外泌体引发DC介导的效应T细胞肿瘤免疫治疗

肝细胞癌发病率及死亡率高，对于治疗反应差，基于肿瘤细胞裂解物引发的树突状细胞(DCs)激活的免疫治疗作用十分有限。

本文作者表明，相比于肿瘤细胞的裂解物，携带有HCC抗原的肿瘤外泌体（TEXs）可以引发强烈的免疫反应。在经过TEXs联合DCs处理过后的原位及异位HCC小鼠的肿瘤被明显的抑制住。重要的是，肿瘤免疫微环境在TEXs联合DCs处理过后的原位HCC小鼠被明显的改善（由肿瘤部位的IFN-γ水平上升，IL-10及TGF-β水平下降证实）。正如所料，T细胞在TEXs联合DCs引起的免疫反应中扮演重要角色。来自HCC细胞的外泌体不仅促进HCC特异性的裂解还可以为胰腺癌细胞提供交叉防护效应。由人类HepG2来源的外泌体加上DCs引发的HCC特异性的裂解，可以在不同人类HCC细胞中观察到，说明无关乎HLA类型。

总之作者发现HCC TEXs可以携带HCC抗原，引起强烈的DC调节免疫系统反应并改善HCC肿瘤免疫微环境。

F1、TEXs中肿瘤相关的抗原及抗原伴侣的富集

为了证实小鼠HCC细胞hepa1-6TEXs作为抗原在DCs调节的抗肿瘤免疫的可能性，我们以外泌体的生物标志蛋白质（跨膜蛋白CD63和Alix）为TEXs的特征，证明作者提取的TEX是外泌体的标志蛋白，而不是细胞的蛋白（F1A），并且有茶杯托样的结构（F1B）。外泌体有许多的源自细胞的分子结构，因此作者检测了HCC具有代表性的两个抗原即甲胎蛋白（AFP）、蛋白多糖3（GPC3）。明显的是，相较于亲代的细胞，AFP在TEXs表达量有所富集，而GPC3表达量相似，免疫调节器分子伴侣热休克蛋白在TEXs中也有出现（F1C）。相比于未经过处理的DCs，DCs在与TEX共同培养并摄取后，细胞变成熟并且被激活，表现在细胞表面CD11c（骨髓DC标志）水平的升高，MHC Ⅰ和MHCⅡ，共刺激因子CD80，CD86和粘附分子ICAM的表达，从而验证了heap1-6TEX 是否会激活DCs（F1D）。

F2、体内体外的实验中，TEXs相比于细胞裂解物在引发DC介导的抗肿瘤免疫反应更具优势

为了检测是否可以引起T细胞调节的hepa1-6细胞的裂解，作者在体外优化了抗肿瘤细胞裂解效应的TEX所需浓度。3个不同的浓度的TEX处理相应3个相同浓度的DCs。F2A，可以看出由DCTEX刺激效应T细胞，引起的hepa1-6细胞溶解具有TEXs剂量依赖趋势，最高达50.4%的肿瘤细胞发生溶解，TEXs浓度在80μg/ml。相反，经过肿瘤裂解物共同培养的DCs引起效应T细胞最多裂解34.8%的肿瘤细胞。为了调查TEXs在体内引起免疫排斥的可能性，DCs在分别经过40μg/ml的TEXs和100μg/ml的肿瘤裂解物激活后，静脉注入MHC匹配的异位肿瘤小鼠体内，相比于 DClys，DC TEX注入的小鼠体内的肿瘤体积明显抑制（F2B、C）。处理组的小鼠血清经过流式分析发现CD8 T细胞明显增加，相同的情况也出现在处理组的小鼠肿瘤组织中（F2D、E）。 DCTEX 处理组的小鼠肿瘤组织中CD25 调节T细胞有所减少，指示在异位HCC小鼠身上肿瘤微环境的改善（F2F）。

F3、采取TEXs预防性有效的抑制肿瘤细胞

考虑到许多个体具有患HCC的风险比如HBV携带者可能对于免疫方法有效，作者研究了DEXs在HCC中的预防性的免疫调节作用。C57BL6小鼠一周3次静脉注入DCTEX，第22天皮下注入hepa1-6细胞进行饲育F3A）。相较于其他DC及PBS处理，发现预先处理的小鼠的肿瘤生长被明显抑制（F3B），越到后期差别越明显F3C）。更重要的是，DCTEX小鼠 58天仍旧存活，另外DC及PBS处理已经死亡（F3D）。

F4小鼠中TEXs可以改善免疫及肿瘤微环境

在用C57BL6小鼠构建原位HCC小鼠模型第5天开始注入DCTEX，之后每5天注入1次知到第23天进行小鼠处理F4A）。在与对照组相比，处理的小鼠肿瘤体积明显减少（F4B），并且小鼠的生存时间率也有所增加F4C），血清中的CD8 数量上也有所增加（F4D），T细胞免疫反应的功能细胞因子IFN-γ水平上升（F4E），免疫抑制因子白介素-10（IL-10）及转换生长因子-β（TGF-β）明显减少（F4F）。这些证明了DCTEX的处理将免疫环境从抑制转换到刺激对于HCC病人预后而言至关重要。

