本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域，尤其涉及一种低磷诱导型启动子及其应用。
背景技术：
玉米是世界上种植面积最广的谷类粮食作物之一，我国玉米播种面积和总产量都居世界第二位。玉米既可作为饲料和工业原料，也可作为食品，是改善人民生活水平和出口贸易的重要资源之一，对农业和畜牧业的发展具有十分重要的意义。磷是植物生长发育所必需的大量元素之一，它不但是生物膜和核酸的重要组成成分，还在光合作用、酶活性调节、呼吸作用、信号传导、氧化还原反应、能量代谢和碳代谢等方面具有十分重要的作用。虽然土壤中的磷元素很丰富，但能被植物直接吸收利用的却不多。因为在土壤中大部分的磷是以有机磷的形式存在的，而植物能直接吸收利用的磷是无机磷酸盐。
在玉米实际栽培过程中，尤其在酸性和碱性土壤中，需要人工施加大量的磷肥来保障玉米的产量。低磷是影响玉米生产的重要因素之一，低磷胁迫将对玉米苗期性状、根系、生理生化特性、成熟期性状等产生非常大的影响。且自然界中磷肥的来源也越来越少，有报道称在本世纪末自然界富含磷元素的矿石将消耗殆尽。因此，研究玉米的耐低磷机制对提高玉米的品质和产量就有重要的推动作用。
现有技术中，由于诱导型启动子在植物的正常适应生长条件下启动活性很低甚至不启动下游转录，但受到外界胁迫时，又可高效地启动转录，可见诱导型启动子对植物更好地适应自然环境并保持正常生长至关重要。因此，通过基因工程等方法，开发低磷诱导型启动子，以期通过植物遗传工程培育出耐低磷高产的玉米品种已成为当前一项急需解决的任务。
本发明基于上述问题，提供一种低磷诱导型启动子，在外界磷浓度低时可以诱导耐磷胁迫相关基因在短时间内得到大量表达，从而去适应低磷环境，低磷诱导型启动子作为转录水平上重要的调控元件，具有重要的应用价值。
技术实现要素：
本发明对植物耐低磷胁迫方面进行研究，要解决的技术问题是提供一种低磷诱导型启动子，利用该启动子能驱动外源基因在低磷条件下表达。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种低磷诱导型启动子，该启动子为包含seqidno：1所示的核苷酸序列、或具有与seqidno.1所示序列互补的核苷酸序列、或与seqidno.1所示核苷酸序列具有75％以上同源性的dna序列。
另一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体为在植物表达载体的多克隆位点插入所述低磷诱导型启动子得到的重组质粒，所述核苷酸序列连接于载体中待表达基因序列的上游。
在一种实现方式中，所述待表达的基因为gfp基因。该重组表达载体为将seqidno：1所示的序列即低磷诱导型启动子命名为pro-zm-mir399j或pro-zm-mir399j启动子；该启动子构建于植物双元表达载体pcambia3301中得到重组表达载体，本文中命名为pcambia3301-pro-zm-mir399j。在另一种实现方式中，在原始植物表达载体的多克隆位点处引入绿色荧光蛋白基因(gfp基因)，并在该gfp基因前插入低磷诱导型启动子pro-zm-mir399j的核苷酸序列，以驱动下游基因gfp基因表达，并在gfp基因后接核定位信号nls。
另一方面，本发明还提供一种植物遗传工程转化的宿主细胞，所述宿主细胞含有所述低磷诱导型启动子、或含有所述重组表达载体。
另一方面，本发明提供一种所述低磷诱导型启动子在培育转基因植物中的应用，所述应用包括：将所述低磷诱导型启动子连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
另一方面，本发明提供一种所述重组表达载体在培育转基因植物中的应用，所述应用包括：将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
另一方面，本发明提供一种所述宿主细胞在培育转基因植物中的应用，所述应用包括：将所述宿主细胞转化到组织或器官中进行培育。
另一方面，本发明提供一种所述低磷诱导型启动子在提高植物耐低磷的基因工程中的应用。
另一方面，本发明提供一种所述重组表达载体在提高植物耐低磷的基因工程中的应用。
另一方面，本发明提供一种所述宿主细胞在提高植物耐低磷的基因工程中的应用。
进一步地，本发明上述应用用于提高植物在低磷条件下的生长生存能力，从而培育理想的植物品种。所述植物为单子叶植物：小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦。
利用本发明的pro-zm-mir399j启动子驱动gfp基因在玉米中表达，本发明的启动子在低磷条件下，能够诱导gfp基因，由此表明，本发明的启动子pro-zm-mir399j是一个低磷诱导的启动子。
本发明技术人员应当理解根据seqidno：1第1-2000位所示的核苷酸序列，对其替换、缺失或增加一个或几个核苷酸，获得具有相同功能的核苷酸序列；与所述低磷诱导型启动子的dna序列有至少75％同源性的dna序列；或者，所述启动子还包括在高严谨条件下可与seqidno：1所示的核苷酸序列杂交、且具有启动子功能的核苷酸序列，都属于本发明内容。
通过该低磷诱导型启动子pro-zm-mir399j在正常磷浓度时的生长发育没有不利影响，在低磷条件下能驱动外源基因表达，通过能够驱动促进根、叶生长的基因，或驱动激素调节基因，或代谢途径中的相关基因，促进根、叶的生长发育，而且在低磷条件下能促进玉米根、叶的伸长生长，提高玉米的耐低磷能力，具有非常重要的应用潜力。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为将启动子pro-zm-mir399j构建于pcbia3301载体质粒中的示意图；
