背景
被遗传上赋予适合支持人细胞和组织的小鼠已成为弥合小鼠模型与人研究之间的空白的最受欢迎模型(,legrand等人,cellhostmicrobe6:5-9；,shultz等人,natrevimmunol7:118-130；,manz,immunity26:537-541)。特别地，在造血干细胞和祖细胞(hspc)移植后重建功能性人免疫系统的小鼠对于一般性研究候选疫苗和局限于人体内的病原体生物学以及免疫功能具有很大的意义。
为了实现有效的异种移植，缺乏适应性免疫系统和自然杀伤(nk)细胞的小鼠已在最近几年被成功开发，并且主要模型的区别主要在于使用的背景菌株。第一种模型使用balb/crrag2-/-yc-/-(dko)小鼠和新生肝内hspc转移(,traggiai等人,science304:104-107；,gimeno等人,blood104:3886-3893)。第二种模型通过静脉内或肝内注射人hspc重构nod/scid/yc-/-(nsg)小鼠(2002,ito等人,blood100:3175-3182；,ishikawa等人,blood106:1565-1573；,shultz等人,jimmunol174:6477-6489)。转移到这些小鼠中后，人hspc可以发育为大多数造血谱系，并且人嵌合状态可以维持数月(,traggiai等人,science304:104-107；,ishikawa等人,blood106:1565-1573)。总体而言，在这些模型中，移植的细胞的组成相似，但在基于nod的模型中获得更高的人移植水平(,brehm等人,clinimmunol135:84-98)。
通过开发新的免疫缺陷宿主种群和小鼠品系(例如缺乏il-2受体共同γ链的nod-scidil2rγnull小鼠)，已增强了人源化的小鼠模型效用。这些小鼠种群缺乏适应性免疫功能，在先天免疫中表现出多种缺陷，并支持升高水平的人淋巴造血系统移植(pearson等人,creationof“humanized”micetostudyhumanimmunity,curr.protoc.immunol.may；chapter:unit–15.21,doi:10.1002/0471142735.im1521s81)。就是说，缺少t细胞b细胞和nk细胞的nod-scidil2rγnull品系(nsg)允许接受人组织，并且容易被人外周血(pb)或骨髓(bm)衍生的细胞移植(shultzld,ishikawaf,greinerdl()humanizedmiceintranslationalbiomedicalresearch,natrevimmunol7:118-130；shultzld,brehmma,bavaris,greinerdl()humanizedmiceasapreclinicaltoolforinfectiousdiseaseandbiomedicalresearch.almnyacadsci1245:50-54)。
因为缺乏t细胞、b细胞和nk细胞的严重免疫受损的小鼠由于其对人起源的细胞和组织的排斥减少而已成为人细胞异种移植的广泛使用的宿主，所以人们已经持续致力于改善小鼠品系、模型和相关方法学以更好地模拟人免疫功能(,traggiai等人,science304:104-107；2002,ito等人,blood100:3175-3182；,ishikawa等人,blood106:1565-1573；,shultz等人,jimmunol174:6477-6489)。
例如，已经使用了几种方法来改善人细胞移植以及在cd34+细胞移植小鼠中不平衡谱系分化的可能性。这些方法包括瞬时方法，例如流体动力学注射质粒dna(,chen等人,procnatlacadsciusa106:21783-21788)，注射细胞因子以及用慢病毒感染小鼠或cd34+细胞(,o"connell等人,plosone5:e1；,huntington等人,jexpmed206:25-34；,vanlent等人,jimmunol183:7645-7655)。备选地，已证明人mhc分子的转基因表达可改善体内抗原特异性免疫反应的发展(,jaiswal等人,plosone4:e7251；,strowig等人,jexpmed206:1423-1434；,danner等人,plosone6:e19826)。然而，由于非生理性表达例如在转基因gm-csf和il-3的小鼠中，细胞因子的过表达也可能具有有害的副作用(，nicolini等人，leukemia18：341-347)。备选地，已经通过遗传改造小鼠以用其人对应物替代小鼠基因来体内提供了人生长因子，从而导致它们在生理水平上在适当的生态位中表达。实际上，据报道，小鼠gm-csf和il-3以及血小板生成素(tpo)组的可靠替代被报道分别改善人巨噬细胞在肺中的发展以及骨髓中hspc和hpc的维持(,rongvaux等人,procnatlacadsciusa94:5320-5325；,willinger等人,procnatlacadsciusa108:2390-2395)。值得注意的是，在人tpo敲入小鼠中，尽管骨髓中干细胞和祖细胞的移植水平大大提高，但在外周未观察到变化，这表明外周可能存在限制因素，例如吞噬细胞的破坏。
在此，本发明人提供了用于已知调节人免疫功能的ccr5细胞受体的结合剂在免疫受损的小鼠品系中的使用，以进一步改善人免疫系统移植、改善整体小鼠健康(例如，维持体重)并增加小鼠寿命，以及相关模型和方法。根据本发明，在免疫受损的小鼠品系中，向移植的小鼠提供ccr5结合剂，以促进或改善移植、进一步改善总体小鼠健康(例如，维持体重)并延长小鼠寿命，并提供相关的模型和方法。本发明实现了具有人源化的免疫系统的小鼠，其中在小鼠骨髓、小鼠脾脏和小鼠外周血细胞中的一种或多种中的移植水平大于或等于约60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，如通过移植的人细胞的流式细胞术分析的。本发明实现了具有人源化的免疫系统的小鼠，其中相对于不接受ccr5结合剂的小鼠，在例如维持体重、身体活动和总体外观方面，小鼠的总体健康状况得到增强。本发明实现了具有人源化的免疫系统的小鼠，其中相对于不接受ccr5结合剂的小鼠，小鼠的寿命得以提高。这种改善的寿命可能是由于例如小鼠中异种移植物抗宿主疾病的延迟、减少、阻止(部分或完全)而导致的。
因此，本发明的化合物和方法提供了一种动物模型，该动物模型更好地模拟人免疫功能，并且能够更好地并且可以完全支持和维持人造血系统的移植，并且其中小鼠表现出改善的健康和寿命。本发明的人源化小鼠模型可以有利地用于研究候选疫苗和局限于人体内的病原体的生物学以及一般免疫功能。
简要概述
本发明提供了对免疫调节细胞受体如ccr5细胞受体的抑制或阻断，以促进实验室动物中人免疫系统的改善或完全重建。本发明使得具有重建的人源化的免疫系统的实验动物成为可能，该实验动物相对于不接受ccr5结合剂的实验动物具有改善的健康和寿命。因此，本发明总体上涉及ccr5结合剂和改进的动物模型、组合物，以及产生和使用移植了人造血系统的转基因非人动物的方法。
在各种实施方案中，本发明的移植人造血系统的转基因非人动物可用作用于体内评估造血细胞和免疫细胞的生长和分化、用于体内评估免疫反应、用于体内评估疫苗和疫苗接种方案、用于体内研究人病原体、用于体内产生和收集免疫介质包括人抗体、和用于测试调节造血和免疫细胞功能的药物的作用的系统。
本发明的一个优选实施方案提供了具有异种造血干细胞移植和抗ccr5细胞受体结合剂的免疫受损的小鼠品系，其表现出改善的或完全人源化的免疫系统、改善的健康和寿命，以及提供了制备或使用这样的品系的方法。
