烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂及其制备方法与流程

本发明属于抗菌剂防治技术领域，尤其涉及烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂及其制备方法。

背景技术：

烟草是我国重要的经济作物之一，是我国重要的经济支柱产业，然而随着连作年限增加，土壤生态环境日趋恶劣，烟草有害生物发生种类增多。其中由烟草疫霉菌引起的一系列土传病害，例如黑胫病等，是烟草植保上面临的突出性难题。该病菌导致的病害一旦爆发流行，往往造成大面积烟株死亡，带来巨大的经济损失。目前针对烟草黑胫病防治的主要技术措施包括物理防控、农业操作鼓励、抗病品种选育以及化学药剂防治，比如采用选育抗病品种、高垄栽培、土壤深翻、轮作、生物拮抗菌剂等处理方法，但是这些操作方式要么效果不太理想，要么是不能适应目前的种植环境。目前，化学防治仍然是生产上控制烟草疫霉菌的主要方法。

随着纳米技术的飞速发展，纳米材料被广泛应用到能源、医药、环保、农业等各个领域。其中，纳米氧化铜因其具有特殊的杀菌性能被广泛应用于农药领域，与农药复配作为纳米农药杀死菌病。但是其在生产或使用过程中形成的颗粒物有意无意地会进入土壤和水体、植物中，进而对生物体造成潜在危害。植物对纳米氧化铜的吸收主要是通过内吞作用跨过细胞膜进入细胞，再经过表皮和皮层进入到中柱，对植物的毒害作用主要表现在对植物生长的影响，在纳米氧化铜的胁迫下，植物生长缓慢，严重时会使幼苗黄化，叶边缘委蔫，对烟叶的生长和品质造成极大影响，采用纳米氧化铜作为抗菌剂原料的时候要阻碍植物的内吞作用，所以，目前急需一种纳米抗菌剂，该抗菌剂对烟叶生长不会产生毒害作用，更不会对烟叶品质造成影响。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂及其制备方法，利用纳米氧化铜与甲霜灵锰锌的协同增强作用杀死烟草疫霉菌，提高烟草疫霉菌抗菌剂具有的杀菌活性，并且阻止或减弱烟叶细胞与纳米氧化铜之间内吞作用，防止烟叶生长受阻或减弱对烟叶品质造成的影响。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂，所述纳米氧化铜抗菌剂的主要成分为纳米氧化铜和甲霜灵锰锌，所述纳米氧化铜与甲霜灵锰锌的质量比为(25-200):1。

进一步，所述纳米氧化铜的粒径为20-100nm。

进一步，所述烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂中，纳米氧化铜的浓度为25mg/l-100mg/l。

进一步，所述烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂中，甲霜灵锰锌的浓度为0.25mg/l-1mg/l。

进一步，所述烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂中，纳米氧化铜的浓度为25mg/l，甲霜灵锰锌的浓度为0.5mg/l，质量比为50:1。

本发明还公开了烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂制备方法，包括以下步骤：

(1)纳米氧化铜的预处理：将纳米氧化铜分散于75-80w％的乙醇溶液中，通入直流电，20-30min后取出，再加入25wt％的甲基-β-环糊精溶液中，于频率为35khz的超声仪器中超声波分散30-45min后，水浴加热至含水量低于20wt％后，用氮气吹干，紫外线照射5min后，得到经过预处理的纳米氧化铜；本步骤的目的在于对纳米氧化铜进行预处理，防止纳米氧化铜在烟叶细胞内发生内吞作用；

(2)抗菌剂制备：将经过预处理的纳米氧化铜加入超纯水中，调节ph＝6-7后加入阿拉伯胶，搅拌并同时水浴加热至35-45℃，阿拉伯胶溶解后停止加热，自然冷却后加入甲霜灵锰锌，搅拌均匀，得到抗菌剂。

