创伤和退行性骨关节炎引起的关节软骨缺损是非常常见的疾病。由于软骨的生理特性，软骨缺损修复一直是骨科手术的主要挑战。生长因子注射、干细胞移植、微骨折软骨成形术、自体及异体软骨移植等是软骨缺损修复的常用方法。然而，这些治疗方案通常会遇到一些问题，包括细胞和组织的可限性、疾病传播的可能性、高医疗成本以及技术的复杂性。此外，这些治疗通常会导致纤维软骨组织的形成，当受到正常的关节压迫负荷时，纤维软骨组织很容易受到损伤。为了克服这些缺点，软骨组织工程尤其是基于细胞的组织工程构建方法得到了广泛的研究。然而，繁琐的体外培养过程、体内外源性细胞的高死亡率、潜在的巨细胞增生和感染风险显着降低了这些方法的效率，增加了成本，限制了它们的广泛应用。相比之下，无细胞组织工程方法因其易于应用、成本效率高、生物安全性高而备受关注。聚合物支架作为组织工程的核心部件，在保证生物相容性和机械强度方面起着关键作用，对软骨再生有着至关重要的影响。近年来，将功能小分子引入高分子材料已被证明是一种经济有效的生物活性材料制备方法。虽然许多信号分子和骨髓间充质干细胞（BMSC）特异性亲和肽已被用于软骨损伤修复，但常常引起各种副作用。来自东华大学材料科学与工程学院的游正伟教授团队和上海市交通大学附属第六人民医院骨科的赵世昌教授团队合作制备了可以对体温做出反应的生物活性形状记忆支架。该支架基于聚苯硫醚/聚癸二酸丙三醇酯/kartogenin（PPS/PGS/KGN）三元系统，具有良好的温度响应性，在大鼠膝关节模型中可以实现高效的无细胞软骨修复（图1）。Fig. 1. Schematic diagramof shape-memory PPS/PGS/KGN scaffolds based on the newly designed PPS/PGScopolymer for cartilage defect repair via minimally invasive implantation. (A)Preparation of ternary scaffolds. (B) Shape-memory mechanism of the scaffolds.(C) Minimally invasive implantation of the scaffolds and subsequent cartilageregeneration processes, including cell recruiting and chondrogenesis,mechanical support, neocartilage, scaffold degradation and regeneration, andcartilage defect repair, in a rat knee model.研究者首先通过宏观形状变化研究了聚苯乙烯/聚乙二醇共聚物的形状记忆行为。将矩形条带加热到55摄氏度以去除所有结晶，然后将其扭曲成暂时的形状。冷却后,样品再结晶恢复试样形状(图 2)。原始试样和恢复试样均表现出各向同性(图 2B)。临时拉伸试样表现出明显的各向异性，说明其具有良好的定形能力。采用动态力学分析(DMA)对应力控制模式下的形状记忆效应进行定量表征(图2 D-E)。在45摄氏度时，带钢被拉伸到185%的应变。形状记忆固定比率高达99%，除去外力后,由细长的带状逐渐恢复到原形状的97%，优于大多数现有形状记忆聚合物材料。这些结果证实了PPS/PGS共聚物具有良好的形状记忆性能，有进一步应用于微创修复的潜力。
Fig. 2. Shape-memory andthermomechanical characterization of the PPS/PGS copolymer. (A) Photographedimages of permanent, temporary and recovered shapes and (B) SAXS patternsduring the shape-memory process. (C) Diverse temporary shapes of a sunflower-likesample. Scale bar: 6 mm. (D) Two-dimensional and (E) Three-dimensional (3D)thermomechanical curves. (F) Changes in the shape-memory recovery ratio of thePPS/PGS strip with time at 45℃ obtained by DMA.在此基础上研究者们制备了PPS/PGS/KGN支架并测定了支架的形状记忆行为及力学性能。这些结果表明，PPS/PGS/KGN-100支架可通过体温触发自动展开。因此，所制备的三维PPS/PGS/KGN-100支架可以通过微创手术进行小型化、变形和适应不规则软骨缺损，具有很大的修复前景。理想的软骨组织工程支架材料应具有较高的孔隙率和孔间连通性。研究者用扫描电镜（SEM）研究了支架在成型过程中的微观形貌（图 3B）。其孔径111±23 μm在关节软骨工程中属于合适的孔径范围(100–150 μm)。研究者通过压缩试验对形状记忆支架的力学性能进行了评价。从循环压缩试验中发现，所有支架均都有一定的应力形变但一段时间内可恢复至原始状态。
Fig. 3. Characterization of shape-memory behavior for PPS/PGS/KGN-100 scaffolds. (A) Photographed images of the permanent, temporaryand recovered shapes of the scaffolds and (B) corresponding SEM images ofsurface morphology during the shape-memory process at the switch temperature of37 ℃. Scale bar: 500 μm. (C) The Rr change of the PPS/PGS/KGN-100 scaffold with time. (D) The Rf and (E) Rr values of the PPS/PGS/KGN-100 scaffold for 5 cycles.
