一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与双基因缺失疫苗株的LAMP检测引物及试剂盒的制作方法

本发明属于生物

技术领域：

，更具体地，涉及一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与双基因缺失疫苗株的lamp检测引物及试剂盒。

背景技术：

：非洲猪瘟是一种由非洲猪瘟病毒引起的急性、出血性、接触性、高致病性的传染性疾病，任何年龄和品种的猪均可感染该种病毒，被世界动物卫生组织oie定为a类疫病,在我国被列为一类疫病。该种疾病的传播流行没有典型的季节性，且具有发病率高、传播速度快等特点。临床上最急性型患病猪不表现出任何临床症状，经常猝死。亚急性或慢性病猪体温常上升到42℃，耳朵和四周腹部皮肤出现大量出血斑点，在眼鼻周边，流出大量的黏液性分泌物，呕吐便秘，呼吸困难，妊娠母猪发生流产。患病猪从鼻腔或扁桃体部发生感染,然后漫延到下颌淋巴结等部位,猪浆膜表面先充血、后出血,内脏表面均有出血点,胃和肠道粘膜、胆囊和膀胱等也出血；肺脏肿大；脾肿大、易碎；颌下淋巴结、腹腔淋巴结肿大,严重时出血。非洲猪瘟病毒的主要传染源是家猪、野猪,同时软蜱和接触病猪的污染物等也是传染源,如泔水、饲料、垫草等，主要感染消化道和呼吸道。目前在生猪养殖产业发展中仅依靠综合性防控措施，尚未出现针对该病的商品化疫苗和特效药。目前cn110093324a公开了一种涉及可作为疫苗的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒及疫苗以及构建方法，采用非洲猪瘟中国流行株pig/cn/hlj/，经基因工程技术，将非洲猪瘟病毒的毒力基因缺失，获得mgf360-505r缺失和cd2v与mgf360-505r联合缺失的基因缺失病毒。经实验表明所述两种毒株均能提供对非洲猪瘟中国流行强毒株的100％免疫保护，可作为安全和有效的防控中国非洲猪瘟疫情的疫苗，具有极大的社会价值。但该疫苗的使用会导致普通方法检测非洲猪瘟病毒结果为阳性，因此区分野毒感染致阳性或疫苗接种导致阳性极为重要。实验室检测经常用到的方法包括：电镜观察，elisa，细胞转染(cft)和血清中和试验；感染组织的组织病理学；以及核酸检测，包括pcr和实时定量pcr(rflp)。然而，以上核酸检测方法虽然能够实现非洲猪瘟病毒野毒株与双基因缺失疫苗株的准确检测，但是其都是属于实验室检测手段，需要借助复杂的仪器和严苛的实验条件，并不适合大规模的流行病学调查和运用到基层单位的现场检测，例如乡镇一级或者县级的兽医检测通常不配备pcr或荧光定量pcr仪器和相关操作人员。技术实现要素：本发明第一个方面的目的，针对非洲猪瘟病毒普通检测方法不能区分病毒感染或是疫苗接种的情形，而常规核酸检测手段不便、对仪器的依赖性比较强，不能实现现场检测的技术问题，提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与cd2v和360-505r双基因缺失疫苗株lamp检测引物组。本发明第二个方面的目的，在于提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与cd2v和360-505r双基因缺失疫苗株lamp检测试剂盒。本发明第三个方面的目的，在于提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与cd2v和360-505r双基因缺失疫苗株lamp检测方法。本发明所采取的技术方案是：本发明的第一个方面，提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与cd2v和360-505r双基因缺失疫苗株lamp检测引物组，包括以下a、b两组引物，每组引物包括：一对外引物、一对内引物和一对环引物，a组：外引物：cd2v-f3：aacaatgtcagcatgatgac(seqidno:1)；cd2v-b3：gaggacatggtttgggtg(seqidno:2)；内引物：cd2v-fip：ctgataacgactgtaaggcttaggaaccacttccatacatgaacc(seqidno:3)；cd2v-bip：acctatttactacatgcgtccctaggacacggtttaggtaag(seqidno:4)；环引物：cd2v-lf：catacatgaaccatctcccagag(seqidno:5)；cd2v-lb：ccactcaacccatttcccttacc(seqidno:6)；b组：外引物：360-505r-f3：acagcagcagcgagacg(seqidno:7)；360-505r-b3：ggatacgattcactacaat(seqidno:8)；内引物：360-505r-fip：gttatggctatctccttgcttccaataaaagggcttctaccct(seqidno:9)；360-505r-bip：cagcataaacatattttgaagagtacaccatactgaacctag(seqidno:10)；环引物：360-505r-lf：ccatattctatggttttg(seqidno:11)；360-505r-lb：acttcgaaacctgggaaa(seqidno:12)。