F5、在原位HCC小鼠中TEXs可以改善免疫及肿瘤微环境

为了研究在原位HCC小鼠是否存在效应T细胞招募到原发肿瘤部位，作者研究了在肿瘤组织中T细胞的浸润情况。相比于对照组，对肿瘤组织的T细胞定量分析发现CD8 T细胞数量明显上升，CD25 调节性T细胞有所减少F5A、B），这证明了DCTEX处理可以重塑原位HCC小鼠的肿瘤微环境。相比于对照组，对肿瘤组织进行CD3 和FoxP3 进行免疫组化染色，发现DCTEX 处理CD3 T细胞染色丰富，FoxP3 调节性T细胞染色较少（F5C），同时也对肿瘤组织的细胞因子进行检测，发现IFN-γ水平上升F5D），免疫抑制因子白介素-10（IL-10）及转换生长因子-β（TGF-β）水平减少（F5E）。

F6、TEXs激活T细胞依赖的抗肿瘤免疫反应

前述实验是具有免疫能力的小鼠身上发现接着，作者研究是否DCTEX也可引发免疫缺陷的裸鼠的抗肿瘤效应，与应用在具有免疫功能的小鼠身上的相同剂量，应用在裸鼠身上，第5天建立异位肿瘤模型。发现在经过、DC及PBS处理的小鼠肿瘤大小没有明显差异F6A），这说明T细胞在DCTEX发挥功能中起重要作用。为了验证活化T细胞的功能，作者测定了DCTEX及DC处理过的T细胞的IFN-γ和IL-2，发现其在处理组中水平叫高），这个证明了T细胞对DCTEX会产生反应。F6C展示的是在不同的E:T(效应器：靶标)比例中靶标刺激的效应器T细胞引发的heap1-6 HCC细胞的溶解情况。DCTEX处理过的细胞溶解最高达72%，与对照组形成明显差别，这个发现表明TEXs是引发DC细胞调节T细胞依赖的细胞溶解的抗原携带者。

F7、在老鼠及人类细胞中TEXs使得DC具有相互交叉的保护作用

之前做过报道，在许多HCC病人中肿瘤细胞的裂解物证实有引发不关乎HLA类型的交叉保护的能力，因此作者研究拥有各种亲代信号的TEXs是否可以变成共同抗原的源头，以交叉刺激具有不同基因背景的其他HCC细胞。由激活的同源的来自脾脏的效应T细胞，用于裂解H22 HCC细胞（H-2d）。MHC匹配的hepa1-6和同种异系的H22细胞具有近似的肿瘤特异型细胞裂解率，在MHC匹配的胰腺癌细胞系Panc02也可以看到交互保护作用F7A）。为了研究是否TEXs可以诱导人类肿瘤特异性的细胞裂解，作者评估源自HepG2（人类HCC细胞系，高表达AFP）的外泌体。DCs源自正常捐赠者的外周血单核细胞（PBMCs）与HepG2的TEXs共同培养。通过IL-2和IFN-γ水平的增高证明了HepG2的TEXs处理后的DCs可以激活同源人的淋巴细胞（F7B）。与对照相比，将激活的效应T细胞同HepG2共培养导致明显升高的肿瘤细胞裂解率，尤其是，这个肿瘤特异性的细胞溶解也在其他像是Hep3B和LM3这种表达AFP人类HCC细胞中有观察到（F7C），这意味着人类HepG2 TEXs是一个在人类HCC细胞中，无关HLA类型，提供交叉保护的抗原源头。

讨论：

1、由于肝脏独特的免疫耐受特性使得HCC的治疗干预成为一个很大的挑战。基于DC的免疫治疗在早期的人类临床试验中起到一定作用，但是效果不充分。因此迫切需要有效的治疗手段，尤其是那种抵消肝脏组织自然免疫抑制和增大肿瘤特异性的免疫的治疗手段。

本文作者展示了源自HCC细胞的外泌体可以当做抗原携带者从而引发DC调节的异位及原位HCC小鼠模型的肿瘤抑制效应。

重要的是，DCTEX处理后原位HCC小鼠的免疫及肿瘤的微环境得到改善（免疫刺激因子水平的上升及CD8 T细胞的浸润，免疫抑制调节T细胞核细胞因子水平降低），这些结果表明TEXs作为一个潜在的抗原从而刺激DC介导的抗肿瘤免疫。

2、由于在HCC细胞中没有广泛表达的单一抗原，因此抗原的来源选择对于DC调节的免疫治疗是至关重要的。此前的研究发现HLA限制性多肽并没有引发免疫反应并且单个抗原有其免疫逃避的风险。这里我们使用HCC TEXs作为多重抗原的源头用以激活DC调节免疫治疗。这个方法采取了TEXs的独特的特征即携带一系列的抗原并且可以引发抗原特异性的CD4 辅助性及CD8 细胞毒性的T细胞反应，因此导致增加的DCs免疫治疗效应。（转自：exosomes）

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