附图简要说明
图1显示了pro140对每周两次(从第1天开始)腹膜内施用2mgpro140的nsg小鼠中的八(8)只异种gvhd的平均重量(克)的影响。在第(-1)天，雄性nsg小鼠接受了2.25cgy的全身辐射。在第0天，小鼠通过尾静脉静脉内接受107个新鲜的ficoll-hypaque纯化的正常人骨髓细胞(56岁男性供体)。对照小鼠接受正常人igg。
图2显示了pro140对每周两次(从第1天开始)腹膜内施用2mgpro140的nsg小鼠中的八(8)只异种gvhd的存活的影响。在第(-1)天，雄性nsg小鼠接受了2.25cgy的全身辐射。在第0天，小鼠通过尾静脉静脉内接受107个新鲜的ficoll-hypaque纯化的正常人骨髓细胞(56岁男性供体)。对照小鼠接受正常人igg。通过kaplan-meier方法和mantel-cox对数秩检验分析存活率百分比(％)。
图3显示了pro140对每周两次(从第1天开始)腹膜内施用0.2mgpro140的nsg小鼠中的八(8)只异种gvhd的平均重量(克)的影响。在第(-1)天，雄性nsg小鼠接受了2.25cgy的全身辐射。在第0天，小鼠通过尾静脉静脉内接受107个新鲜的ficoll-hypaque纯化的正常人骨髓细胞。对照小鼠接受正常人igg。
图4显示了pro140对每周两次(从第1天开始)腹膜内施用0.2mgpro140的nsg小鼠中的八(8)只异种gvhd的存活的影响。在第(-1)天，雄性nsg小鼠接受了2.25cgy的全身辐射。在第0天，小鼠通过尾静脉静脉内接受107个新鲜的ficoll-hypaque纯化的正常人骨髓细胞。对照小鼠接受正常人igg。通过kaplan-meier方法和mantel-cox对数秩检验分析存活率百分比(％)。
图5a、5b、5c和5d显示了nsg小鼠中pro140对异种gvhd的作用。每周两次腹膜内给药的pro140的外周血中移植人细胞的流式细胞术分析从第1天开始。从隐静脉在指定的日期抽取外周血(100ul)到肝素化试管中。每组有8只动物，并且实验进行了两次。左边的图代表高剂量(2.0mg)实验(图5a和图5c)，右边的图代表低剂量(0.2mg)实验(图5b和图5d)。
图6显示了pro140对每周两次(从第1天开始)腹膜内施用2mgpro140的八(8)只nsg小鼠中的异种gvhd的作用。该图提供了第54天对外周血中和骨髓中的移植的人细胞的流式细胞术分析。第54天，从隐静脉抽取外周血(100ul)到肝素化试管中。人抗体被用于检测cd45+细胞(所有分化的造血细胞)。外周血(pb)和脾脏(spl)p<0.05，bmn.s.。每组有8只动物(两个实验组，对照igg和pro140)。上面三幅图代表对照igg组的单只小鼠。下面三幅图代表pro140组中的单只小鼠。绝对细胞数旁边的星号表示八只小鼠的实验组之间的p<0.05。
图7显示了人骨髓(bm)的移植于nsg小鼠中。人抗体检测cd45+细胞(所有分化的造血细胞，pe-cy7荧光染料)和cd3(成熟t细胞，fitc)。该图像提供了移植前人供体和鼠受体细胞(上边的图，左为供体骨髓，右为受体外周血)和安乐死时(第75天)pro140高剂量实验的代表性鼠受体(下边的图，左为外周血，右为骨髓)中门控白细胞的流式细胞术分析。
图8a和8b显示了pro140对每周两次(从第1天开始)腹膜内施用2mgpro140的八(8)只nsg小鼠(图8a)和每周两次(从第1天开始)腹膜内施用0.2mgpro140的八(8)只nsg小鼠(图8b)中的人cd4+细胞和异种gvhd百分比的影响。该图提供了安乐死时外周血、脾脏和骨髓中移植的人细胞的流式细胞术分析。
详述
本发明总体上涉及产生和使用移植了人造血系统的转基因非人动物的组合物和方法，其包括抗ccr5细胞受体结合剂以改善移植、动物健康和动物寿命。
1.ccr5细胞受体
ccr5细胞受体或ccr5受体在许多免疫反应中很重要。尽管ccr5在正常免疫功能中的确切作用尚未完全确定，但它可能在针对感染的炎性反应中起作用。
ccr5受体是在淋巴细胞(例如nk细胞、b细胞)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、t细胞子集等上表达的c-c趋化因子g偶联蛋白受体。ccr5主要在t细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞和小胶质细胞上表达。ccr5蛋白属于完整膜蛋白的β趋化因子受体家族。ccr5-趋化因子(c-c基序)受体5(基因/假基因)(geneticshomereference(“ccr5-chemokine”)；samsonm,labbe0,mollereauc,vassartg,parmentierm(1996),molecularcloningandfunctionalexpressionofanewhumancc-chemokinereceptorgene,biochemistry35:3362-3367)。
ccr5受体以蛇形方式跨越细胞质膜七次。细胞外部分代表靶向ccr5的抗体的潜在靶标，并包含氨基端结构域(nt)和三个细胞外环(ecl1、ecl2和ecl3)。ccr5的细胞外部分仅包含分布在四个结构域上的90个氨基酸。这些结构域中最大的结构域是在nt和ecl2处，每个约30个氨基酸(olson等人,ccr5monoclonalantibodiesforhiv-1therapy,curr.opin.hivaids,march,4(2):104-111())。该蛋白的区域对于趋化因子配体的结合、受体的功能反应以及hiv辅助受体活性至关重要(barmaniaf,pepperms(),c-cchemokinereceptortypefive(ccrs):anemergingtargetforthecontrolofhivinfection,applied&translationalgenomics2:3-16)。
趋化因子结合在许多细胞类型(包括例如白细胞、内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞、平滑肌和实质细胞)上表达的受体。趋化因子通过控制基础情况下和炎性情况下的细胞募集和活化，在白细胞生物学中发挥重要作用。此外，由于趋化因子受体在其他细胞类型上表达，因此趋化因子还具有多种其他作用，包括血管生成、组织和血管重塑、病原体消除、抗原呈递、白细胞活化和存活、慢性炎症、组织修复/治愈、纤维化、胚胎发生、肿瘤发生等。
