近日，国际顶尖肿瘤学期刊Cancer Cell 在线发表了美国西南医学中心傅阳心教授团队和李国民教授团队背靠背的两篇论文：
DNA Sensing in Mismatch Repair-Deficient Tumor Cells Is Essential for Anti-tumor Immunity
MLH1 Deficiency-Triggered DNA Hyperexcision by Exonuclease 1 Activates the cGAS-STING Pathway
研究团队发现错配修复缺陷（dMMR）肿瘤因为缺失MLH1基因从而促使核酸外切酶ExoI介导产生了胞质DNA，激活肿瘤细胞自身的cGAS-STING通路，增强了T细胞的肿瘤浸润，从而有助于PD-1抗体的抗肿瘤效果；而受损的cGAS-STING通路会导致免疫治疗的不响应。
这个发现为以PD-1抗体为基础的肿瘤治疗提供了新的生物标注物，并为解决那些因为T细胞的肿瘤浸润水平低而导致不响应免疫治疗的临床耐药问题提供了新思路。
美国西南医学中心的博士后卢长征（博士毕业于中科院生物物理研究所）和关俊宏（博士毕业于北京大学）为两篇文章的共同第一作者，傅阳心教授和李国民教授为两篇文章的共同通讯作者。
肿瘤是身体组织不正常增殖的表现形式，除了指甲和头发，它可以在人体的任何部位发生。每一种在研的抗肿瘤药物都有明确的细分市场，尤其是进入靶向治疗时代，绝大多药物都要根据肿瘤的分子分型，如EGFR突变型、KRAS突变型和TP53失活型等，来分别开展临床试验。但是，即便针对同一种遗传突变—如KRAS-G12C—的小分子抑制剂，在肺癌和肠癌上的效果也差异巨大。
5月，美国FDA根据包含149个病人的临床试验的结果批准了默沙东公司的PD-1抗体Keytruda用于治疗携带dMMR/MSI-H（DNA错配修复缺失/微卫星高度不稳定）的任何一种实体瘤。这是美国FDA史上第一次批准的不依据肿瘤器官来源，而是依据生物标志物进行区分的抗肿瘤疗法【1】。
PD-1抗体单药在各种dMMR/MSI-H型实体瘤上产生了平均高达50%的客观响应率，这是赋予其肿瘤治疗“广谱药物”具有里程碑意义的事件。解析其疗效的机制自然成为接下来最为重要的事情，它可以揭示肿瘤的致命软肋，为开发更多广谱高效的抗癌药物提供借鉴。
从7月至5月，先后有三篇重磅文献报道，dMMR肿瘤细胞因为在DNA复制过程中产生大量的突变负荷导致生成大量的neoantigen，从而促进了抗肿瘤T细胞的增殖，最终增强了PD-1抗体的治疗效果【2-4】。
以上研究极大鼓舞了基于肿瘤突变负荷作为免疫治疗标志物的相关研究。6月，FDA批准了PD-1抗体Keytruda适用于任何突变负荷≥10 mut/Mb的实体瘤治疗【5】。至此，作为免疫治疗标志物的肿瘤突变负荷真要一锤定音？
默沙东迎来贺电的同时，针对FDA的质疑纷至沓来。加州大学旧金山分校的肿瘤学家Vinay Prasad详细列举了12条原因对以上决定逐一批驳【6】。而来自哈佛大学丹娜-法伯癌症研究所的一个团队在预印本平台BioRxiv上公布的文章，甚至直指FDA做出以上决定所参考的文献的统计学错误【7】。
孰对孰错尚需时间沉淀，但回到dMMR肿瘤领域，我们从另外两篇文献可以得到一丝线索。虽然dMMR肿瘤以产生大量突变和伴有T细胞浸润为主要特征，但是相当多的dMMR肿瘤缺乏足够的T细胞浸润，而这些肿瘤含有高度不稳定的基因组微卫星以及高水平的突变负荷【8、9】。
肿瘤组织的T细胞浸润水平已被证明与PD-1抗体治疗效果密切相关，目前临床上仍然有50%上下的dMMR肿瘤病人不响应PD-1抗体的治疗。
那么在有大量突变负荷的情况下，dMMR肿瘤排斥T细胞浸润是否是免疫治疗不积极的原因，以及排斥T细胞浸润的具体机制是什么？
T细胞的有效激活不仅依赖于抗原，还需要天然免疫识别所介导的共刺激分子信号。胞质内的DNA识别，作为天然免疫识别的一个重要组成部分，在西南医学中学的陈志坚实验室得到了突破性和系统性的研究。
所以，作者首先着眼于此。第一篇论文中，通过分析TCGA数据，作者发现肿瘤组织cGAS-STING通路基因的表达水平与dMMR肿瘤病人的预后呈显著正相关，但却没有在pMMR（MMR-proficient）肿瘤中发现此现象。为了验证这个现象，作者敲除MMR关键基因Mlh1，构建了dMMR小鼠肿瘤模型。他们发现，如果dMMR肿瘤细胞缺少Sting基因，免疫治疗的效果就大打折扣。