本发明的第二个方面，提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与cd2v和360-505r双基因缺失疫苗株lamp检测试剂盒，所述试剂盒中包含本发明第一个方面所述的引物组。根据本发明第二个方面所述的试剂盒，所述试剂盒中还包括bstdna聚合酶、lamp反应液、甜菜碱、阳性对照和阴性对照。根据本发明第二个方面所述的试剂盒，所述lamp反应液含有10mmdntp、10×thermopol反应缓冲液、150mmmgso4水溶液。根据本发明第二个方面所述的试剂盒，所述阳性对照为含有非洲猪瘟病毒cd2v基因片段的质粒和含有非洲猪瘟病毒缺失第27942-35500位两侧区域基因片段的质粒。根据本发明第二个方面所述的试剂盒，所述含有非洲猪瘟病毒cd2v基因片段的序列如seqidno.13所示，所述缺失第27942-35500位两侧区域基因片段的序列如seqidno.14所示。根据本发明第二个方面所述的试剂盒，所述试剂盒中两组引物的外引物、环引物，内引物的摩尔比为1:2:8。本发明的第三个方面，提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与cd2v和360-505r双基因缺失疫苗株lamp检测方法，包括以下步骤：s1.提取待测样品dna；s2.以步骤s1中提取的核酸为模板，配置两个25μl反应体系，包括引物、dna聚合酶、lamp反应液和待测样品dna，用无菌水补齐到25μl，然后千63～68℃下反应30～60min，所述两个25μl反应体系分别含有本发明第一个方面所述的两组引物中的一组；s3.通过肉眼观察反应管中溶液是否变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳验证，确定病毒类型。根据本发明第三个方面所述的方法，步骤s3所述确定病毒类型的方法为：当两个反应管均未变浑浊，则说明未检测到非洲猪瘟野毒株和cd2v和360-505r双基因缺失疫苗株；当两个反应管均变浑浊，则说明样品中含有含野毒株和cd2v和360-505r双基因缺失疫苗株；当a组引物反应管变浑浊，b组引物反应管未变浑浊，则说明样品含有野毒株，且未检测到mgf360-505r基因缺失株；当a组引物反应管未变浑浊，b组引物反应管变浑浊，则说明样品中未检测到野毒株，且含有mgf360-505r基因缺失株。根据本发明第三个方面所述的方法，步骤s3所述确定病毒类型的方法为：当两个反应管的琼脂糖凝胶电泳均无梯状条带，则说明未检测到非洲猪瘟野毒株和cd2v和360-505r双基因缺失疫苗株；当两个反应管的琼脂糖凝胶电泳均有梯状条带，则说明样品中含有含野毒株和cd2v和360-505r双基因缺失疫苗株；当a组引物反应管的琼脂糖凝胶电泳有梯状条带，b组引物反应管的琼脂糖凝胶电泳无梯状条带，则说明样品含有野毒株，且未检测到mgf360-505r基因缺失株；当a组引物反应管的琼脂糖凝胶电泳无梯状条带，b组引物反应管的琼脂糖凝胶电泳有梯状条带，则说明样品中未检测到野毒株，且含有mgf360-505r基因缺失株。本发明的有益效果是：1.本发明基于lamp技术特异性高的特点，所设计的引物仅能特异性扩增非洲猪瘟病毒的基因组序列，且引物设计科学，避免了引物二聚体的形成，保证了反应的顺利进行。选取非洲猪瘟的cd2v序列作为检测的目标基因，cd2v是asfv重要的保护性抗原，可以保证检测结果的准确性，避免漏检的出现，选取的缺失片段两侧的区域特异性强，避免了假阳性出现。2.本发明的非洲猪瘟病毒野毒株与cd2v和360-505r双基因缺失疫苗株lamp检测方法灵敏度高，最低检测极限是101拷贝阳性质粒dna，高于现有技术报道的lamp检测方法。3.本发明方法操作简单，不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，只需要恒温水浴即可反应，反应条件温和；而且可以通过肉眼观察浑浊、琼脂糖凝胶电泳或者添加荧光物质进行荧光检测等丰富的途径判定检测结果，适合猪场或者基层检测单位的现场检测。附图说明图1阳性质粒琼脂糖凝胶电泳图。m，dl2000marker；1，pcr鉴定cd2v片段；2，pcr鉴定缺失第27942-35500位两侧区域片段。图2lamp检测结果图。1，a组引物以质粒puc57-cd2v作为模板进行检测(浑浊)；2，阴性对照去离子水(透明)；3，b组引物以质粒puc57-360缺失作为模板进行检测(浑浊)；4，阴性对照去离子水(透明)。图3lamp检测结果琼脂糖凝胶电泳图。m，dl2000marker；1，a组引物以质粒puc57-cd2v作为模板进行检测；2，阴性对照去离子水；3，b组引物以质粒puc57-360缺失作为模板进行检测(浑浊)；4，阴性对照去离子水。