PTEN（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10）基因是一个与肿瘤发生关系密切的抑癌基因，该基因编码由403个氨基酸组成的经典PTEN蛋白，具有磷酸酶的活性，可通过拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性，抑制肿瘤发生发展。PTEN蛋白可以通过多种机制进入细胞核内。核PTEN可以与多种蛋白质相互作用，影响基因组稳定性等，发挥肿瘤抑制作用[1]。除了可以编码经典PTEN蛋白之外，Pten基因还可以通过两个不同的非经典翻译起始点编码产生两种长形式的蛋白变体，称为PTENα和PTENβ，两者分别在经典PTEN蛋白的氨基端多了一段173和146个氨基酸的延伸序列。尽管二者与PTEN序列同源性高，但可能拥有不同的属性，它们在肿瘤发生过程中的表达调控和功能尚不清楚[2]。11月4日，国际细胞生物学权威期刊《自然·细胞生物学（Nature Cell Biology）》以“PTENα and PTENβ promote carcinogenesis through WDR5 and H3K4 trimethylation”为题，在线发表了上海交通大学医学院癌基因和相关基因国家重点实验室、教育部细胞分化和凋亡重点实验室陈国强教授课题组的最新发现，揭示PTENα/β促肿瘤功能及分子机制[3]。
结果
1 PTENα/β和PTEN蛋白在肝癌中表达不一致，且受USP9X调控
在中国，肝癌是最普遍的威胁生命的疾病之一，且Pten基因的突变、缺失或扩增等基因组改变在肝癌中不常见[4]，因此选择对50例肝癌患者的肿瘤组织和邻近组织做PTENα/β蛋白表达检测。长曝光发现PTENα和PTENβ比PTEN表达低。PTENα/β的表达并不是总与PTEN一致，在某些低表达PTEN肿瘤组织，PTENα/β保持不变甚至增加（图1a,b）。对293T、Hela和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）用放线菌酮（CHX）处理，结合电泳分析可知PTENα和PTENβ比PTEN蛋白更易降解（图1c）。通过Co-IP和LC-MS/MS实验鉴定出与PTENα/β交互作用的去泛素化酶/去泛素化酶（USP9X, USP7 和TRIM28），其中只有干扰和敲除USP9X降低PTENα/β的表达，但不改变PTEN的表达。在293T细胞，瞬时转染(图1h)和用CRISPR-dCAS9内源性激活USP9X(图1i)增加PTENα/β而不是PTEN蛋白。USP9X正向调控PTENα/β，但不影响PTEN蛋白表达。
图1 PTENα/β和PTEN蛋白在肝癌中表达不一致
2 USP9X结合在NTEs区稳定PTENα/β
转染3×Flag标记的PTEN、PTENα或PTENβ到293T细胞，Co-IP检测Flag标签抗体表明PTENα和PTENβ，而不是PTEN与USP9X共结合（图2a），且N终端扩展区NTEs（N146）对于PTENα/β和USP9X的结合至关重要。USP9X减少显着促进了PTENα/β的泛素化，而不影响PTEN的泛素化（图2e）。
图2 USP9X结合在NTEs区稳定PTENα/β
3 FBXW11通过泛素化降解PTENα/β
沉默12个与N173互作的泛素E3连接酶的表达（图1e），发现只有干扰FBXW11增加PTENα/β而不影响PTEN（图3a）。敲除FBXW11上调PTENα/β（图3b），过表达FBXW11下调PTENα/β（图3c），而不改变PTEN和总mRNA水平。FBXW11主要通过直接结合PTENα/β的N146片段，使其泛素化降解（图3g）。此外，质谱分析纯化显示过表达FBXW11，PTENα赖氨酸K235 和 K239两个位点泛素化增加。突变实验显示，USP9X去泛素化了这两个赖氨酸上的泛素。
图3 FBXW11通过诱导泛素化降解PTENα/β
4 PTENα/β促进肿瘤发生