因为PD-1抗体治疗依赖于T细胞，他们进而分析了浸润肿瘤的T细胞水平，发现在缺失Sting或者cGAS的dMMR肿瘤中T细胞显著降低。为什么降低呢？作者将肿瘤细胞和抗原递呈细胞共培养，然后纯化抗原递呈细胞去刺激T细胞，发现dMMR肿瘤抚育过的抗原递呈细胞相比对照组可以更强的促进T细胞增殖，而在dMMR肿瘤细胞里敲除Sting后这种增强效应就消失了。
这个现象的机理又是什么呢？I 型干扰素是cGAS-Sting通路识别DNA后的一个主要效应分子，而且它对T细胞的增殖有促进作用。所以，作者检测了体外培养的dMMR细胞上清中的干扰素水平，结果显示干扰素的蛋白水平在dMMR细胞组显著上调，而敲除Sting或者cGAS后干扰素就恢复到本底水平。与干扰素结果相一致的是，dMMR肿瘤细胞有更多的胞质DNA，但当把MMR基因恢复回去，胞质DNA以及干扰素增加的现象就消失了。
通过以上实验，作者得到的结论是，MMR基因可以负调控肿瘤细胞的胞质DNA的产生，所以敲除了它会导致肿瘤细胞积累胞质DNA，进而激活cGAS-Sting通路，产生干扰素。至此，作者发现了dMMR肿瘤产生大量neoantigen之外的新特征。为了排除neoantigen而只评估这个新特征对免疫治疗的影响，作者构建了一种特殊的小鼠模型，在这个模型里，T细胞只识别表达在dMMR肿瘤里的一个固定neoantigen。结果发现，相比于具有同样neoantigen的pMMR肿瘤，产生一型干扰素的dMMR肿瘤响应免疫治疗更积极。
MMR系统负责修复DNA复制过程中的碱基不匹配，理所当然, 缺失它会导致大量的突变负荷，但是为何会产生足以激活cGAS的胞质DNA片段？
为了探究MMR基因MLH1缺失激活cGAS/STING通路的具体机制，在第二篇论文中，作者发现MLH1可以调控Exo1的核酸外切酶活性，进而维持染色体稳定性。缺失MLH1会导致Exo1的过度切割，产生更长的单链DNA，诱导RPA衰竭，并引起染色体异常，诱发新的双链断裂，从而释放细胞质DNA，并激活cGAS产生更多的cGAMP。
为探究IR是否会增强MLH1缺失引起的cGAS通路激活，作者首先检测到IR照射后，dMLH1的细胞中积累了更多的细胞质DNA并产生了更多的cGAMP。同时作者发现，MLH1的缺失进一步增强了STING和STAT1的磷酸化水平，并且上调了ISG15和IRF7的表达，这些表型是依赖cGAS和STING的。
那么MLH1诱导胞质DNA释放并激活cGAS-STING通路的具体细胞机制是什么呢？因为在DNA错配修复和DNA双链断裂修复过程中， Exo1的外切酶活性是受到严格调控的，过度切割会产生很长的单链DNA。所以作者假设Exo1过度切割是MLH1缺失积累胞质DNA的诱因。为了验证这个假设，作者在MLH1缺失的细胞中同时敲除Exo1，发现双敲除的细胞中，细胞质DNA减少，磷酸化STING和磷酸化STAT1降低，同时ISG15和IRF7表达也下调，表明Exo1确实是调控cGAS-Sting通路的关键因子。
分子机制上作者发现MLH1可以通过相互作用调控Exo1在DNA错配修复和DNA双链断裂修复中的活性，进而影响单链DNA的长度。通过laser的实时成像实验，作者发现在MLH1缺失的细胞中，更多的Exo1会聚集在损伤位点，并持续更长的时间。而且在dMLH1细胞中，RPA会出现衰竭，进而导致染色体异常（图3）。该论文详细地解释了MLH1如何通过调控Exo1的活性来限制过度切割产生更多细胞质DNA的机制。
最后，再回到第一篇文章，这里还有一个很重要的问题并没有完全解决：为什么50%的dMMR肿瘤病人对PD-1抗体治疗不响应。因为在动物模型里，作者是人为敲除cGAS-Sting通路基因来实现治疗耐受表型的，临床上真的主要是cGAS-Sting通路的缺失导致的吗？作者跟临床医生合作，拿到了一些dMMR肿瘤的RNA-seq数据，其病人都经过PD-1抗体治疗。他们发现cGAS或者STING表达水平低的病人治疗的效果明显更差，那些不响应治疗的病人的cGAS/STING水平明显更低。
为了在人类肿瘤里进一步验证小鼠dMMR肿瘤里的基础生物学发现，他们找到了一个自发的MMR基因缺失的人类结直肠癌细胞系HCT116，且这个 细胞系的cGAS几乎不表达。作者给这个细胞系恢复了cGAS的表达，然后把它接种到具有人的免疫系统的小鼠宿主上，发现cGAS恢复的肿瘤伴随更多的人类T细胞浸润，且响应免疫治疗更积极。与此同时，作者发现在能得到的大概30个dMMR人类癌细胞系中，有60%的细胞系cGAS几乎不表达。