ccr5受体的同源配体包括ccl5(rantes)、ccl3、ccl4(也分别称为mip1a和1/1)和ccl3l1(struyfs,mentenp,lenaertsjp,putw,d"haesea,declercqe,等人(2001),divergingbindingcapacitiesofnaturalld78betaisoformsofmacrophageinflammatoryprotein-lalphatotheccchemokinereceptors1,3,and5affecttheiranti-hiv-1activityandchemotacticpotenciesforneutrophilsandeosinophils,europeanjournalofimmunology31:2170-2178；miyakawat,obaruk,maedak,haradas,mitsuyah(2002),identificationofaminoacidresiduescriticalforld78beta,avariantofhumanmacrophageinflammatoryprotein-ialpha,bindingtoccr5andinhibitionofrshumanimmunodeficiencyvirustype1replication,thejournalofbiologicalchemistry227:4649-4655)。ccl5或rantes是趋化性细胞因子蛋白。struyf；slimanih,charnauxn,mbembae,saffarl,vassayr,vitac,等人(),interactionofranteswithsyndecan-1andsyndecan-4expressedbyhumanprimarymacrophages,biochemicaetbiophysicaacta1617:80-88(“slimani”)；barmaniaf,pepperms(),c-cchemokinereceptortypefive(ccrs):anemergingtargetforthecontrolofhivinfection,applied&translationalgenomics2:3-16(“barmania”)。
ccl5配体和ccr5受体复合物的形成导致受体的构象变化，其活化g蛋白的亚基，从而诱导信号传导并导致环amp(camp)、肌醇三磷酸、细胞内钙和酪氨酸激酶活化的水平改变。这些信号传导事件导致细胞极化和转录因子nf-kb的易位，从而导致吞噬能力、细胞存活和促炎基因转录的增加。一旦发生g蛋白依赖性信号传导，ccl5/ccr5受体复合物就通过内吞作用而被内化。
通过计算已经得出了ccl5与ccr5复合的完整复合物结构。据报道，ccl5的1-15残基部分被插入到ccr5结合口袋中；ccl5的1-6n端结构域被埋在ccr5的跨膜区域内；并且ccl5的7-15残基部分主要包含在ccr5的n端结构域和细胞外环中。ccl5残基ala16和arg17以及24-50残基部分的其他残基与ccr5的上部n端结构域和细胞外环界面相互作用。据进一步报道，ccl5的氨基端的完整性对于受体结合和细胞活化至关重要。此外，据报道，ccl5和hiv-1主要与差不多相同的ccr5残基相互作用，并共享相同的趋化因子受体结合口袋(参见tamamis等人,elucidatingakeyanti-hiv-1andcancer-associatedaxis:thestructureofccl5(rantes)incomplexwithccr5,scientificreports,4:5447())。还单独报道趋化因子例如ccl5配体主要通过ecl2结合ccr5受体(olson等人,ccr5monoclonalantibodiesforhiv-1therapy,curr.opin.,hivaids,march,4(2):104-111())。
2.非趋化因子ccr5细胞受体结合剂
ccr5在正常免疫功能中的确切作用尚未完全确定。但是ccr5似乎对该过程具有广泛的影响，因为它已经被描述为介导效应t细胞以及treg向许多不同靶器官的募集(boieri等人,theroleofanimalmodelsinthestudyofhematopoieticstemcelltransplantationandgvhd:ahistoricaloverview,frontiersinimmunology,august7:333)。因此，阻断趋化因子与趋化因子受体的相互作用是一种治疗策略，其已使用动物模型进行了测试。已显示在agvhd小鼠模型中施用抗cxcr3或抗cx3cl1抗体可减少胃肠道agvhd。然而，靶向ccr5给出了相反的结果，因为该趋化因子被认为也参与了treg向周围组织的募集(同上)。
存在抑制、中断、阻断、改变或修饰ccr5/ccl5受体/配体轴(即，ccr5受体/ccl5配体轴)的各种化合物。这些化合物中的许多化合物已经被开发出来用于治疗hiv-1，其也与ccr5受体结合并且已知与ccl5共有一些结合共性。此类化合物包括细胞外或细胞跨膜ccr5结合剂(例如pro140(细胞外)和马拉韦罗(跨膜))以及其他化合物(例如维立韦罗、阿拉韦罗、sch-c和tak-779)以及抗体(例如pa14、2d7、roab13、roab14、45523等)。
还已显示ccr5信号传导的抑制具有免疫抑制作用。例如，已经进行了体外研究以研究马拉韦罗对活化的人t细胞上的ccr5受体的阻断对潜在免疫学机制的影响。发现通过马拉维罗克阻断ccr5不仅可以阻断由ccl5和ccl2诱导的ccr5和ccr2内化过程，而且还可以分别抑制t细胞朝向其同源配体的趋化活性。此外，用高剂量的马拉韦罗阻断ccr5趋向于降低tnf-α和ifn-γ的产生。还注意到马拉韦罗对ccr5的作用是暂时的和可逆的(yuan等人,invitroimmunologicaleffectsofblockingccr5ontcells,inflammation,38(2):902-910()；参见arberas等人,invitroeffectsoftheccr5inhibitormaraviroconhumantcellfunction,j.antimicrob.chemother.,68(3):577-586())。
还发现最有效的抗病毒抗ccr5单克隆抗体(包括例如pro140)单独或与nt残基组合地结合el2中的ccr5受体氨基酸残基。还已经确定抗ccr5单克隆抗体的ccr5受体结合位点与小分子ccr5拮抗剂的位点不同。即，可用的小分子ccr5拮抗剂(例如马拉韦罗)结合由跨膜螺旋形成的疏水腔，即不结合细胞外nt或环区域。第七个跨膜区中的氨基酸残基e283已被明确鉴定为小分子相互作用的主要位点，并且已发现马拉韦罗和维立韦罗可以结合相同的ccr5受体氨基酸组(olson等人,ccr5monoclonalantibodiesforhiv-1therapy,curr.opin.hivaids,march,4(2):104-111())。然而，据报道，ccl5配体和马拉韦罗通过共享两个受体位点(nt和ecl2)停靠在ccr5受体上，并且合成的ccl5衍生肽也可用于阻断ccr5受体(secchi等人,combinationoftheccl5-derivedpeptider4.0withdifferenthiv-1blockersrevealswidetargetcompatibilityandsynergiccobindingtoccr5,antimicrobagentschemother.,58(10):6215-6223())。
pro140与ccr5受体结合，并被开发为hiv的进入抑制剂，已经作为hiv治疗研究实体完成了七项临床试验，并且目前正在进行两项fda批准的hiv感染2b/3期临床试验。具体而言，pro140是竞争性的ccr5抑制剂，其与ccr5的第二个外部环具有结合反应性(olsonwc,rabutgee,nagashimaka,trandnh,anselmadj,monardsp,等人(1999),differentialinhibitionofhumanimmunodeficiencyvirustype1fusion,gp120binding,andcc-chemokineactivitybymonoclonalantibodiestoccrs,journalofvirology73:4145-4155(“olson”))。重要的是，pro140与ccr5的结合不会导致ccl5配体(rantes)激动剂活性，并且可能会抑制这种活性(通过camp或酪氨酸激酶活性的下游触发来评估)，但似乎不会抑制由ccr5暴露于rantes导致的某些其他下游效应(参见pct/us/039016)。