合适的支架降解率是组织再生的关键因素。过度快速的降解会导致支架性能在机械性能良好的组织形成之前过早丧失，从而导致种植体失败。相反，合成聚合物的持久性会引起异物反应和纤维组织沉积，从而导致缺陷扩大（图 4A）。为了研究KGN在形状记忆PPS/PGS/KGN支架中的降解和释放，研究者在37℃的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）溶液中进行了降解实验（图 4B）。在降解过程中，KGN逐渐从PPS/PGS/KGN支架中释放出来。与之前报道的与KGN结合的高分子支架相比，PPS/PGS/KGN支架降解缓慢，缓释12周以上，与软骨再生时间相匹配，具有修复软骨缺损的潜力。
Fig. 4. （A）Invitro degradation and （B）KGN release results of shape-memory scaffolds with different KGN contents,including PPS/PGS, PPS/PGS/KGN-10, PPS/PGS/KGN-50 and PPS/PGS/KGN-100scaffolds, in DPBS solution at 37 °C.
研究者研究了体外细胞对PPS/PGS/KGN支架的反应。采用CCK-8法分别在PLGA、PPS/PGS和PPS/PGS/KGN三元支架上培养细胞1、3、7天，观察BMSC的增殖情况（图 5A）。结果表明，骨髓间充质干细胞在PPS/PGS支架中可以有效的附着、存活和增殖，而KGN的加入可以促进PPS/PGS支架细胞的增殖。
Fig. 5. In vitro results of cell viability and relativegene expression levels for chondrogenesis and osteogenesis. (A) CCK-8 assay ofBMSCs cultured for 1, 3 and 7 days. Relative chondrogenic-related gene expression of (B) aggrecan, (C) type Ⅱ collagen (COL Ⅱ), (D)SOX9 and (E) GAG and osteogenic-related gene expression of (F) type Ⅰ collagen(COL I) of BMSCs cultured in PLGA, PPS/PGS, PPS/PGS/KGN-10, PPS/PGS/KGN-50 and PPS/PGS/KGN-100 scaffolds for 14 and 21 days. ∗Statistically significant difference between different scaffolds at the same time point ( P < 0.05). #Statistically significant difference between different time points on the samescaffold ( P < 0.05).
SEM图像显示了生长在PLGA、PPS/PGS和PPS/PGS/KGN支架表面3天的BMSC形态（图6 A-E）。值得注意的是，三组支架表面均有BMSC附着，呈现良好的形态。
Fig. 6. Morphologicalobservation of BMSCs cultured in vitro. (A) SEM images of BMSCs cultured onPLGA, PPS/PGS, PPS/PGS/KGN-10, PPS/PGS/KGN-50 and PPS/PGS/KGN-100 scaffolds 1or 3 days. Immunofluorescence staining of chondrocytes replated in tissue culturepolystyrene (TCPS) after culturing on various scaffolds 1 or 7 days: (B)F-actin, (C) nucleus, (D) COL II, and (E) merge. Scale bar: 100 μm.