临床样本分析发现，与PTEN高表达组相比，PTEN减少的患者肿瘤体积增大，肿瘤分期升高，生存期明显缩短。然而，只分析PTENα/β增加和减少组没有这样的差异。在PTEN低表达组中，PTENα/β高表达组相对于低表达，肿瘤体积增大，肿瘤分期延长，生存期缩短(图4a-c)，PTENα/β的持续表达加速了肿瘤进展。接下来设计了两种gRNAs，一种专门针对PTENα/β(gPTENα/β)，另一种靶向PTEN的三个isoforms(gPTEN3)，gPTENα/β主要减少PTENα/β的表达，而gPTEN3敲除PTEN是三种形式。与对照组相比，敲除gPTENα/β显着抑制皮下接种肝癌和胰腺癌细胞的肿瘤增长 (图4e-h)，而敲除所有PTEN亚型促进胰腺癌的皮下成瘤(图4g,h)。在敲除所有PTEN亚型的SMMC-7721细胞中，重新表达野生型PTEN及酶活突变形式PTEN都能抑制成瘤，而过表达PTENα，PTENβ及酶活突变形式均可促进肿瘤发生（图 4i-k）。
图4 PTENα/β促进肿瘤发生
5 USP9X通过稳定PTENα/β促进肿瘤发生
分析癌症基因组图谱(TCGA)数据显示，在肝细胞癌(LIHC)，浸润性乳腺癌及胰腺腺癌的癌组织USP9X表达增加，USP9X高表达的病人生存期较差，提示USP9X在这些癌症中可能具有促进肿瘤生长的作用（图5a）。利用CRISPR-Cas9敲除SMMC-7721和MiaPaCa2细胞中的USP9X(图5b)，然后皮下接种，与对照相比显着降低肿瘤体积和重量(图5c-f)。
进一步验证USP9X的促瘤作用是否与PTENα/β有关联，对敲除USP9X的SMMC-7721细胞重新过表达PTENα/β，逆转敲除USP9X引起的抑制作用，诱导表达等实验进一步证实USP9X通过去泛素化作用稳定PTENα/β促进肿瘤的生长。而FBXW11可通过介导PTENα/β降解发挥部分的肿瘤抑制效果（图5j-l）。
图5 USP9X通过稳定PTENα/β促进肿瘤发生
6 PTENα/β通过NTEs内的核定位信号入核
Go分析显示与N173 / PTENα相互作用蛋白主要是核内蛋白（图6a）。分别检测PTENα/β和PTEN在细胞质和核内的表达，与之前的报道相一致[5,6,7]，PTEN主要分布在胞质中，在细胞核中也有少量分布，而PTENα/β在核内分布更多（图6b）。免疫荧光标记结果显示不同于绿色荧光蛋白（GFP）标记的PTEN主要定位在胞质，PTENα/β主要定位在核内（图6c）。
截短PTENβ的NTEs，发现删除的氨基酸149−173导致PTENβ主要定位在细胞质(图6c)，表明这个片段包含重要的入核信号，与之前的生物信息学分析一致，表明N173氨基酸150−155位点 (QKKPRH)可能存在一个核定位信号（NLS）。基于与N173 / PTENα相互作用蛋白主要集中在核内染色体部分，而不是核仁和核基质，推断PTENα/β可能参与基因表达调控。因此，接下来对对照和敲除PTENα/β的SMMC-7721细胞（分别敲除或者不敲除USP9X），进行了RNA测序（RNA-seq）。确定了32个表达下调和11个上调的基因，分别作为PTENα/β激活和抑制的基因，在两个独立的肝癌组中发现高表达PTENα/β激活的基因预示着更差的总体存活率（图6d）。TCGA中除了三个未注释的基因外，NOTCH3、SLC12A5、SPC25、TCF19、MYH3在肝癌组织中的表达明显高于正常组织（图6g），进一步支持了这些基因可能的促瘤作用。
图6 PTENα/β通过NTEs内的核定位信号入核
7 PTENα和PTENβ与WDR5直接互作调节基因的表达
基因集富集分析（GSEA）透露，WDR5的表达与32个已鉴定PTENα/β激活的基因呈正相关（图7c）。GST实验显示WDR5，直接结合PTENα(图7e)。PTENα或PTENβ（而不是PTEN）与WDR5体外（图7f）以及在细胞环境中直接互作（图7g），进而调控基因的表达。
图7 PTENα和PTENβ与WDR5直接互作
8 PTENα和PTENβ通过WDR5起致瘤作用
过去的研究显示，WDR5蛋白通过识别组蛋白甲基转移酶MLL及SET1家族，与其他蛋白构成WRAD（WDR5，RBBP5，ASH2L及DYP-30）核心催化复合物，催化组蛋白H3甲基化，激活基因转录参与表观调控。