在一个实施方案中，本公开内容提供了pro140抗体或其结合片段的用途。pro140是人源化的单克隆抗体，其描述于美国专利号7,122,185和8,821,877，其通过引用整体并入本文。pro140是鼠单克隆抗体pa14的人源化形式，其针对cd4+ccr5+细胞生成。olson等人,differentialinhibitionofhumanimmunodeficiencyvirustype1fusion,gp120bindingandcc-chemokineactivityofmonoclonalantibodiestoccr5,j.virol.,73:4145-4155.(1999)。pro140与细胞表面上表达的ccr5结合，并在体外和在hiv-1感染的hu-pbl-scid小鼠模型中以不影响ccr5趋化因子受体活性的浓度有效抑制hiv-1的进入和复制(olson等人,differentialinhibitionofhumanimmunodeficiencyvirustype1fusion,gp120bindingandcc-chemokineactivityofmonoclonalantibodiestoccr5,j.virol.,73:4145-4155.(1999)；trkola等人,potent,broad-spectruminhibitionofhumanimmunodeficiencyvirustype1bytheccr5monoclonalantibodypro140,j.virol.,75:579-588(2001))。
编码人源化pro140抗体的重链和轻链的核酸已在atcc保藏。具体而言，根据并符合布达佩斯条约要求，分别将命名为pvk-hupro140、pvg4-hupro140(mutb+d+i)和pvg4-hupro140hg2的质粒于2002年2月22日保藏在atcc,manassas,va.,u.s.a.8，atcc保藏号分别为pta4097、pta4099和pta4098。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括施用被命名为pro140的人源化抗体或与pro140竞争结合ccr5受体的抗体，其中pro140包含(i)两条轻链，每条轻链包含被命名为pvk：hupro140-vk的质粒(atcc保藏号pta-4097)的表达产物，和(ii)两条重链，每条重链包含被命名为pvg4：hupro140hg2-vh的质粒(atcc保藏号pta-4098)或被命名为pvg4：hupro140(mutb+d+i)-vh的质粒(atcc保藏号pta-4099)的表达产物。在另一个实施方案中，pro140是人源化或人抗体，其结合与抗体pro140所结合的相同表位。在另一个实施方案中，单克隆抗体是被命名为pro140的人源化抗体。
ccr5是白细胞表面的一种蛋白质，其用作趋化因子的受体。因此，它是大多数免疫反应中的重要组成部分。以这种方式，t细胞被吸引至特定的组织和器官靶标。ccr5蛋白属于完整膜蛋白的β趋化因子受体家族。它是一种g蛋白偶联受体，其用作c-c趋化因子组中的趋化因子受体。
ccr5的同源配体包括ccl3、ccl4(也分别称为mip1α和1β)和ccl3l1。ccr5还与ccl5(一种趋化性细胞因子蛋白，也称为rantes)相互作用。
ccr5主要在t细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞和小胶质细胞上表达。尽管ccr5在正常免疫功能中的确切作用尚未完全确定，但它可能在针对感染的炎性反应中起作用。该蛋白的区域对于趋化因子配体结合、受体的功能反应以及hiv共受体活性也至关重要17。
pro140被开发为hiv的进入抑制剂，并且其已完成了七项人临床试验以确定其对hiv感染的治疗作用，并且其目前正在两项fda批准的针对hiv患者的2b/3期临床试验中。其还在接受hsct的急性骨髓性白血病(aml)和骨髓增生异常综合征(mds)患者中的针对急性gvhd的2期临床试验中进行评估。
pro140是ccr5的竞争性抑制剂，其对ccr5的第二个外部环具有结合反应性。重要的是，pro140与ccr5的结合不会导致激动剂活性，如通过camp或酪氨酸激酶活性的下游触发评估的。该特性使pro140与mvr(一种具有激动剂活性的小分子ccr5抑制剂)区别开来，mvr是一种变构拮抗剂，其可防止ccl3、ccl4和ccl5配体信号传导。
pro140是一种igg4完全人源化单克隆抗体，其已被开发为hiv的进入抑制剂。它与ccr518的第二个外部环结合，并且是hiv与ccr5的结合的竞争性抑制剂。通过流式细胞术分析确定，pro140与表达ccr5的cd4+t细胞、cd8+t细胞、t调节细胞、nk细胞、nkt细胞和人外周血单核细胞结合。pro140与ccr5的结合不会触发激动剂活性，如通过camp或酪氨酸激酶活性的下游活化评估的。
3.移植人造血系统的转基因非人动物的产生
造血干细胞可源自例如骨髓、外周血和脐带血。
通常，两个基本方案描述了生成人源化小鼠的方法：基本方案1处理造血干细胞(hsc)移植(人scid繁殖细胞；hu-src)，而基本方案2涉及人外周血单核细胞(pbmc)(人外周血白细胞；hu-pbl)的移植(pearson等人,creationof“humanized”micetostudyhumanimmunity,curr.protoc.immunol.may；chapter:unit–15.21,doi:10.1002/0471142735.im1521s81)。
hsc移植模型(hu-src-scid)的主要优点是，人t和b细胞从小鼠中移植的人干细胞发育而来，在分化为t和b细胞的过程中经历了负选择，并因此可以耐受小鼠宿主。该模型允许研究造血谱系的发育、免疫系统发育的机制以及由幼稚免疫系统产生初级免疫反应(pearson等人,creationof“humanized”micetostudyhumanimmunity,curr.protoc.immunol.may；chapter:unit–15.21,doi:10.1002/0471142735.im1521s81)。
pbmc模型(hu-pbl-scid)利用从外周全血或脾脏分离的白细胞，并且由于转移的淋巴细胞是功能成熟的，其可以快速分析人免疫功能。该模型最适合于研究患有免疫系统疾病的患者的免疫功能、分析抗原召回反应、研究同种异体移植排斥以及其他短期(约4周)实验(pearson等人,creationof“humanized”micetostudyhumanimmunity,curr.protoc.immunol.may；chapter:unit–15.21,doi:10.1002/0471142735.im1521s81)。
在许多情况下，移植前的全身照射(tbi)已成为在异种移植动物模型中实现高水平人细胞移植的标准预处理方案，因为它会触发对于造血干细胞移植、增殖和存活至关重要的干细胞因子(scf)的分泌。但是，还探索了其他标准预处理方案，包括在移植或施用化疗药物如bulsulfan之前耗尽小鼠巨噬细胞或粒细胞(kang等人,humanizingnod/scid/il-2rγnull(nsg)miceusingbusulfanandretro-orbitalinjectionofumbilicalcordblood-derivedcd34+cells,bloodresearch,mar；51(1):31–36；pearson,)。改善移植的其他预处理方案的努力包括例如用人细胞因子处理移植的小鼠或与间充质干细胞共移植(pearson，)。