为了进一步研究PPS/PGS/KGN支架对BMSC分化的影响，研究者进行了实时逆转录酶聚合酶链反应（qRT-PCR）和免疫荧光检测。与PLGA和单纯PPS/PGS支架相比，含KGN的支架成骨相关基因COL I的表达水平明显升高，显示了较好的软骨再生潜力。
为了进一步验证支架对于体内软骨再生的效果, 研究者使用没有任何外源性生长因子或种子细胞的支架修复膝关节缺陷（直径和深度均为2 mm）。结果表明，PPS/PGS/KGN支架可能募集内源性BMSC，这与之前关于PGS支架细胞募集能力的报道一致。此外，释放的KGN可诱导骨髓间充质干细胞的软骨分化，促进软骨再生。植入12周后，PLGA支架处理的软骨缺损呈现纤维样未成熟软骨覆盖，未愈合（图 7）。
Fig. 7. Microscopic observation and histological staining of cartilage defect repair in the PLGA, PPS/PGS, and PPS/PGS/KGN-100 groups determined according to invitro experiments. The macroscopic images of a sampleretrieved at 6 (A-C) and 12 (D-F) weeks after operation. Scale bar: 2 mm.Toluidine blue staining images (A1-F1) (scale bar: 1 mm) and corresponding enlarged views (A2-F2) (scale bar: 0.2 mm), and the safranin O staining images(A3-F3) (scale bar: 1 mm) and corresponding enlarged views (A4-F4) (scale bar: 0.2 mm) in the PLGA, PPS/PGS, and PPS/PGS/KGN-100 groups at 6 and 12 weeks. Theareas outside the dotted square in the toluidine blue staining and safranin Ostaining images were taken as positive control region for comparison.
研究者而后进行免疫组化染色，半定量分析，评估其蛋白水平。这些结果表明PPS/PGS/KGN-100支架能够提供具有良好的成软骨微环境，是软骨再生的候选支架（图 8）。
Fig. 8. Immunohistochemical staining of cartilage defect repair in 3D PLGA, PPS/PGS and PPS/PGS/KGN-100 scaffolds at 6 and 12 weeks after implantation and corresponding statistical quantification (average ± s.d., n=3). (A-F) Aggrecan staining corresponding to (G) normal control and (H) the biochemical contents. (A1-F1) COL II staining corresponding to (G1) normalcontrol and (H1) the biochemical contents. Scale bar: 50 μm. ∗Statistically significant difference between different scaffolds at the same time point ( P < 0.05). # Statistically significant difference between different time points on the same scaffold ( P < 0.05).
由于PPS/PGS/KGN支架释放的KGN能有效促进胶原形成，因此在6周和12周内，PPS/PGS/KGN-100支架的软骨再生效果均优于PLGA和PPS/PGS支架。PPS/PGS/KGN-100支架具有增强软骨祖细胞活力、粘附、归巢和软骨特异性分化的作用，同时其具有相互连接的孔状结构和仿生力学性能，这些性能赋予了其良好的修复能力。
总的来说，这项工作为软骨修复提供了一种简便、低侵入性和低成本的方法。此外，PPS/PGS形状记忆共聚物中大量的游离羟基使其能够方便、多样地对多种材料的性能进行调节，为形状记忆材料的各种生物医学应用提供了强大的平台。
本研究由东华大学材料科学与工程学院的游正伟教授团队和上海市交通大学附属第六人民医院骨科的赵世昌教授团队共同完成，并于1月10日在线发布于Acta Biomaterialia。
论文信息：Huixia Xuan , Haoran Hu , Congying Geng , Jianchun Song , Yifan Shen , Dong Lei ,Qingbao Guan , Shichang Zhao* , Zhengwei You* , Biofunctionalized chondrogenicshape-memory ternary scaffolds for efficient cell-free cartilage regeneration. Acta Biomaterialia ,105: 97-110.供稿：于丽丽审校：陈嵩编辑：于启帆
如果觉得《利于软骨再生的无细胞生物功能化形状记忆三元软骨支架》对你有帮助，请点赞、收藏，并留下你的观点哦！
