TILs细胞免疫疗法是由美国国立卫生院的Steve Rosenberg教授从上世纪80年代开始进行研究的肿瘤免疫疗法。TIL（Tumor infiltrating lymphocytes）是指肿瘤浸润的淋巴细胞，这些淋巴细胞中有些是能够杀伤肿瘤细胞的，因此科学家们希望能够把这些肿瘤组织中的淋巴细胞分离并扩增，再回输给患者，或许就能够治愈患者的肿瘤。目前为止，其相关研究主要以治疗黑色素瘤为范本，到目前为止，有效率达到56%，包括22%的晚期病人被“临床治愈”。随着临床医学技术的进步，尤其是基因测序，免疫特异性检测技术，包括其它免疫疗法的成熟，最近它也开始在其它癌症类型中展现疗效，且Rosenberg教授也认为该疗法有着治疗所有上皮性实体肿瘤的潜力。
肿瘤细胞在肿瘤发生过程中往往会发生非同义突变[1]，一些被称为neoantigen（肿瘤抗原）的非同义突变可以通过T细胞受体（TCR）与主要组织相容性复合体（MHC）分子（人类的HLA）的结合来活化T细胞，随后在靶细胞上呈现含有突变氨基酸（pHLA）的肽。最近，在Rosenberg教授的一项涉及到101例转移性黑色素瘤患者的研究中发现，回输自体TILs可分别达到24%和56%的持续完全缓解（CR）率和总缓解率（ORR）[2]。然而，在转移性上皮性肿瘤患者中，以肿瘤抗原为靶点的TILs疗法治疗仅仅达到了很小比例的肿瘤消退[3]。Rosenberg认为对这种低疗效的一个可能解释是，用于治疗的T细胞仅含有很低比例的具有抗肿瘤活性的T细胞，这可能是非活性细胞在体外扩增的过程中过度生长的结果。此外，由于肿瘤异质性，TILs靶向的肿瘤抗原可以在肿瘤中亚克隆表达，导致肿瘤逃逸。为了解决这些问题，在作者所报道的一项新的临床试验中，他们使用从患者身上分离出的肿瘤抗原活性性TCR通过逆转录病毒转入外周血单核细胞（PBMCs）。针对多个肿瘤抗原或共有的癌基因可能增加TILs攻击肿瘤多个克隆的机会。
筛选TIL是临床试验NCT0174121中的一个重要组成部分（如上图所示），其按照如下步骤进行（JCI Insight. ;3(19): e122467. DOI:10.1172/jci.insight.122467）：
1. 在没有外源性细胞因子的情况下，将肿瘤细胞消化液解冻并放置在完全培养基中过夜，用于将切割成1-2 mm3的小块肿瘤消化。
2a. 将切割出来的一小块肿瘤进行全外显子测序（WES）和RNA测序以识别非同义突变。基于突变调用，据此合成在13位包含突变的25 mer多肽。
2b. 根据PD-1和/或T细胞激活生物标志物（CD134或CD137）的表达对细胞进行清洗、标记和分类。
3. 在96孔板中，以3细胞/孔的细胞密度，将细胞在经辐照的同种异体供体细胞、3000 IU/mL IL-2和anti-CD3ε（OKT3）的存在下培养细胞以进行扩增。
4. 利用2a中合成的多肽对培养出的TILs进行初步抗肿瘤活性筛选。为了尽量减少检测，将2或3个培养基中的细胞合并到检测孔中。
5a. 将显示出抗肿瘤活性的TILs进行进一步扩增，为进一步实验做好准备。
5b. 对共培养试验中的细胞进行标记，将反应性T细胞转移到含有裂解缓冲液和用于TCR测序的PCR引物的96孔板中，用于快速测序。
在这项研究中，作者开发了一种无偏倚、2步、高通量限制稀释（high-throughput limiting-dilution）法用于检测和分离肿瘤抗原反应性T细胞，这一套方法可能可以克服上述一些问题。这种方法能够增强对转移性非黑色素瘤肿瘤样本中肿瘤抗原反应性TILs的检测，并快速分离肿瘤抗原反应性TCR，以供临床试验使用。在这种方法中，作者分离出表达T细胞共刺激标记物（CD134或CD137）和/或PD-1的TILs。如此选择的原因是，使用这两种标记物将增强肿瘤抗原反应性CD4+细胞的富集，否则仅使用CD137和表达低水平PD-1的Temra细胞来富集TILs则会错过这一点。经过分类的细胞进行限制性稀释克隆，然后在微孔板中进行扩增，以避免以耗尽反应性T细胞为代价而发生的无反应性的T细胞过度生长。随后对培养出的TILs进行针对包含患者肿瘤中存在的突变的25mer多肽的检验。采用这种方法，作者成功地在6个上皮癌样本中检测到19种肿瘤抗原T细胞反应活性。此外，作者还从2例患者中分离出对KRASg12v和TP53g245s热点突变有反应的CD4+T细胞。值得注意的是，反应性培养物是高度寡克隆或克隆的，这使得作者能够利用单细胞聚合酶链反应（scPCR）高效地对反应性TCR进行测序。该策略为增强新抗原反应性TILs的检测提供了一种更为直接有效的方法，可用于快速识别肿瘤抗原反应性TCR，可用于为癌症患者生成个性化的肿瘤抗原靶向TCR基因治疗。
参考文献
[1] VogelsteinB, Papadopoulos N, Velculescu V E, Zhou S, Jr D L, Kinzler K W. Cancer genomelandscapes. Science, ,339(6127):1546-1558.
[2] Goff S L, Dudley M E, Citrin DE, Somerville R P, Wunderlich J R, Danforth D N, Zlott D A, Yang J C, Sherry RM, Kammula U S. Randomized, Prospective Evaluation Comparing Intensity ofLymphodepletion Before Adoptive Transfer of Tumor-Infiltrating Lymphocytes for PatientsWith Metastatic Melanoma. Journal of Clinical Oncology, ,34(20):2389-2397.
[3] TranE, Robbins P F, Lu Y, Prickett T D, Gartner J J, Jia L, Pasetto A, Zheng Z, RayS, Groh E M, Kriley I R, Rosenberg S A. T-Cell Transfer Therapy TargetingMutant KRAS in Cancer. The New England Journal of Medicine,,375(23):2255-2262.
[4] Stevanović S, Pasetto A, HelmanS R, Gartner J J, Prickett T D, Howie B, Robins H S, Robbins P F, Klebanoff CA, Rosenberg S A. Landscape of immunogenic tumor antigens in successfulimmunotherapy of virally induced epithelial cancer. Science,,356(6334):200-205.
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