本发明集中于用于通过异种移植产生嵌合体的hsc移植模型。因此，该模型包括在通常免疫缺陷的动物中人细胞或组织的施用。用于产生人免疫系统的优秀宿主动物是小鼠系，其在适应性免疫中具有多个缺陷，例如rag2-/-/у-/-、bnx或nod/scidb2mnull。
在一个优选的实施方案中，本发明使用nod.cg-prkdcscidil2rγtm1wjl/szj(nod-scidil2rγnull,nsg)小鼠。
nod/scid(非肥胖/糖尿病/重度联合免疫缺陷)小鼠的不同品系用作人源化的标准模型。它们的主要特征是具有以下免疫缺陷特性：b淋巴细胞和t淋巴细胞完全丧失、nk细胞数量减少、抗原呈递细胞的分化和功能缺陷以及缺乏循环补体。这些小鼠比野生型对电离辐射更敏感，并且在dna修复系统中有缺陷。移植人造血干细胞、分化的造血细胞以及淋巴器官后，可能会在免疫缺陷动物中形成人个体造血细胞系或几个造血细胞系。
在此，本发明人发现，通过使用hsc移植模型用于通过异种移植产生嵌合体，向免疫缺陷小鼠施用抗ccr5结合剂在移植成功、动物健康和动物寿命方面提供了改善的移植。具体地，在hsc移植后，将人源化单克隆抗体pro140施用给nod-scidil2rγnullnsg小鼠。令人惊讶地，施用pro140的小鼠表现出显著改善的健康(例如，体重维持和外观)和寿命(例如，在异种移植动物模型中70天后100％存活)，同时还证明了成功的移植。
4.包括移植有人造血系统的转基因非人动物的动物模型研究
移植物抗宿主疾病(gvhd)是用于研究移植有人造血系统的转基因非人动物(此处为小鼠)的一种示例性人疾病。用于研究gvhd的小鼠模型的改变继续为一般人免疫功能特别是在这种疾病病理学中的极端复杂性提供见解。
由于迫切需要新的治疗方法来治疗gvhd，因此用于研究该疾病的人源化小鼠模型以及对这些模型的相关修改，提供了有关对小鼠品系、小鼠模型和相关方法的修改是否以及如何影响人源化小鼠免疫系统、移植和相关的人治疗选择的宝贵见解。
gvhd在这里特别引起人们对免疫细胞运输的关注，本发明人将注意力集中在调节ccr5细胞受体的结合上，因为gvhd的病理生理包括将淋巴细胞迁移到其靶组织，这是关键步骤之一。即，应理解趋化因子和趋化因子受体(例如ccr5细胞受体)在该过程中特异性地引导t细胞。
因此，本发明提供了改善的非人动物模型和方法，以解决趋化因子和趋化因子受体在免疫受损小鼠中移植更多人免疫系统以及维持动物健康和寿命中的作用。
实施例
这些实施例描述了在移植物抗宿主疾病(gvhd)小鼠模型中实现的本发明。如本申请中其他地方所述，gvhd是造血干细胞移植后的普遍且潜在的致命并发症。异种gvhd的人源化小鼠模型是评估体内人免疫反应的重要工具。
值得注意的是，gvhd可以在例如同种异体造血干细胞移植(hsct)(其在各种恶性和非恶性血液病中具有重要作用)之后发展。供体来源的t细胞对人白细胞抗原(hla)差异的同种异体反应可导致潜在威胁生命的gvhd。除淋巴消耗策略外，还需要新的疗法来解决gvhd，因为淋巴消耗策略这种非特异性方法使患者处于感染或癌症复发等并发症的风险中(champlinr,how,gajewskij,feigs,burnisonm,holleyg,等人(1990),selectivedepletionofcd8+tlymphocytesforpreventionofgraft-versus-hostdiseaseafterallogeneicbonemarrowtransplantation,blood76:418-423；gallardod,garcia-lopezj,suredaa,canalsc,ferrac,cancelasja,等人(1997),low-dosedonorcd8+cellsinthecd4-depletedgraftpreventallogeneicmarrowgraftrejectionandseveregraft-versus-hostdiseaseforchronicmyeloidleukemiapatientsinfirstchronicphase,bonemarrowtransplant20:945-952)。
例如，nsg小鼠的hu-src-scid模型中的gvhd依赖于人免疫细胞对小鼠的主要组织相容性i类和ii类抗原(mhc)的异种反应性，类似于hla不匹配的hsct，其中供体同种异体反应是通过识别受体mhc抗原起始的(kingma,covassinl,brehmma,rackiw,pearsont,leifj,等人()humanperipheralbloodleucocytenon-obesediabetic-severecombinedimmunodeficiencyinterleukin-2receptorgammachaingenemousemodelofxenogeneicgraft-versus-host-likediseaseandtheroleofhostmajorhistocompatibilitycomplex.clinexpimmunol230157:104-118；reddyp,ferrarajl()immunobiologyofacutegraft-versus-hostdisease.bloodrev17:187-194)。特定器官在hsct受体的急性gvhd中的参与提示免疫细胞运输对这种疾病的病理生理至关重要。
在此，本发明人评估了pro140，它是靶向趋化因子受体5型c-c趋化因子受体(ccr5或cd195)(其是异种gvhd发生的抑制剂)的人源化单克隆抗体。先前已证明使用ccr5拮抗剂抑制淋巴细胞运输可降低经受hsct的患者的急性gvhd的影响(reshefr,lugersm,hexnereo,lorenaw,freynv,goldsteinsc,等人(),inhibitionoflymphocytetraffickingusingaccr5antagonist-finalresultofaphasei/iistudy,blood118:1011；reshefr,manganjk,lugersm,lorenaw,hexnereo,freyny,等人(),extendedccr5blockadeingraft-versus-hostdiseaseprophylaxis-aphaseiistudy,blood124:2491；和moyrh,huffmanap,richmanlp,crisallil,wangxk,hoxieja,等人(),clinicalandimmunologicimpactofccr5blockadeingraft-versus-hostdiseaseprophylaxis,blood129:906-916)。
如下文讨论的，在注射造血干细胞后，向nsg小鼠施用pro140导致小鼠健康和存活率的引人注目的显著和令人惊讶的提高，这是阳性gvhd治疗效果，并且在70天后人cd45+细胞移植水平在外周血中大于约75％和在骨髓中大于约65％。