图2为对本发明的pcbia3301-pro-zm-mir399j启动子进行酶切pcr验证的结果示意图；
图3为对获得的pro-zm-mir399j-gfp-nls转基因阳性玉米转基因苗细胞水平进行gfp荧光检测结果；
图4为定量pcr方法检测pro-zm-mir399j启动子驱动的gfp基因表达量；
图5为mir399j前体基因在玉米的根和叶中分别被低磷诱导的相对表达值曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明的方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本发明的范围。
实施例1、启动子pro-zm-mir399j的获得及表达载体构建
根据常规方法提取玉米b73品种基因组dna。根据ncbi中提供的玉米b73品种全基因组序列，搜索得到mir399j基因序列，我们以mir399j基因序列5’末端为起始位点上游2000bp作为低磷诱导型启动子的序列(seqidno:1)，命名为pro-zm-mir399j。
在表达载体的多克隆位点处引入绿色荧光蛋白基因(即gfp基因)，并在该gfp基因前插入低磷诱导型启动子pro-zm-mir399j的核苷酸序列(seqidno:1)，并在gfp基因后接核定位信号nls。本发明以玉米双元表达载体pcambia3301为例，从含gfp-nls序列的玉米双元表达载体pcambia3301上获得gfp-nls的序列，并根据选用的载体的特点，设计引物的酶切位点，添加15bp载体同源序列。
具体地，利用primer5引物设计软件依据玉米pro-zm-mir399j启动子的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。具体序列设计为：正向引物5’端带15bp与所选用载体重叠的序列，反向引物5’端带15bp与所选用载体重叠的序列，引物序列如下：
正向引物：tacgaattcgagctcttactttcacaaaggaagagca
反向引物：gctcaccattctagatggacgatggatctagctagc
本发明以含玉米b73品种基因组dna为模板，利用正向引物、反向引物扩增pro-zm-mir399j序列，按常规pcr体系，采用如下扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，循环35次；最后72℃延伸10min。回收pcr扩增的目的片段，目的片段长度972bp。
将pcr产物送去广州艾基生物技术有限公司进行测序，并与ncbi中该启动子序列比对。测序结果表明，pcr产物具有序列表的序列，末端第1至2000位核苷酸所示的dna片段，并将序列表的序列末端第1至2000位核苷酸所示的dna片段命名为pro-zm-mir399j。
用限制性内切酶xbai和pvui双酶切植物表达载pcambia3301，并回收线性化载体骨架。同时回收pro-zm-mir399j片段。用vazyme的onestepcloningkit将gfp-nls连接到酶切后的pcambia3301载体上,按照热激法转化大肠杆菌dh5α感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，经菌落pcr筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒。将经过菌落pcr筛选重组子和双酶切验证正确的(检测结果如图2所示，显示转基因玉米基因型鉴定的结果与预期相符，为阳性植株)阳性克隆摇菌液提质粒送交广州艾基生物技术有限公司测序，测序正确的重组子(如图1所示，显示转基因玉米中所转入载体的信息，其包含了mir399j启动子、gfp序列、mir399j启动gfp的表达)，提取其质粒，挑取阳性的菌落摇菌，并用甘油保存菌液备用。
实施例2、水培及pro-zm-mir399j启动子低磷诱导活性基因型鉴定
将构建好的pcambia3301-mir399j-pro-gfp-nls载体(如图1所示)通过脓杆菌转染到玉米中。按照trizol法分别提取转化了启动子的转基因玉米叶片和根部的dna。
具体实施时，将转基因的玉米种子用霍格兰营养液水培至v1时期(v1期即幼苗长出第一个叶环)，取少许叶子提dna做基因型鉴定，基因型鉴定的上游引物序列如下：
正向引物：gtccatctagaatggtgagcaaggg
反向引物：tagttgccgtcgtccttgaaga
产物大小为331bp，将鉴定为阳性的幼苗分成两组，分别进行低磷处理和正常磷处理培养7天后，分别取叶子和根，用显微镜观察荧光情况。
另外用常规方法反转录得到cdna后再进行qpcr分析gfp的表达量、统计低磷处理和正常磷处理时、幼苗叶和根中的基因相对表达量，其中，所述qpcr的引物序列如下：
正向引物：aggacgacggcaactacaag
反向引物：ttctgcttgtcggccatgat
结果如图3和图4所示，图3显示在低磷处理前与处理后玉米幼苗根和叶中gfp在细胞水平的表达量，在低磷胁迫处理后植株的根和叶中都有明显的荧光(图3a、b和c，图4)，图4表明了低磷处理后gfp的表达量升高，在低磷处理后，根中的gfp表达量达到处理前的近3倍、且叶中的gfp表达量达到处理前的2倍多。由此可知，pro-zm-mir399j启动子是一个低磷诱导启动子。