进一步，所述步骤(1)中，直流电电压为10-12v，电极均为铜片。

进一步，所述步骤(1)中，纳米氧化铜与甲基-β-环糊精溶液的重量比为1:1。

进一步，所述步骤(2)中，阿拉伯胶和纳米氧化铜的质量比为0.01:4。

为了防止烟叶细胞产生内吞作用将纳米氧化铜转移到烟叶植物的各个部位，所以需要将纳米氧化铜进行预处理，致使其性质微变，在不丧失增强甲霜灵锰锌的效果和杀死烟叶疫霉菌的条件下，防止产生内吞作用。将纳米氧化铜在直流电源下处理20-30min后，其表面的电荷密度改变，提高活性，在超声作用下纳米氧化铜表面容易被甲基-β-环糊精修饰，呈现出抑制作用，此时植物细胞对纳米氧化铜产生抑制阻碍了或者减少了进入烟叶植物细胞的纳米氧化铜的量，进而降低了纳米氧化铜对烟叶生长造成的影响，并且也降低了纳米氧化铜在土地和生物累积量。

调节ph呈弱酸性或中性，不仅可以稳定甲霜灵锰锌，使抗菌剂保存得更久，还可以防止纳米氧化铜的沉积，并且弱酸或中性条件下不容易对烟叶的生长造成影响。纳米氧化铜的粒径小，表面能和比表面积大，容易在溶液中产生团聚，加入阿拉伯胶后可以防止纳米氧化铜颗粒之间产生团聚，并且促使其在溶液中的稳定性提高，分散得更加均匀。

本发明的有益效果：

1、本发明提供了烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂，利用纳米氧化铜与甲霜灵锰锌的协同增强作用杀死烟草疫霉菌，提高烟草疫霉菌抗菌剂具有的杀菌活性，为防治烟草疫霉菌提供了新的防治材料与技术途径。

2、通过对纳米氧化铜的预处理，阻止或减弱烟叶细胞与纳米氧化铜之间内吞作用，防止烟叶生长受阻或减弱对烟叶品质造成的影响，还进一步阻止了纳米氧化铜在植物或土壤中累积，进而阻止了纳米氧化铜在生物体内的累积。

3、当烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂中纳米氧化铜的浓度为25mg/l，甲霜灵锰锌浓度为0.5mg/l，质量比50:1效果最好，增效因子达到1.51。

4、烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂新颖、安全，无污染较少，方法简单、效果突出，具有较高的协同增效作用，可以有效克服和延缓病菌的抗药性，降低农药的使用量，减少农药的土壤与作物残留。

附图说明

图1是预处理后的纳米氧化铜对烟草疫霉菌的抗菌性能测试中烟草疫霉菌的生长情况图；

图2是预处理后的纳米氧化铜对烟草疫霉菌菌丝抑制的扫描电镜观察图；

图3是预处理后的纳米氧化铜对烟草疫霉菌孢子萌发抑制实验中的烟草疫霉菌孢子萌发图。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施例进行详细说明：

实施例1：烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂一

(1)纳米氧化铜的预处理：称取5g粒径为20-50nm的纳米氧化铜分散于50ml75w％的乙醇溶液中，10v通入直流电，电极为铜片，通电20min后取出，再加入5g甲基-β-环糊精制备的25wt％的甲基-β-环糊精溶液中，于频率为35khz的超声仪器中超声波分散45min后，水浴加热直至含水量低于20wt％后，用氮气吹干，340nm紫外线照射5min后，得到经过预处理的纳米氧化铜。

(2)抗菌剂制备：将经过预处理的纳米氧化铜加入超纯水中，调节ph＝6-6.5后加入0.0125g阿拉伯胶，搅拌并同时水浴加热至35℃，阿拉伯胶溶解后停止加热，自然冷却后加入0.2g甲霜灵锰锌，搅拌均匀，得到抗菌剂，经测量，纳米氧化铜的浓度为25mg/l，甲霜灵锰锌的浓度为1mg/l。

实施例2：烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂二

(1)纳米氧化铜的预处理：称取20g粒径为50-100nm的纳米氧化铜分散于120ml80w％的乙醇溶液中，12v通入直流电，电极为铜片，通电45min后取出，再加入20g甲基-β-环糊精制备的25wt％的甲基-β-环糊精溶液中，于频率为35khz的超声仪器中超声波分散30min后，水浴加热直至含水量低于20wt％后，用氮气吹干，340nm紫外线照射5min后，得到经过预处理的纳米氧化铜；