通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）结合皮下成瘤等实验，发现PTENα/β能够通过N端延伸区与WDR5直接相互作用，维持甲基转移酶MLL的催化活性，促进组蛋白H3K4的三甲基化（H3K4me3），激活包括NOTCH3在内的一系列促肿瘤基因的表达，进而发挥促肿瘤效应（图8）。
图8 PTENα和PTENβ通过WDR5发挥致瘤作用
结论：
文章通过基因敲除，外源及内源过表达基因结合ChIP-Seq以及一系列皮下成瘤实验等首次发现了PTENα/β的促肿瘤功能，PTENα/β能够通过N端延伸区与WDR5直接相互作用，维持甲基转移酶MLL的催化活性，促进组蛋白H3K4的三甲基化（H3K4me3），激活包括NOTCH3在内的一系列促肿瘤基因的表达，进而发挥促肿瘤效应。
课题组同时揭示与经典PTEN蛋白不同，PTENα/β 蛋白极不稳定，并报道泛素连接酶FBXW11和去泛素化酶USP9X能够结合PTENα/β 的N端延伸区，通过调节235和239位赖氨酸泛素化和去泛素化，特异地调控PTENα/β 的稳定性。USP9X可以通过稳定PTENα/β 发挥肿瘤促进效应，而FBXW11可通过介导PTENα/β 降解发挥部分的肿瘤抑制效应，提示PTEN基因在肿瘤中可能是一把双刃剑，为针对PTEN的肿瘤治疗方案提供了新的思路。
和元上海有幸提供实验中使用Cas9和内源性激活dCas9慢病毒，用实际行动助力肿瘤研究。
参考文献
[1] Lee, Y. R., Chen, M. & Pandolfi, P. P. The functions and regulation of the PTEN tumour suppressor: new modes and prospects. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.19, 547-562 ().
[2] Hopkins, B. D. et al. A secreted PTEN phosphatase that enters cells to alter signaling and survival. Science 341, 399-402 ().
[3] Shao-Ming Shen et al. PTENα and PTENβ promote carcinogenesis through WDR5 and H3K4 trimethylation. Nature Cell Biology .21, 1436-1448(). DOI:10.1038/s41556-019-0409-z
[4] Zhang, B. et al. 42,573 cases of hepatectomy in China: a multicenter retrospective investigation. Sci. China Life Sci. 61, 660–670 ().
[5] Trotman, L. C. et al. Ubiquitination regulates PTEN nuclear import and tumor suppression. Cell 128, 141–156 ().
[6] Li, G. et al. PTENα regulates mitophagy and maintains mitochondrial quality control. Autophagy 14, 1742–1760 ().
[7] Song, M. S. et al. The deubiquitinylation and localization of PTEN are regulated by a HAUSP-PML network. Nature 455, 813–817 ().
NCB：上海交大陈国强课题组最新发现经典抑癌基因PTEN在肿瘤中是把 “双刃剑”—翻译变异体PTEN...
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