图4a组引物lamp特异性试验结果琼脂糖凝胶电泳图。m，dl2000marker；1，非洲猪瘟病毒野毒株；2，猪瘟病毒核酸；3，猪细小病毒核酸；,4，猪伪狂犬病病毒核酸；5，猪圆环病毒2型核酸。图5b组引物lamp特异性试验结果琼脂糖凝胶电泳图。m，dl2000marker；1，缺失cd2v和360-505r株；2，猪瘟病毒核酸；3，猪细小病毒核酸；4，猪伪狂犬病病毒核酸；5，猪圆环病毒2型核酸。图6a组引物lamp灵敏度试验结果琼脂糖凝胶电泳图。m，dl2000marker；1，质粒1×106拷贝/μl；2，质粒1×105拷贝/μl；3，质粒1×104拷贝/μl；4，质粒1×103拷贝/μl；5，质粒1×102拷贝/μl；6，质粒1×101拷贝/μl；7，质粒1×100拷贝/μl。图7b组引物lamp灵敏度试验结果琼脂糖凝胶电泳图。m，dl2000marker；1，质粒1×106拷贝/μl；2，质粒1×105拷贝/μl；3，质粒1×104拷贝/μl；4，质粒1×103拷贝/μl；5，质粒1×102拷贝/μl；6，质粒1×101拷贝/μl；7，质粒1×100拷贝/μl。具体实施方式以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例中所用的原料如无特殊说明，均可从常规商业途径得到。实施例1引物设计1.质粒根据genebank上提供的非洲猪瘟病毒基因序列(genbank:mk333180.1)，选取其中的部分片段(seqidno.15，seqidno.16所示)，由擎科新业生物技术有限公司合成质粒puc57-cd2v，puc57-360缺失溶解稀释至1.0×106拷贝/μl。选取的基因序列：atgataatacttatttttttaatattttctaacatagttttaagtattgattattgggttagttttaataaaacaataattttagatagtaatattactaatgataataatgatataaatggagtatcatggaatttttttaataattcttttaatacactagctacatgtggaaaagcaggtaacttttgtgaatgttctaattatagtacatcaatatataatataacaaataattgtagcttaactatttttcctcataatgatgtatttgatacaacatatcaagtagtatggaatcaaataattaattatacaataaaattattaacacctgctactcccccaaatatcacatataattgtactaattttttaataacatgtaaaaaaaataatggaacaaacactaatatatatttaaatataaatgatacttttgttaaatatactaatgaaagtatacttgaatataactggaataatagtaacattaacaattttacagctacatgtataattaataatacaattagtacatctaatgaaacaacacttataaattgtacttatttaacattgtcatctaactatttttatactttttttaaattatattatattccattaagcatcataattgggataacaataagtattcttcttatatccatcataacttttttatctttacgaaaaagaaaaaaacatgttgaagaaatagaaagtccaccacctgaatctaatgaagaagaacaatgtcagcatgatgacaccacttccatacatgaaccatctcccagagaaccattacttcctaagccttacagtcgttatcagtataatacacctatttactacatgcgtccctcaacacaaccactcaacccatttcccttacctaaaccgtgtcctccacccaaaccatgtccgccacccaaaccatgtcctccacctaaaccatgtccttcagctgaatcctattctccacccaaaccactacctagtatcccgctactacccaatatcccgccattatctacccaaaatatttcgcttattcacgtagatagaattatttaa(seqidno.15)。atttatttttaatattgattcttttttgtatttaatcatttagagaaggtcatcataggagccagatgttctctctccagaacttatgtcgaaaaacattacctaaccgtaaacttcctgaattttttgacgaatatatattacaactgctgggattatactgggaaaaccatggaactattcaacgagcaggaaacaactgtgtgcttatacagcaacataccctcattcccgtaaatgaagccctgagaacagcagcagcgagacgtttcaataaaagggcttctaccctttgtaatcaaaaccatagaatatggtggaagcaaggagatagccataactctggctaaaaaatatcagcataaacatattttgaaatacttcgaaacctgggaaagctaggttcagtatggtgtactcactattgtagtgaatcgtatcctgtaaattttgtaaaaaagcttaaacttttgaccacatcatattgttttagaaatctcaaaccagtgaacaacagtct(seqidno.16)。