B）。
4.Cox比例风险回归模型验证：METTL3和YTHDF1低表达预后好
5.联用METTL3和YTHDF1开发了一个risk significance method
根据METTL3和YTHDF1的平均表达量将患者分成三组：low-risk，medium-risk，high-risk。用Kaplan–Meier曲线作生存分析，发现low-risk（low METTL3/low YTHDF1）的预后最好，与前面得到的结果相同。
6.对METTL3和YTHDF1进行基因富集分析在TCGA和GSE14520两个数据集中就METTL3进行富集分析，取交集，得到7个重复KEGG通路，同理，就YTHDF1进行分析，得到8个重复KEGG通路。两者再取交集，得到5个通路，分别是细胞周期、RNA剪接（slicing）、DNA复制、base excision repair和RNA降解。说明METTL3和YTHDF1在HCC中可能参与了这5个通路活动。（GSEA plot省略，见原文）
总结与思考
1、METTL3在本文中认为是“癌基因”（下调预后好），但有研究表明在子宫内膜癌细胞中敲低METTL3会导致细胞增殖、锚定无关生长、迁移等，即推测METTL3为“抑癌基因”，与本文结论相反。本文证明了在HCC中METTL3是过表达的，以及METTL3和YTHDF1共同过表达组的预后最差。有足够的证据表明在HCC中METTL3和YTHDF1是“癌基因”。2、一项最新研究表明，敲低METTL3后，通过一种YTHDF2依靠机制显着抑制HCC肿瘤发生。这项研究表明了HCC中m6A的writers和readers的密切关系。YTH同源家族包含YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1、YTHDC2，但它们有各自不同的功能。值得注意的是，在本文中，虽然生存分析中筛选出的基因只有YTHDF1，但YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3在四个数据集中都是高表达的。在后续研究中，需要重点关注YTHDF1在HCC中发挥的作用。
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