这个结果暗示cGAS在人类dMMR肿瘤的表达受损是广泛存在的。为此，作者再次分析了TCGA数据库，发现在子宫内膜癌和胃癌中，cGAS的表达水平在dMMR肿瘤里比pMMR肿瘤显著下降。
总的来说，该研究通过不同的维度（临床-动物-细胞-蛋白-DNA）揭示了dMMR肿瘤的一个本质特征，通过调控Exo1产生胞质DNA，这个特征在一些肿瘤病人里可以通过激活肿瘤细胞的cGAS-STING通路对免疫治疗产生积极影响；但在另外一些肿瘤里，未知原因介导的cGAS-STING通路受损导致免疫治疗效果不佳。
所以，dMMR肿瘤细胞的neoantigen并不足以预测免疫治疗的好坏，cGAS-STING通路的表达水平可以进一步作为dMMR肿瘤响应免疫治疗的一个标志物。
论文链接：
/10.1016/ell..11.006
/10.1016/ell..11.004
参考资料：
1. https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-first-cancer-treatment-any-solid-tumor-specific-genetic-feature
2. Le, Dung T., et al. "Mismatch repair deficiency predicts response of solid tumors to PD-1 blockade." Science357.6349 (): 409-413.
3. Germano, Giovanni, et al. "Inactivation of DNA repair triggers neoantigen generation and impairs tumour growth." Nature552.7683 (): 116-120.
4. Mandal, Rajarsi, et al. "Genetic diversity of tumors with mismatch repair deficiency influences anti–PD-1 immunotherapy response." Science364.6439 (): 485-491.
5. https://www.fda.gov/drugs/drug-approvals-and-databases/fda-approves-pembrolizumab-adults-and-children-tmb-h-solid-tumors
6. Subbiah, V., et al. "The FDA approval of pembrolizumab for adult and pediatric patients with tumor mutational burden (TMB)≥ 10: a decision centered on empowering patients and their physicians." Annals of Oncology31.9 (): 1115-1118.
7. Gurjao, Carino, et al. "Limited evidence of tumour mutational burden as a biomarker of response to immunotherapy." bioRxiv().
8. Cristescu, Razvan, et al. "Pan-tumor genomic biomarkers for PD-1 checkpoint blockade–based immunotherapy." Science362.6411 ().
9. Vasaikar, Suhas, et al. "Proteogenomic analysis of human colon cancer reveals new therapeutic opportunities."Cell 177.4 (): 1035-1049.
来源：小柯生命
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