在这里，用人骨髓细胞移植nod-scidil-2rynull小鼠(nsg)，以评估免疫细胞运输在急性gvhd产生中的作用。pro140用于评估其对骨髓细胞移植和急性gvhd调节的影响。通过评估经处理的小鼠和对照小鼠中的人cd45+细胞和cd3+t细胞来评估移植动力学。在外周血、脾脏和骨髓中，pro140处理的小鼠在整个70天的研究期内均未显示gvhd的体征，并且体重增加，直到在70天时处死以进行流式细胞术分析为止。对照小鼠在25天后开始体重减小，表现出经典的gvhd体征(皮毛绉起、嗜睡等)，并全部需要在第54天处死。在整个50天比较期内，两组小鼠的外周血中人cd45+细胞的百分比均增加，但在第50天时在pro140处理的小鼠中百分比显著较低。重要的是，在第70天时在对照组和pro140处理的小鼠中，在骨髓中检测到的人cd45+细胞没有差异。通过掩盖ccr5趋化因子受体，pro140消除了这种人源化小鼠模型中的急性gvhd，而没有明显改变移植。
动物研究：
动物实验是根据道德标准并根据国家和国际准则进行的，并由clevelandclinicinstitutionalanimalcareandusecommittee批准。雄性nsg小鼠nod.cg-prkdcscidil2rγtm1wjl/szj(nod-scidil2rγnull,nsg)小鼠获自jacksonlaboratory(barharbor,me,usa)和使用6-8周龄的无胸腺裸鼠(nu/nu)(taconic，hudson，ny)。将小鼠饲养在具有微型隔离器盖、经高压灭菌的床和经hepa过滤空气的笼子中的隔离设施中，并保持在12:12的光/暗循环、受控的温度和湿度下。动物可以自由食用经高压灭菌的标准食物和过滤水。预处理方案：小鼠通过137cs源(shepherd,losangelesca)接受2.25gy的全身照射。
骨髓移植和异种gvhd的产生：
γ射线照射后(24小时后)，用人bm细胞移植小鼠。通过clevelandclinicbmt程序使用的反冲洗滤袋获得去识别化的人供体细胞。通过ficoll-hypaque梯度离心纯化新鲜的(非冷冻的)白细胞，在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中洗涤，评估存活力(vicell，beckmancoulter，brea，ca)。将人bm白细胞注射入尾侧静脉(107个细胞/小鼠)。每周两次监测小鼠的gvhd的临床症状(体位、活动、皮毛和皮肤状况、体重减轻)。每周使用收集在k-edta管中的隐静脉静脉穿刺(50ml)监测外周血的移植情况。表现出20％体重减轻且具有gvhd临床症状的小鼠被认为已达到实验终点，并通过受控梯度的co2吸入进行安乐死。
pro140处理：
将小鼠按体重随机分为对照组和处理组，每组8只动物。每周两次腹膜内(i.p.)以两个剂量(2.0或0.2mg/只小鼠)施用pro140。2.0mg的剂量被计算为20,21近似于正在进行的cytodyn赞助的急性gvhd的2期人临床试验中使用的剂量。已显示，在hiv阳性患者中单次施用此剂量可将hiv负荷减少超过十倍。0.2mg剂量用作活动的下限，因为它并未显著降低hiv阳性患者的hiv负荷。对照小鼠接受正常人igg(sigmaaldrich,st.louis，mopro140剂量使用来自freireich等人,quantitativecomparisonoftoxicityofanticanceragentsinmouse,rat,hamster,dog,monkey,andman,cancerchemotherrep.,50:219-44(1966)；和nationalcancerinstitutedevelopmentaltherapeuticsprogramhttp://dtp.nci.nih.gov的“各种物种的代表性表面积重量比(km)”计算。pro140的人剂量＝5.8mg/kgx12(人与小鼠转换因子)＝69.6mg/kg小鼠剂量；平均小鼠＝0.025kg，因此剂量为69.6mg/kgx0.025kg＝1.74mg(小鼠单剂量)将其四舍五入至2.0mg，并称为“高剂量”。还测试了“低剂量”(0.2mg)。从人血清中提取的igg(>95％sds-page，sigma，i4506)用作非特异性对照抗体。
流式细胞术：
通过流式细胞术分析外周血(pb)、骨髓(bm)和脾(spl)样品。将脾细胞通过40mm滤网。将红细胞用氯化铵裂解，细胞用pbs洗涤两次，并在pbs/0.5mmedta/0.5％bsa中于4℃用以下抗体染色15分钟：抗人cd3-fitc(克隆ucht1，im1281u)，抗人cd45-pc7(克隆j.33，im3548u)，抗小鼠cd45.1-fitc(克隆a20)，ebioscience(thermofisher)和抗人cd56-pe(克隆5.1h11)，biolegend。将countbright珠子(thermofisher)添加(50μl)到样品中以确定绝对细胞数。对于人cd45、小鼠cd45和人cd3，结果表示为总事件的百分比，并且还表示为绝对累积细胞数。对于人cd56，结果表示为总事件的百分比，并且还表示为细胞/μl外周血。在cytomicsfc500流量分析仪(beckman/coulter)上分析样品。
统计分析：
使用graphpadprism(graphpadsoftware,lajolla,ca)进行统计分析。所有方差量度均表示为平均值的标准误差(sem)。存活率通过kaplan-meier方法和mantel-cox对数秩检验进行分析。对于其他数据，使用了双侧未配对的studentst检验。
结果
在异种nsg小鼠模型中评估了pro140对急性gvhd发生的影响。使用两个剂量的pro140或对照igg(腹膜内2mg和0.2mg，每周两次)，其中高剂量计算为近似于正在进行的急性gvhd的2期临床试验中使用的剂量。根据需要，使用不同的bm供体连续进行高剂量和低剂量研究。在两个实验中都确定了对msg小鼠中gvhd的特征的评估，包括观察到的体征(起绉的毛皮、嗜睡、严重的驼背)、测得的体重减轻和死亡。在高剂量研究中，从用56岁供体的bm移植后的第25天开始，在对照小鼠中观察到gvhd的体征，包括起绉的毛皮、嗜睡、驼背和体重减轻。对照组的体重减轻持续存在，并且与pro处理组显著不同(p<0.01)，pro处理组没有出现gvhd的体征，并且体重持续增加(图1)。当在kaplan-meier图中评估存活率时(图2)，结果具有统计学意义(p<0.01)，其中所有对照组动物在56天后死亡，并且所有pro140处理的动物在第75天(此时处死动物用于移植的流式细胞术分析)存活。
图1.pro140对nsg小鼠中的异种gvhd的影响-体重；高剂量。
在第(-1)天，雄性nsg小鼠接受2.25cgy的全身照射。在第0天，小鼠经尾静脉静脉内接受107个新鲜的ficoll-hypaque纯化的正常人骨髓细胞(56岁男性供体)。对照小鼠接受正常人igg。如所见的，对照小鼠在移植后约20天开始体重减轻，并且该体重减轻从约20天的约23.4gm的高点持续到约52天后的约21.2gm。同时，在pro140处理组中的小鼠在相同的时间段内体重增加，从约20天的约23.0gm增至约52天的约23.6gm。
图2.pro140对nsg小鼠中的异种-gvhd的影响-存活率；高剂量。
在第(-1)天，雄性nsg小鼠接受2.25cgy的全身照射。在第0天，小鼠经尾静脉静脉内接受107个新鲜的ficoll-hypaque纯化的正常人骨髓细胞(56岁男性供体)。对照小鼠接受正常人igg。如图2所示，所有对照动物在56天时死亡，所有pro140处理的动物在70天时(此时被处死用于移植的流式细胞术分析)存活。
