本发明属于食品蛋白质加工技术，具体涉及一种利用大豆蛋白酶解产物自组装制备纳米纤维的方法。
背景技术：
自组装是在平衡条件下，分子通过非共价键自发地连接成的结构上具有明确定义的聚集体。自组装作为一种纳米材料的构建手段，它可以将分子、纳米、微米或更大尺寸的物质自发的组装成有序结构。自组装不仅赋予蛋白质结构功能，例如良好的稳定性，而且在调节生物学功能中起到关键作用。自组装形成的纳米纤维通常具有纳米级的直径和微米级的长度，形态上表现为明显的线性纤维状。已经证实纳米纤维的产生主要取决于非共价键的相互作用，这是氢键，疏水相互作用，静电相互作用等协同作用的结果。
自组装过程产生的肽被广泛接受作为热诱导纳米纤维的构建片段。因此，预先水解的蛋白质而不是完整的蛋白质被用于制造纳米纤维。更重要的是，产生肽的水解动力学影响纳米纤维的生长动力学，因此预先的酶水解对大豆蛋白纳米纤维的形成具有重要的影响。
大豆蛋白作为一种重要的食品成分，由于其极高的营养价值，良好的功能性已广泛应用于食品研究中。长期的研究表明，大豆蛋白在ph2的酸性条件进行加热可以形成纳米纤维。并且大豆蛋白作为形成纳米纤维的优秀构建单元，可以制成具有纳米尺度的纤维状成分。大豆蛋白纳米纤维的大多数特性与当下研究热点的乳清蛋白相当，甚至在某些方面要优于乳清蛋白，因此大豆蛋白自组装纳米纤维具有广阔的研究前景。
本方法通过胰蛋白酶酶解大豆蛋白作为制备纳米纤维的构建片段，既能增加构建片段的数量，又可以产生具有优秀自组装性能的片段。与将酸性条件下的大豆蛋白直接加热的传统方法相比，新方法显著提高了纳米纤维的功能性，增加了纳米纤维的产率，所得的纳米纤维反应活性高，并可显著抑制纳米纤维的逆反应聚集导致的部分功能丧失。
技术实现要素：
本发明提供一种利用大豆蛋白酶解产物自组装制备纳米纤维的方法，达到改善纳米纤维的物化性质，标准化工艺、提高纳米纤维应用价值的目的。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：一、酶的筛选；二、大豆蛋白的酶解；三、纳米纤维的制备。
利用大豆蛋白酶解产物制备纳米纤维的方法包括以下步骤：
一、对碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶进行酶活力测定。
二、通过对碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶四种酶进行筛选，确定胰蛋白酶为后续实验用酶。
三、大豆蛋白的酶解：将2g大豆蛋白溶于50ml去离子水中，磁力搅拌2h，之后放入4℃冰箱中水化过夜。将0.02g胰蛋白酶(1:100)加入到大豆蛋白溶液中，将溶液ph值调节至7，在37℃的水浴锅中进行酶解反应，反应时间18min、40min，控制溶液的水解度为1％、3％。酶解反应结束后，将酶解液置于沸水浴中10min，以终止酶解反应。
四、将酶解液冷却至室温，在7500rpm下离心15min，取上清液备用。
五、纳米纤维的制备：使用nacl溶液将上清液的浓度稀释至1％、3％(w/v)通过bca法测定上清液的蛋白含量，此时溶液中nacl的最终浓度为20mm，使用2mol/l和0.1mol/l的hcl将溶液的ph值精确调至2，之后将溶液置于85℃的水浴中加热8h，反应结束后将溶液置于冰浴中以停止反应，得到大豆蛋白自组装纳米纤维。
具体实施方式：
实施例1纳米纤维的制备
一、对碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶进行酶活力测定。
二、通过对碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶四种酶进行筛选，确定胰蛋白酶为后续实验用酶。
三、大豆蛋白的酶解：将2g大豆蛋白溶于50ml去离子水中，磁力搅拌2h，之后放入4℃冰箱中水化过夜。将0.02g胰蛋白酶(1:100)加入到大豆蛋白溶液中，将溶液ph值调节至7，在37℃的水浴锅中进行酶解反应，反应18min。控制溶液的水解度为1％。酶解反应结束后，将酶解液置于沸水浴中10min，以终止酶解反应。