(2)抗菌剂制备：将经过预处理的纳米氧化铜加入超纯水中，调节ph＝6.5-7后加入0.5g阿拉伯胶，搅拌并同时水浴加热至45℃，阿拉伯胶溶解后停止加热，自然冷却后加入0.4g甲霜灵锰锌，搅拌均匀，得到抗菌剂，经测量，纳米氧化铜的浓度为20mg/l，甲霜灵锰锌的浓度为0.4mg/l。

实施例3:预处理后的纳米氧化铜对烟草疫霉菌的抗菌性能测试

制备六个相同的经过高温灭菌的oa培养基，向其中五个oa培养基中分别加入经过实施例1步骤(1)相同预处理步骤的纳米氧化铜，分别配制成纳米氧化铜浓度为6.25、12.5、25、50、100mg/l且总体积相等的固体培养基平板，余下的一个作为空白对照组，然后向每个平板中间放置1个直径6mm疫霉菌菌饼。观察菌落生长情况。

得到的结果如图1所示，6.25、12.5、25、50mg/l与对照相比菌落生长受到不同程度抑制，随着浓度增加抑制作用加强；在含有100mg/l的纳米氧化铜的oa固体培养基平板上并未出现疫霉菌菌落，说明预处理后的纳米氧化铜对烟草疫霉菌具有非常好的抗菌性。

实施例4：预处理后的纳米氧化铜对烟草疫霉菌菌丝抑制的扫描电镜观察

制备六个相同的培养基，分别编号为a1、a2、a3、b1、b2、b3。用打孔器(d＝6mm)打取培养3d后的烟草疫霉菌菌饼若干，将等质量的菌饼接种到含50mg/l的经过实施例1步骤(1)预处理的纳米氧化铜(b1、b2、b3)和不含纳米氧化铜(a1、a2、a3)的培养基中央培养3d(黑暗条件，28℃)。然后，从培养基边缘切下含有真菌菌丝的琼脂块，收集菌丝，采用扫描电镜进行镜检观察。

得到的结果如图2所示，经过预处理的纳米氧化铜处理(b1、b2、b3)，疫霉菌菌丝形态异常，菌丝表面出现凹凸和塌陷等异样，与对照组(a1、a2、a3)菌丝体完整正常。说明经过预处理的纳米氧化铜对烟草疫霉菌菌丝有抑制作用。

实施例5：预处理后的纳米氧化铜对烟草疫霉菌孢子萌发抑制实验

将烟草疫霉菌活化后，经过诱导制备孢子悬浮液，悬浮液的浓度为106个/ml。将经过实施例1步骤(1)预处理后纳米氧化铜制备成不同浓度的水溶液，取干净无菌的凹玻片六片，用枪头吸取10μl纳米氧化铜水溶液分别置于其中五片凹玻片上，其中纳米氧化铜的浓度分别为100、50、25、12.5、6.25mg/l，剩余的一块为空白对照组，再用枪头吸取10μl制备好的孢子菌悬液，依次添加于每个载玻片上，将含有纳米氧化铜的载玻片吹打均匀，分别制成含有纳米氧化铜的孢子菌悬液。将载玻片置于人工气候培养箱中26℃培养，培养4h后取出凹玻片，置于10×40倍光学显微镜下观察孢子萌发的情况。

得到的结果如图3所示，6.25、12.5、25、50mg/l与对照相比疫霉菌的孢子萌发受到不同程度抑制，随着浓度加大抑制作用增强，100mg/l处理的萌发率为37.74％，显著低于对照的90.35％。说明预处理后的纳米氧化铜对烟草疫霉菌孢子萌发具有抑制作用。

实施例6:烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂抗菌活性测定

参照实施例2的步骤制备烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂，其中纳米氧化铜、甲霜灵锰锌的浓度与质量如表1所示。分别将10μl烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂加入到对应的融化的相同配方的oa培养基中，从3日龄真菌培养物边缘获得的菌饼(6mm)置于每个培养皿的中心。然后将所有样品在28℃下在黑暗中温育，3d后测量菌落直径。