2.阳性质粒的鉴定构建阳性质粒，构建含有cd2v基因片段的质粒与缺失第27942-35500位两侧区域基因片段的质粒，所述目的基因cd2v片段的序列如seqidno.13所示，所述缺失第27942-35500位两侧区域片段的序列如seqidno.14所示aacaatgtcagcatgatgacaccacttccatacatgaaccatctcccagagaaccattacttcctaagccttacagtcgttatcagtataatacacctatttactacatgcgtccctcaacacaaccactcaacccatttcccttacctaaaccgtgtcctccacccaaaccatgtccgccacccaaaccatgtcctc(seqidno.13)。ggattatactgggaaaaccatggaactattcaacgagcaggaaacaactgtgtgcttatacagcaacataccctcattcccgtaaatgaagccctgagaacagcagcagcgagacgtttcaataaaagggcttctaccctttgtaatcaaaaccatagaatatggtggaagcaaggagatagccataactctggctaaaaaatatcagc(seqidno.14)。采用本发明的第一套外引物cd2v-f3、cd2v-b3对阳性质粒puc57-cd2v进行pcr扩增，用本发明的第二套外引物360-505r-f3、360-505r-b3对阳性质粒puc57-360缺失进行pcr扩增，验证质粒的正确性，结果如图1所示。结果表明，两对引物扩增的目的基因大小正确、分别对应198bp、191bp电泳条带清晰、无杂带。3.lamp引物设计和筛选根据genebank公布的非洲猪瘟毒株基因序列，设计引物，由擎科新业生物技术有限公司，引物序列如表1所示：表1非洲猪瘟病毒野毒株与cd2v和360-505r双基因缺失疫苗株lamp检测引物组其中，a组：外引物：cd2v-f3：aacaatgtcagcatgatgac(seqidno:1)；cd2v-b3：gaggacatggtttgggtg(seqidno:2)；内引物：cd2v-fip：ctgataacgactgtaaggcttaggaaccacttccatacatgaacc(seqidno:3)；cd2v-bip：acctatttactacatgcgtccctaggacacggtttaggtaag(seqidno:4)；环引物：cd2v-lf：catacatgaaccatctcccagag(seqidno:5)；cd2v-lb：ccactcaacccatttcccttacc(seqidno:6)；b组：外引物：360-505r-f3：acagcagcagcgagacg(seqidno:7)；360-505r-b3：ggatacgattcactacaat(seqidno:8)；内引物：360-505r-fip：gttatggctatctccttgcttccaataaaagggcttctaccct(seqidno:9)；360-505r-bip：cagcataaacatattttgaagagtacaccatactgaacctag(seqidno:10)；环引物：360-505r-lf：ccatattctatggttttg(seqidno:11)；360-505r-lb：acttcgaaacctgggaaa(seqidno:12)。实施例2lamp反应体系的建立确定lamp检测的25μl反应体系中各组分的含量及比例，将其置于恒温容器中进行扩增。通过肉眼观察白色浑浊和凝胶电泳相结合，判断检测结果。其中25μl反应体系如表2所示。表2lamp反应体系(25μl)名称用量bstdna聚合酶1.0μl10×bstbuffer2.5μldntp2.5μlmg2+/mn2+混合物2.0μl引物6.0μldna模板2.0μlddh2o9.0μl总量25.0μl将浓度为103拷贝的阳性质粒作为检测对象，经试验确定lamp反应温度为65℃，最佳反应时间为50min。结果表明在65℃的条件下反应50分钟，a组引物以质粒puc57-cd2v作为模板进行检测、b组引物以质粒puc57-360缺失作为模板进行检测，阳性质粒lamp反应管均呈现白色浑浊(图2、图3)，且经电泳验证，所对应的阳性质粒检测的琼脂糖凝胶电泳结果中出现梯状条带(图4)。