四、将酶解液冷却至室温，在7500rpm下离心15min，取上清液备用。
五、纳米纤维的制备：使用nacl溶液将上清液的浓度稀释至1％(w/v)通过bca法测定上清液的蛋白含量，此时溶液中nacl的最终浓度为20mm，使用2mol/l和0.1mol/l的hcl将溶液的ph值精确调至2，之后将溶液置于85℃的水浴中加热8h，反应结束后将溶液置于冰浴中以停止反应，得到大豆蛋白自组装纳米纤维。
实施例2纳米的制备
一、对碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶进行酶活力测定。
二、通过对碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶四种酶进行筛选，确定胰蛋白酶为后续实验用酶。
三、大豆蛋白的酶解：将2g大豆蛋白溶于50ml去离子水中，磁力搅拌2h，之后放入4℃冰箱中水化过夜。将0.02g胰蛋白酶(1:100)加入到大豆蛋白溶液中，将溶液ph值调节至7，在37℃的水浴锅中进行酶解反应，反应40min。控制溶液的水解度为3％。酶解反应结束后，将酶解液置于沸水浴中10min，以终止酶解反应。
四、将酶解液冷却至室温，在7500rpm下离心15min，取上清液备用。
五、纳米纤维的制备：使用nacl溶液将上清液的浓度稀释至3％(w/v)通过bca法测定上清液的蛋白含量，此时溶液中nacl的最终浓度为20mm，使用2mol/l和0.1mol/l的hcl将溶液的ph值精确调至2，之后将溶液置于85℃的水浴中加热8h，反应结束后将溶液置于冰浴中以停止反应，得到大豆蛋白自组装纳米纤维。
技术特征：
1.一种利用大豆蛋白酶解产物自组装制备纳米纤维的方法，其特征在于利用胰蛋白酶酶解大豆蛋白制备性能优秀的纳米纤维通过以下步骤实现：一、胰蛋白酶酶解大豆蛋白得到不同水解度酶解产物的研究：通过对水解度的控制，得出酶解过程的最佳反应条件，通过研究不同酶解时间下的水解度得出二者之间的关系；二、酶解液制备纳米纤维的研究：使用nacl溶液将酶解液稀释至特定浓度，稀释后的酶解液将用于制备纳米纤维，此时nacl的最终浓度为20mm；将溶液的ph值调至2，在85℃下加热8h制备纳米纤维；为了终止反应，将反应后的样品置于冰浴中冷却，放在4℃的冰箱中保存。
(1)、根据权利要求1所述的一种大豆蛋白酶解产物自组装制备纳米纤维的方法，其特征在于步骤一中胰蛋白酶酶解大豆蛋白的过程，将大豆蛋白溶液置于37℃的水浴锅中，调节ph为7，加入0.02g胰蛋白酶(1:100)反应18min、40min，测定水解度为1％、3％。
(2)、根据权利要求1所述的一种大豆蛋白酶解产物自组装制备纳米纤维的方法，其特征在于步骤二中使用nacl溶液将水解度为1％、3％的酶解液浓度分别稀释至1％、3％(w/v)，此时nacl的最终浓度为20mm；在ph2、85℃下加热8h制备纳米纤维。
技术总结
本发明提供一种利用大豆蛋白酶解产物自组装制备纳米纤维的方法，具体涉及胰蛋白酶酶解后的酶解产物通过自组装形成纳米纤维。包括以下步骤：酶的选择和酶活力的测定；大豆蛋白的酶解：将0.02g胰蛋白酶(1:100)加入到蛋白溶液中，在37℃、pH7的条件下酶解18min、40min；酶解液的离心；纳米纤维的制备：使用NaCl溶液将水解度为1％和3％上清液的浓度稀释至1％、3％(W/V)，NaCl的最终浓度为20mM。溶液pH值为2，并在85℃下加热8h来制备纳米纤维；4℃保藏。本方法通过胰蛋白酶酶解大豆蛋白作为制备纳米纤维的构建片段，所得的纳米纤维反应活性高，并可显著抑制纳米纤维的逆反应聚集导致的部分功能丧失。
技术研发人员：李良;安迪;赵添;胡安娜;洪瑞
受保护的技术使用者：东北农业大学
技术研发日：.09.04
技术公布日：.12.20
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