表1纳米氧化铜与甲霜灵锰锌对烟草疫霉菌的协同增效抗菌活性

如表1所示，从实测的疫霉菌的抑制率分析，烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂中，甲霜灵锰锌与经过预处理后的纳米氧化铜混合质量比在(25-100):1范围内均具有增效杀菌作用，其中纳米氧化铜25mg/l+甲霜灵锰锌0.5mg/l，质量比50:1效果最好，增效因子达到1.51。

实施例7：抑制内吞作用实验测定

将实施例1的制备的烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂(纳米氧化铜的浓度为25mg/l)喷施于感染有烟草疫霉菌的烟草烟叶表面，每天喷施2次，每次5ml，连续喷施10d，重复3次，经测定，烟叶中，纳米氧化铜平均含量为8mg/l。

对照组采用同一批、但未经过预处理的纳米氧化铜以实施例1相同的制备步骤制备出抗菌剂(纳米氧化铜的浓度为25mg/l)，其他实验条件不变，重复3次，经测定，烟叶中，纳米氧化铜平均含量为75mg/l。

由此可知，通过对纳米氧化铜的预处理，可以减弱烟叶细胞与纳米氧化铜之间内吞作用，进而降低纳米氧化铜在植物体内的累积。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

技术特征：

1.烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂，其特征在于，所述纳米氧化铜抗菌剂的主要成分为纳米氧化铜和甲霜灵锰锌，所述纳米氧化铜与甲霜灵锰锌的质量比为(25-200):1。

2.根据权利要求1所述的烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂，其特征在于，所述纳米氧化铜的粒径为20-100nm。

3.根据权利要求2所述的烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂，其特征在于，所述烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂中，纳米氧化铜的浓度为25mg/l-100mg/l。

4.根据权利要求3所述的烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂，其特征在于，所述烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂中，甲霜灵锰锌的浓度为0.25mg/l-1mg/l。

5.根据权利要求4所述的烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂，其特征在于，所述烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂中，纳米氧化铜的浓度为25mg/l，甲霜灵锰锌的浓度为0.5mg/l，质量比为50:1。

6.根据权利要求5所述的烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)纳米氧化铜的预处理：将纳米氧化铜分散于75-80w％的乙醇溶液中，通入直流电，20-30min后取出，再加入25wt％的甲基-β-环糊精溶液中，于频率为35khz的超声仪器中超声波分散30-45min后，水浴加热至含水量低于20wt％后，用氮气吹干，紫外线照射5min后，得到经过预处理的纳米氧化铜；

(2)抗菌剂制备：将经过预处理的纳米氧化铜加入超纯水中，调节ph＝6-7后加入阿拉伯胶，搅拌并同时水浴加热至35-45℃，阿拉伯胶溶解后停止加热，自然冷却后加入甲霜灵锰锌，搅拌均匀，得到抗菌剂。

7.根据权利要求6所述的烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，直流电电压为10-12v，电极均为铜片。

8.根据权利要求7所述的烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，纳米氧化铜与甲基-β-环糊精溶液的重量比为1:1。

9.根据权利要求8所述的烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，阿拉伯胶和纳米氧化铜的质量比为0.01:4。

技术总结

本发明涉及抗菌剂防治技术领域，尤其涉及烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂及其制备方法，所述纳米氧化铜抗菌剂的主要成分为纳米氧化铜和甲霜灵锰锌，所述纳米氧化铜与甲霜灵锰锌的质量比为(25‑200):1。本发明的目的在于提供烟草疫霉菌纳米氧化铜抗菌剂及其制备方法，利用纳米氧化铜与甲霜灵锰锌的协同增强作用杀死烟草疫霉菌，提高烟草疫霉菌抗菌剂具有的杀菌活性，并且阻止或减弱烟叶细胞与纳米氧化铜之间内吞作用，防止烟叶生长受阻或减弱对烟叶品质造成的影响。

技术研发人员：丁伟;李石力;武霖通;余佳敏;闫芳芳;陈娟妮

受保护的技术使用者：西南大学

技术研发日：.09.29

技术公布日：.02.21

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