实施例3特异性试验使用常规方法提取非洲猪瘟病毒核酸，猪瘟病毒核酸、猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸、猪圆环2型病毒核酸、猪丹毒病毒核酸提取物作为模板，采用实施例1中lamp检测引物，按照实施例2中反应体系及反应条件分别进行检测，检测引物的特异性。结果见下表3、附图5、6。表3lamp的特异性测定统计实验结果表明，用该试剂盒检测猪瘟病毒核酸、猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸、猪圆环2型病毒核酸、猪丹毒病毒核酸提取物，结果全为阴性。a组引物检测已知非洲猪瘟病毒核酸，结果为阳性；b组引物检测360缺失质粒，结果为阳性。实施例4灵敏度试验非洲猪瘟病毒阳性冻干质粒puc57-cd2v与质粒puc57-360缺失用去离子水将质粒充分溶解稀释到1×106个拷贝数，而后，将稀释到1×106拷贝/μl的质粒做100～10-6梯度稀释，分别对不同拷贝数的阳性质粒样本进行lamp扩增和pcr扩增。表4lamp检测实验样品的灵敏度检测结果结果显示，从10-1～10-5倍稀释的质粒溶液中均可扩增到预期的阳性，可测的质粒最低浓度为101拷贝/μl(见图7-8)，而pcr检测的灵敏度为103拷贝/μl，相比而言，lamp检测的灵敏度提高了100倍。对上述样品检测的灵敏度结果见表4。实施例5灵敏度比较试验发明人在研究过程中，对于引物进行了大量的优化工作，特别是环引物，研究发现，环引物对于lamp检测的灵敏度具有重要的影响，以下表5为比较试验的对照组方案，实验组为实施例1中两套引物。表5灵敏度比较试验设置采用实施例2中反应体系及反应条件，在相同的条件下进行对比实验，检测结果见下表6。表6lamp检测实验样品的敏感性检测结果从表6中结果可以看出，本发明所构建的非洲猪瘟病毒野毒株与cd2v和360-505r双基因缺失疫苗株lamp检测试剂盒的灵敏度为10拷贝/μl，其可测到的最小质粒数为101拷贝/μl。相比对照组的引物，本发明实施例1的引物组具有更高的灵敏度，对于猪场净化具有更重要的意义。实施例6lamp检测试剂盒的构建试剂盒包含实施例1中提供的引物组、bstdna聚合酶、lamp反应液、甜菜碱、阳性对照和阴性对照。其中a、b两组引物的外引物、环引物、内引物的摩尔比为1:5:8。lamp反应液含有10mmdntp、10×thermopol反应缓冲液、150mmmgso4水溶液。阳性对照为含有cd2v基因片段的质粒与缺失第27942-35500位两侧区域基因片段的质粒，所述目的基因cd2v片段的序列如seqidno.13所示,所述缺失第27942-35500位两侧区域片段的序列如seqidno.14所示。阴性对照为去离子水。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。sequencelisting<110>华南农业大学肇庆大华农生物药品有限公司<120>一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与双基因缺失疫苗株的lamp检测引物及试剂盒<130><160>18<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1aacaatgtcagcatgatgac20<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<400>2gaggacatggtttgggtg18<210>3<211>45<212>dna<213>人工序列<400>3ctgataacgactgtaaggcttaggaaccacttccatacatgaacc45<210>4<211>42<212>dna<213>人工序列<400>4acctatttactacatgcgtccctaggacacggtttaggtaag42<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列<400>5catacatgaaccatctcccagag23<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列<400>6ccactcaacccatttcccttacc23<210>7<211>17<212>dna<213>人工序列<400>7acagcagcagcgagacg17<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列<400>8ggatacgattcactacaat19<210>9<211>43<212>dna<213>人工序列<400>9gttatggctatctccttgcttccaataaaagggcttctaccct43<210>10<211>42<212>dna<213>人工序列<400>10cagcataaacatattttga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技术特征：