实施例3、定量pcr鉴定pro-zm-mir399j启动子低磷诱导活性
用常规方法反转录得到cdna后再进行qpcr分析pro-zm-mir399前体基因的表达量、统计低磷处理和正常磷处理时、幼苗叶和根中的基因相对表达量，其中，所述qpcr的引物序列如下：
正向引物：ggttgcttggctctgctatgctg
反向引物：cgatcttgttcgagctgaagacag
结果如图5所示。图5表明mir399j前体基因在玉米的叶和根中都能被低磷显著诱导表达(h表示小时、d表示天数)；在正常营养液处理、及低磷胁迫处理同时进行实验室对比时，低磷营养液处理后植株的叶中mir399j前体基因的相对表达量在第7天时达到峰值、是其在正常营养液处理中的近20倍(图5中，5a表示植株的叶中mir399j前体基因的相对表达量，其中线l1表示低磷营养液处理后的基因相对表达量、线l2表示正常营养液处理后的基因相对表达量)；进一步地，在正常营养液处理、及低磷胁迫处理同时进行实验室对比时，低磷营养液处理后植株的根中mir399j前体基因的相对表达量在第10天时达到峰值、是其在正常营养液处理中的近70倍(图5中，5b表示植株的根中mir399j前体基因的相对表达量，其中线l3表示低磷营养液处理后的基因相对表达量、线l4表示正常营养液处理后的基因相对表达量)；由此可表明植株的叶、根在低磷处理后gfp的表达量升高。
进一步地，在正常营养液处理、及低磷胁迫处理同时进行实验室对比时，低磷营养液处理后植株的叶中mir399j前体基因的相对表达量在第7天时、是低磷营养液处理后植株的根中mir399j前体基因的相对表达量的近10倍(图5中，对比图5a的线l1与图5b的线l13表示的基因相对表达量可看出)；并且可表明在低磷胁迫处理后的一段时间内叶中该启动子的低磷诱导活性强于根中该启动子的诱导活性。
具体实施例4、启动子pro-zm-mir399j的信息分析
通过在线启动子分析软件plantcare对低磷诱导型启动子pro-zm-mir399j中的顺式作用元件进行分析，以预测zm-mir399j-pro启动子序列中调控元件，结果如下表所示。
由于多细胞有机体在生长、分化和发育过程中需要整合不同组织的、发育的、环境的信号调节基因表达，转录起始的调节是其中的重要一环。顺式作用元件是同一dna分子中具有转录调节功能的特异dna序列，即具有特殊功能的转录因子dna结合位点和其他调控基序(motif)。根据上表可知采用软件预测可获得本发明的启动子pro-zm-mir399j中的调控元件。其中，调控元件g-box是很多应激响应启动子行使功能所必须的原件，在植物启动子对光、无氧环境和植物激素的影响过程中起到很重要的作用。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
技术特征：
1.一种低磷诱导型启动子，其特征在于，该启动子包含seqidno：1所示的核苷酸序列、或具有与seqidno.1所示序列互补的核苷酸序列、或与seqidno.1所示核苷酸序列具有75％以上同源性的dna序列。
2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为在植物表达载体的多克隆位点插入如权利要求1中所述低磷诱导型启动子得到的重组质粒，所述核苷酸序列连接于载体中待表达基因序列的上游。
3.一种植物遗传工程转化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求1中所述低磷诱导型启动子、或含有如权利要求2中所述重组表达载体。
4.一种如权利要求1所述的低磷诱导型启动子在培育转基因植物中的应用。
5.一种如权利要求2所述重组表达载体在培育转基因植物中的应用。
6.一种如权利要求3所述的宿主细胞在培育转基因植物中的应用。
7.一种如权利要求1所述的低磷诱导型启动子在提高植物耐低磷的基因工程中的应用。
8.一种如权利要求2所述重组表达载体在提高植物耐低磷的基因工程中的应用。
9.一种如权利要求3所述的宿主细胞在提高植物耐低磷的基因工程中的应用。
10.根据权利要求4-9所述的应用，其特征在于，所述应用用于提高植物在低磷条件下的生长生存能力；所述植物为单子叶植物：小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦。
技术总结
本发明提供一种低磷诱导型启动子及其应用，本发明还提供了含有该启动子的表达和植物表达载体，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID No：1的11862位所示，序列全长1862个碱基。本发明的启动子主要是在根部表达，并受到低磷诱导。本发明将上述启动子应用在植物转基因工程中。具体而言，本发明提供的启动子可以驱动外源基因在植物中表达，特别能够驱动外源基因在玉米根部表达，而在植物的其它组织中不表达，可改善玉米的根部性状。同时，本发明可以用于提高和改善玉米在低磷条件下的生存和生长能力，从而培育出理想的玉米品种。
技术研发人员：刘琳;何娟;江曾明;于宇;莫蓓莘;陈雪梅
受保护的技术使用者：深圳大学
技术研发日：.08.16
技术公布日：.02.14
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