图3和图4显示了在体重和存活率方面，pro140在0.2mg低剂量下对nsg小鼠中的异种gvhd的影响。在第(-1)天，雄性nsg小鼠接受2.25cgy的全身照射。在第0天，小鼠经尾静脉静脉内接受107个新鲜的ficoll-hypaque纯化的正常人骨髓细胞(雄性供体)。对照小鼠接受正常人igg。在第1天，小鼠腹膜内接受0.2mgpro140。n＝8只小鼠/组。
根据需要，使用不同的bm供体连续进行高剂量和低剂量研究。在两组实验中，使用了不同年龄的bm供体。与公布的数据一致，当比较死亡时间时低剂量队列中使用的年轻供体导致更具侵略性的gvhd(31天相对于54天，图2、4)(rezvaniar,storerbe,guthrieka,等人()impactofdonorageonoutcomeafterallogeneichematopoieticcelltransplantation,biolbloodmarrowtransplant21(1):105-112))。这项研究中没有独立评估pro140的较低剂量相对于更具攻击性的bm分别对体重减轻的程度和kaplan-meier图的影响程度。
在使用十分之一剂量的低剂量研究中，从在用来自26岁供体的bm移植后的第20天开始，在对照小鼠中观察到gvhd的体征，包括起绉的皮毛、嗜睡和驼背，此后不久开始体重减轻。对照组的体重减轻持续进行，并且与pro140处理组的体重显著不同(p<0.05)，pro140处理组在第25-28天开始显示gvhd的体征和体重减轻(图3)。当在kaplan-meier图中评估存活率时(图4)，结果具有统计学意义(p<0.05)，所有对照动物在31天时死亡，所有pro140处理的动物在54天时死亡。高剂量和低剂量研究的对照组动物的存活时间(54天相对于31天)表明，年轻的bm供体产生了更具侵略性的gvhd。
图5a、5b、5c和5d显示了pro140对nsg小鼠中异种gvhd的作用。每周两次腹膜内给药的pro140的外周血中移植的人细胞的流式细胞术分析从第1天开始。从隐静脉在指定的日期抽取外周血(100ul)到肝素化试管中。每组有8只动物，并且实验进行了两次。左图代表高剂量(2.0mg)实验(图5a和图5c)，右图代表低剂量(0.2mg)实验(图5b和图5d)。
图5a、5b、5c和5d显示了pro140对nsg小鼠中异种gvhd的作用。每周两次腹膜内给药的pro140的外周血中移植的人细胞的流式细胞术分析从第1天开始。从隐静脉在指定的日期抽取外周血(100ul)到肝素化试管中。每组有8只动物，并且实验进行了两次。左图代表高剂量(2.0mg)实验(图5a和图5c)，右图代表低剂量(0.2mg)实验(图5b和图5d)。
使用对人cd45+细胞(所有分化的造血细胞)具有特异性的抗体，通过流式细胞术对外周循环的移植的动力学进行分析，结果显示在开始的30+天内移植相似(图5a、5b、5c和5d)，然后差异出现在第50天时pro140动物中在cd45+隔室中检测到的细胞明显减少(62％对于43％，p＝0.034)。这是在对照动物表现出严重的gvhd的时候。预期pro140减少炎症，导致在50天时人cd45+细胞计数降低。在低剂量组中，从第15天开始移植出现差异。尽管在低剂量pro140处理的小鼠中大约20天后，也达到了相同百分比的cd45+移植(p<.01)。通过确定该时间范围内外周循环中细胞的绝对数量，可以支持该观察结果(图5c和图5d)。
图6描述了使用针对人(hucd45)和小鼠(mcd45)cd45的抗体将人bm移植到nsg小鼠中。这些抗体用于检测移植有人骨髓细胞的pro140处理小鼠的骨髓(bm)和外周血(pb)中的移植百分比。
在第54天的高剂量队列中，使用对cd45(识别所有分化的造血细胞)和cd3(成熟t细胞)具有特异性的抗体评估了外周血和骨髓中的移植分析。在pb中，与pro140处理的动物相比，对照中的成熟t细胞的移植更多(63.2％相对于49.8％，图6，pb图，e2象限)。在bm隔室中，对照动物表现出比pro140动物更多的成熟t细胞(40.2％相对于26.4％，图6，bm图e2象限)。这发生在对照动物经历严重的gvhd时，而pro140动物体重增加且没有gvhd的体征。每个象限中的绝对细胞数的测定支持了这一观察结果(图6)。
在安乐死时(第75天)，通过流式细胞术使用对人和小鼠cd45特异的抗体，对高剂量队列中的pb和bm进行移植分析。人供体bm对人cd45呈93.7％阳性，并且移植前的小鼠受体对小鼠cd45呈88.6％阳性(图7，分别左上图和右上图)。移植后第75天，小鼠中的pb对人cd45为76.1％阳性，而bm对人cd45为68.2％阳性(图7，分别左下图和右下图)。来自pb和bm的小鼠造血细胞分别为14.9％和28％。这与人或小鼠来源的细胞的绝对数量的测定一致(图7)。
考虑了移植可能会在超过70天后继续完成，即，以获得具有人源化的免疫系统的小鼠，其小鼠骨髓、小鼠脾脏和小鼠外周血细胞中的一种或多种中的移植水平大于或等于约60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，如通过移植的人细胞的流式细胞术分析测量的。
在第54天在外周血和骨髓中通过流式细胞术用对cd45(所有分化的造血细胞)和cd3(成熟t细胞)具有特异性的抗体评估的移植的进一步分析表明，对照动物的骨髓中的成熟的t细胞数量比pro140动物多(40.2％相对于26.4％，图6)。随着对照(gvhd动物，图6，pro140窗口e3)中新细胞群的出现，外周血中流式分析的模式也发生了变化。考虑了pro140减轻pro140处理的动物的炎症，导致较低的t细胞成熟率。在安乐死时，用抗体对外周血、脾脏和骨髓细胞进行了额外的流式分析(图8a和图8b)。对照动物和pro140处理的动物在骨髓中没有差异，表明同等的移植。这表明pro140不会抑制移植。与pro140处理的动物相比，对照组(晚期gvhd)的脾脏(58％相对于41％)和外周血(64％相对于45％)的cd45+细胞显著更多(p<0.05)。
这种差异可能归因于此时对照动物中正在进行的晚期gvhd。细胞的绝对数量的测定与这些观察结果一致(图8a和图8b)。
讨论
本发明提供了对免疫调节细胞受体如ccr5细胞受体的抑制或阻断，以促进实验室动物中人免疫系统的改善或完全重建。本发明使得具有基本上或完全重建的人源化的免疫系统的实验动物成为可能，相对于不接受ccr5结合剂的实验动物而言，其具有改善的健康和寿命。因此，本发明总体上涉及ccr5结合剂和改进的动物模型、组合物，以及产生和使用移植了人造血系统的转基因非人动物的方法。
在此，本发明人使用具有靶向的il-2rynull突变的免疫缺陷小鼠即nsg小鼠(其已被建立为hsct移植的选择模型，用于研究gvhd的治疗方法)举例说明了本发明。该模型允许评估有效的ccr5抑制剂pro140对免疫细胞运输在gvhd发病机理中的作用的作用。然而，重要的是，发现pro140不仅是该模型系统中急性gvhd的强效抑制剂(通过物理体征、体重减轻和存活曲线衡量的)，而且还显著改善了小鼠的整体健康状况和寿命。因此，本发明人发现，用pro140处理免疫受损的动物并移植后，产生了用于在具有基本上或可能完全重建的人免疫系统的健康长寿小鼠中研究人免疫功能的改良的小鼠模型(图1和图2)。
