期刊：Cell Death and Disease
影响因子：8.469
近期，派森诺生物与哈尔滨工业大学生命学院吴琼老师课题组合作，在Cell Death & Disease期刊上，发表了题为《EphA2 super-enhancer promotes tumor progression by recruiting FOSL2 and TCF7L2 to activate the target gene EphA2》的文章，该文章揭示了治疗多种肿瘤的潜在靶点。
研究背景
超级增强子是更大的转录增强子簇，在驱动肿瘤发生中发挥关键作用。与典型增强子相比，超级增强子的大小、转录因子的密度和含量以及诱导转录的能力各不相同。越来越多的证据表明，超级增强子在调节细胞特性、细胞命运、干细胞多能性，甚至肿瘤发生中发挥着重要的作用。超级增强子可能促进它们各自相关基因的表达，如Sox2、Gata2和成脂特异性基因。先前发表在同行评议期刊上的数据报道，超级增强子驱动癌细胞中致癌基因的高水平转录。然而，EphA2相关的超级增强子及其辅助因子调控其靶基因的机制尚不明确，其在癌细胞中的生物学功能也尚不清楚。本研究旨在探讨一种新型超级增强子在多种肿瘤细胞中的作用及机制。
研究思路
研究内容
1. 多细胞系中超级增强子的鉴定
超级增强子以富集H3K27ac为特征，促进细胞身份相关基因的表达。本研究通过检索多个数据库，在A549、HeLa、MCF-7、HCT-116、Panc-1、T24、MKN45、BT16、A498和K562癌细胞中发现了一种超级增强子。通过Cistrome数据浏览器的公开H3K27ac ChIPseq数据(http://cistrome。org/db/#/)，我们获得了该超级增强子在10个肿瘤细胞中的H3K27ac富集水平。研究结果表明，超级增强子的存在在癌细胞系中富集，而在正常细胞系中普遍缺失。此外，为了进一步研究潜在的超级增强子，我们基于增强子相关特征分析了DNA的这一区域。结果表明，该区域具有较高的H3K27ac富集和P300、DNase I超敏性。据此，我们将这个超增强子进一步划分为三个组成的增强子区域，E1-E3。使用H3K27ac抗体进行ChIP实验，检测超强增强子成分增强子的活性组蛋白修饰。结果显示，H3K27ac在HeLa、MCF-7、HCT-116、A549和Panc-1细胞的每个增强子簇E1-E3上均富集。根据GeneHancer和4DGenom两个数据库检索，确定的新的超级增强子被认为与两个不同基因的启动子相互作用，EphA2和ARHGEF19。因此，这些基因可以作为该超级增强子的候选靶基因。
2. RNA-seq分析表明，EphA2-SE的缺失显著降低了EphA2的表达
为了研究超级增强子在癌细胞中的靶基因和功能作用，我们使用CRISPR/Cas9系统特异性敲除了超级增强子并进行了靶基因和RNA-seq分析。转染研究显示，EphA2SE是激活HeLa、HCT-116和MCF-7细胞中EphA2表达的超级增强子。
RNA-seq分析结果表明，超级增强子调控的基因表达水平远远高于普通增强子调控的基因表达水平。因此，EphA2更有可能受到超级增强子的调控。在3个细胞中分别发现4983、6701和5502个差异基因，共获得394个调控相同的共有DEGs，富集分析显示，这些基因有许多与肿瘤生长和转移相关。并对这些基因做了网络图，发现EphA2位于核心位置。对HCT-116、HeLa和MCF-7各细胞中DEGs的功能富集分析表明，EphA2-SE在肿瘤细胞的发展中起着重要作用。
3. EphA2-SE的增强子活性和信号模块的超级增强子
将EphA2SE的单个组分增强子E1-E3克隆到荧光素酶报告载体中，发现其活性高于对照。在HeLa、HCT-116和MCF-7细胞中，E1成分增强子产生的信号最大，其次是E3和E2增强子。另外ChIP-seq数据库和转录因子富集密度分析结果都表明， E1成分增强子是EphA2-SE的主要活性单元。为了模拟细胞内染色质结构，我们删除了HeLa、HCT-116和MCF-7细胞的三个组分部分增强子。结果显示，E1-E3成分增强子部分缺失后，EphA2的表达明显下调，但不同成分间差异不大。
4. EphA2- se缺失通过降低EphA2在体外的表达来抑制细胞的增殖、迁移和侵袭
许多由超级增强子调控的致癌基因在肿瘤中以异常高的水平表达。我们在HeLa、HCT-116和MCF-7细胞中过表达EphA2。结果显示，EphA2- se缺失显著抑制了细胞的生长，而过表达EphA2挽救了EphA2SE缺失导致的缓慢增殖。EphA2-SE敲除导致细胞周期阻滞G1/S期或G2/M期，与细胞增殖结果一致。前期研究表明EphA2与p-AKT相关，而TCF7L2是WNT/β-catenin信号通路下游的关键转录因子。因此我们检测了PI3K/AKT和WNT/β-catenin，结果显示，EphA2-SE在不同的肿瘤细胞中激活不同的信号通路。在HeLa、HCT-116和MCF-7细胞中，EphA2SE缺失显著抑制细胞迁移和侵袭，过表达EphA2促进细胞迁移和侵袭。这说明EphA2-se缺失导致EphA2表达降低，显著抑制HeLa、HCT-116和MCF-7癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
5. EphA2-SE缺失抑制体内肿瘤发生和肿瘤增殖
为了进一步探讨EphA2-SE在体内对肿瘤发生的影响，将EphA2-SE缺失纯合子HeLa细胞和对照细胞注射到裸鼠侧翼。从细胞移植后第11天开始，每隔6天测量肿瘤直径。与注射对照细胞形成的肿瘤相比，EphA2敲除细胞形成的肿瘤在体积和重量上都要小得多(图5a-c)。我们采用qRT-PCR和western blotting检测EphA2-SE对其目的基因表达的影响。如图5d-e所示，敲除EphA2- se显著下调了EphA2的表达。综上所述，EphA2- se缺失可能通过调控EphA2在体内外的表达来抑制HeLa细胞的增殖和生长。
总 结
siRNA介导的FOSL2和TCF7L2下调也导致了E1活性的降低。用CRISPR/Cas9敲除3个细胞中E1-E3组分增强子后，靶基因EphA2的表达明显下调。MTT和细胞周期分析表明，EphA2-SE的缺失通过阻断PI3K/AKT和WNT/β-catenin信号通路抑制癌细胞增殖。在体内，EphA2-SE的缺失抑制了HeLa细胞的生长，EphA2表达下调。综上所述，FOSL2和TCF7L2结合E1成分增强子的不同位置，共同调控EphA2的表达，从而诱导HeLa、HCT-116和MCF-7细胞的增殖和侵袭。
总之，本研究在10个癌细胞系中发现了一个新的EphA2相关超级增强子。结果表明，在癌细胞中，EphA2- se通过核心成分E1招募TCF7L2和FOSL2，直接靶向EphA2，促进肿瘤进展。移植小鼠模型和体外细胞实验表明，EphA2-SE的缺失减缓了肿瘤的进展。因此，EphA2-SE是治疗多种肿瘤的潜在靶点。
注：本文中转录组建库测序和分析内容由派森诺生物科技有限公司完成。
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