1.一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与cd2v和360-505r双基因缺失疫苗株lamp检测引物组，包括以下a、b两组引物，每组引物包括：一对外引物、一对内引物和一对环引物，

a组：

外引物：

cd2v-f3：aacaatgtcagcatgatgac(seqidno:1)；

cd2v-b3：gaggacatggtttgggtg(seqidno:2)；

内引物：

cd2v-fip：ctgataacgactgtaaggcttaggaaccacttccatacatgaacc(seqidno:3)；

cd2v-bip：acctatttactacatgcgtccctaggacacggtttaggtaag(seqidno:4)；

环引物：

cd2v-lf：catacatgaaccatctcccagag(seqidno:5)；

cd2v-lb：ccactcaacccatttcccttacc(seqidno:6)；

b组：

外引物：

360-505r-f3：acagcagcagcgagacg(seqidno:7)；

360-505r-b3：ggatacgattcactacaat(seqidno:8)；

内引物：

360-505r-fip：gttatggctatctccttgcttccaataaaagggcttctaccct(seqidno:9)；

360-505r-bip：cagcataaacatattttgaagagtacaccatactgaacctag(seqidno:10)；

环引物：

360-505r-lf：ccatattctatggttttg(seqidno:11)；

360-505r-lb：acttcgaaacctgggaaa(seqidno:12)。

2.一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与cd2v和360-505r双基因缺失疫苗株lamp检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求1中所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括bstdna聚合酶、lamp反应液、甜菜碱、阳性对照和阴性对照。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述lamp反应液含有10mmdntp、10×thermopol反应缓冲液、150mmmgso4水溶液。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有非洲猪瘟病毒cd2v基因片段的质粒和含有非洲猪瘟病毒缺失第27942-35500位两侧区域基因片段的质粒。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述含有非洲猪瘟病毒cd2v基因片段的序列如seqidno.13所示，所述缺失第27942-35500位两侧区域基因片段的序列如seqidno.14所示。

7.根据权利要求2至6任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中两组引物的外引物、环引物，内引物的摩尔比为1:2:8。

8.一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与cd2v和360-505r双基因缺失疫苗株lamp检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

s1.提取待测样品dna；

s2.以步骤s1中提取的核酸为模板，配置两个25μl反应体系，包括引物、dna聚合酶、lamp反应液和待测样品dna，用无菌水补齐到25μl，然后千63～68℃下反应30～60min，所述两个25μl反应体系分别含有权利要求1中所述的两组引物中的一组；

s3.通过肉眼观察反应管中溶液是否变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳验证，确定病毒类型。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤s3所述确定病毒类型的方法为：

当两个反应管均未变浑浊，则说明未检测到非洲猪瘟野毒株和cd2v和360-505r双基因缺失疫苗株；

当两个反应管均变浑浊，则说明样品中含有含野毒株和cd2v和360-505r双基因缺失疫苗株；

当a组引物反应管变浑浊，b组引物反应管未变浑浊，则说明样品含有野毒株，且未检测到mgf360-505r基因缺失株；

当a组引物反应管未变浑浊，b组引物反应管变浑浊，则说明样品中未检测到野毒株，且含有mgf360-505r基因缺失株。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤s3所述确定病毒类型的方法为：

当两个反应管的琼脂糖凝胶电泳均无梯状条带，则说明未检测到非洲猪瘟野毒株和cd2v和360-505r双基因缺失疫苗株；

当两个反应管的琼脂糖凝胶电泳均有梯状条带，则说明样品中含有含野毒株和cd2v和360-505r双基因缺失疫苗株；

当a组引物反应管的琼脂糖凝胶电泳有梯状条带，b组引物反应管的琼脂糖凝胶电泳无梯状条带，则说明样品含有野毒株，且未检测到mgf360-505r基因缺失株；

当a组引物反应管的琼脂糖凝胶电泳无梯状条带，b组引物反应管的琼脂糖凝胶电泳有梯状条带，则说明样品中未检测到野毒株，且含有mgf360-505r基因缺失株。

技术总结

本发明公开了一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和360‑505R双基因缺失疫苗株LAMP检测引物及其LAMP检测试剂盒，所述检测引物包括两套引物，一套引物针对非洲猪瘟病毒野毒株的CD2v序列，能特异性检测非洲猪瘟病毒野毒株；另一套针对双基因缺失疫苗株,引物的位置在于360‑505R基因27942‑35500位缺失区两侧，能特异性的检测出该非洲猪瘟疫苗株。该检测方法采用恒温反应的检测手段，仅需加热即可实现整个反应，可以实现快速现场检测，所述方法检测灵敏度高、特异性强、重复性好、检测速度快，可以作为有效的非洲猪瘟病毒野毒株与CD2v和360‑505R双基因缺失疫苗株的的基层检测手段。

技术研发人员：沈永义;杨柔;陈瑞爱;沈雪娟;张旭;李延鹏;张文炎

受保护的技术使用者：华南农业大学;肇庆大华农生物药品有限公司

技术研发日：.11.18

技术公布日：.02.14

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