这种方法的原理基于ccr5的作用，ccr5是ccl5的g连锁蛋白受体(又名rantes)，它是参与免疫细胞运输的有效趋化因子。免疫细胞运输被认为对于急性gvhd的发展至关重要，其涉及皮肤和器官(包括脾脏、小肠和肝脏)，以及一定程度上涉及骨髓和胸腺。我们没有对这些研究中的器官涉及进行组织学评估，因此不能将pro140的作用归因于免疫细胞运输的调节。我们计划在后续的机理研究中这样做。先前的鼠和人临床试验表明，使用小分子抑制剂mvr阻断ccr5可以降低急性gvhd的临床影响，而不会显著影响移植。我们先前已经表明pro140是hiv与ccr5的结合的竞争性抑制剂，而不会触发激动剂活性、刺激下游活化标志物或camp和酪氨酸激酶。后者的这些特性使pro140与mvr区别开来。
ccr5及其天然配体也与移植器官排斥有关。淋巴细胞向gvhd中涉及的组织的募集依赖于ccr5，并且ccr5抗体抑制剂可减少鼠模型中cd8+细胞向靶器官的迁移，从而导致针对gvhd的保护。小鼠中ccr5基因的缺失导致在保护gvhd方面产生矛盾的结果。在人中，某些ccr5多态性对gvhd具有保护作用，并且与同种异体骨髓移植患者的存活相关。
本研究回答了一个重要问题，即在尝试消除gvhd时使用pro140是否会对移植产生影响。已发现在移植的早期阶段在外周血中和在移植后期在外周血和骨髓中均无此影响。但是，在50天时，在发生严重gvhd的动物中确实观察到比pro140动物显著更多的cd45+细胞。与pro140处理的且无gvhd体征的动物相比，gvhd动物(对照组)在安乐死时的外周血(64％相对于46％)和脾脏(59％相对于41％)中的cd45+细胞更多。此时，骨髓中的cd45+细胞没有差异，这表明pro140不会对移植造成负面影响。在第54天，当对照动物需要处死(严重的gvhd)时，与pro140处理的动物相比，对照(gvhd动物)的骨髓中还有更多的成熟t细胞(cd3+)。
我们计划评估对pro140处理的持续依赖性、克隆缺失和/或调节性细胞活性的贡献以及nk细胞的潜在作用和其他尚未确定的机制所观察到的功能耐受性。在以后的研究中，我们还将评估用pro140处理的移植小鼠中人免疫细胞的功能方面。应该指出的是，此处我们使用了严重免疫受损的小鼠模型来生产异种gvhd。我们计划在以后的实验中评估同种异体gvhd小鼠模型中的pro140。当骨髓干细胞移植用于血细胞恶性肿瘤(如aml)患者时，这是一个重要的考虑因素。移植物抗癌(gvl)反应通常与gvhd反应相关。在未来的其他实验中，我们计划评估在pro140处理期间gvhd反应降低或消除的动物中的gvl反应。
综上，这些数据表明，在该模型系统中，移植细胞上的ccr5受体对于急性gvhd的发展至关重要，并且阻止该受体识别ccr家族中的趋化因子是减轻急性gvhd(不限于此)的可行方法。此外，在小鼠健康和寿命方面以及在可能的基本或完全的人造血移植方面，在移植小鼠中使用抗ccr5结合剂所获得的显著结果产生了用于人免疫研究的进一步改良的小鼠模型。由于nsg模型系统已被广泛接受为人同种异体gvhd的可靠模型，因此我们认为pro140在解决经受干细胞移植的aml和mdm患者中的急性gvhd的研究方法中占有一席之地，并有可能用于研究人免疫功能的新型小鼠模型。
可以将上述各种实施方案组合以提供其他实施方案。本说明书中提及和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、他国专利、他国专利申请和非专利出版物(包括美国临时专利申请号62/504,753和62/585,974)通过引用整体并入本文。如果需要采用各种专利、申请和出版物的概念以提供其他实施方案，则可以修改实施方案的各方面。
可以根据以上详细描述对实施方案进行这些和其他改变。通常，在以下权利要求书中，所使用的术语不应解释为将权利要求限制为说明书和权利要求书中公开的特定实施方案，而应解释为包括所有可能的实施方案以及这样的权利要求书所包含的等同物的全部范围。因此，权利要求书不受本公开内容的限制。
技术特征：
1.一种非人转基因动物，其包含人源化的免疫系统和抗ccr5细胞受体结合剂。
2.根据权利要求1所述的动物，其中动物免疫系统大于移植的约60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，如外周血或骨髓之一中的人cd4+细胞计数所证实的。
3.根据权利要求1所述的动物，其中动物免疫系统大于移植的约90％，如外周血或骨髓之一中的人cd4+细胞计数所证实的。
4.根据权利要求1所述的动物，其中动物免疫系统大于移植的约98％，如外周血或骨髓之一中的人cd4+细胞计数所证实的。
5.根据权利要求1所述的动物，其中动物免疫系统没有小鼠免疫细胞，取而代之的是人细胞。
6.根据权利要求1所述的动物，其中动物是nsg小鼠。
7.根据权利要求1所述的动物，其中抗ccr5细胞受体结合剂是单克隆抗体、蛋白质或其片段。
8.根据权利要求7所述的动物，其中单克隆抗体是pro140或其片段或缀合物。
9.根据权利要求6所述的动物，其中小鼠在70天后在外周血中具有大于约75％的人cd45+细胞移植水平。
10.根据权利要求6所述的动物，其中小鼠在70天后在骨髓中具有大于约65％的人cd45+细胞移植水平。
11.根据权利要求1所述的动物，其中动物在移植后基本上保持体重或增加体重。
12.根据权利要求1所述的动物，其中动物在移植后没有表现出与移植物抗宿主病相关的身体症状。
13.根据权利要求1所述的动物，其中动物在移植后存活至少70天。
14.根据权利要求1所述的动物，其中动物在移植后存活约两年。
15.一种生产包含人源化的免疫系统和抗ccr5细胞受体结合剂的非人转基因动物的方法。
16.根据权利要求15所述的方法，还包括：
a.选择免疫受损的转基因动物；
b.对动物施用人干细胞；和
c.对动物施用抗ccr5细胞受体结合剂。
17.根据权利要求15所述的方法，其进一步包括对转基因动物进行预处理。
18.根据权利要求15所述的方法，其中免疫受损的转基因动物是小鼠。
19.根据权利要求15所述的方法，其中免疫受损的转基因动物是nsg小鼠。
20.根据权利要求15所述的方法，其中人干细胞是造血干细胞。
21.根据权利要求15所述的方法，其中抗ccr5细胞受体结合剂是单克隆抗体、蛋白质或其片段。
22.根据权利要求21所述的方法，其中抗ccr5细胞受体结合剂是pro140或其片段或缀合物。
23.根据权利要求21所述的方法，其中动物在移植后基本维持体重或增加体重。
24.根据权利要求21所述的方法，其中动物在移植后没有表现出与移植物抗宿主病相关的身体症状。
25.根据权利要求21所述的方法，其中动物在移植后存活至少70天。
26.根据权利要求21所述的方法，其中动物在移植后存活约两年。
27.一种产生用于结合抗原的抗体的方法，包括用抗原免疫根据权利要求1-14中任一项所述的非人动物。
28.一种研究人疾病状态或状况的方法，包括使用根据权利要求1-14中任一项所述的非人动物。
技术总结
本发明提供了免疫调节细胞受体的抑制或阻断，以促进实验室动物中人免疫系统的改善或完全的重建、改善动物健康和改善动物寿命。因此，本发明总体上涉及产生和使用包含抗CCR5试剂的移植了人造血系统的转基因非人动物的组合物和方法。在各种实施方案中，本发明的移植人造血系统的转基因非人动物可用作造血和免疫细胞的生长和分化、免疫应答、疫苗和疫苗接种方案以及人病原体的体内评估和免疫介质包括人抗体的产生和收集的系统。
技术研发人员：D·R·伯格
受保护的技术使用者：西托戴恩股份有限公司
技术研发日：.05.11
技术公布日：.02.21
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