本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一组四氢吲哚并喹唑啉类化合物及其应用。
背景技术：
动脉粥样硬化是一种以脂质沉积和炎症反应为特征的慢性疾病，而血管壁的炎症是动脉粥样硬化发展的重要原因(libby,p.,etal.,inflammationinatherosclerosis.nature,2002.420:868-874.)。动脉粥样硬化过程中炎症介质的一个重要基础是斑块中脂质的修饰和沉积(xu,s.,etal.,targetingepigeneticsandnon-codingrnasinatherosclerosis:frommechanismstotherapeutics.pharmacology&therapeutics,.196:15-43.)。早期的抗动脉粥样硬化药物的研究以调脂为主要特征，他汀类药物是典型的代表。他汀类药物虽然可以有效地降低胆固醇，但是该类药物对心血管事件发生的干预有效率仅为30％-40％，且肝肾毒性较大，同时伴有对横纹肌的损伤，因此动脉粥样硬化导致的心血管疾病治疗效果的提升还需要发现新作用机制的药物。
目前研究表明，nlrp3(含有3个nlr家族的pyrin结构域)炎性小体促进炎症反应与动脉粥样硬化的发病机制密切相关，其为靶向抑制nlrp3和血管炎症提供了新的治疗方法。nlrp3是一种蛋白质复合物，是天然免疫系统重要的组成部分，它能够识别与多种病原体相关的分子模式，并且在动脉粥样硬化的发病机制方面获得了人们大量的研究关注(guo,h.,etal.,inflammasomes:mechanismofaction,roleindisease,andtherapeutics.naturemedicine,.21(7):677-687.)。在人体中，nlrp3炎性小体的刺激和随后的白细胞介素-1β(il-1β)释放与冠状动脉疾病的风险密切相关(paramelvarghese,g.,etal.,nlrp3inflammasomeexpressionandactivationinhumanatherosclerosis.journaloftheamericanheartassociation,.5(5))。单克隆中和抗体对il-1β的抑制减缓了apoe-/-小鼠的动脉粥样硬化，而il-1β水平的升高则加速了小鼠和人的动脉粥样硬化形成(olofsson,p.s.,etal.,afunctionalinterleukin-1receptorantagonistpolymorphisminfluencesatherosclerosisdevelopment.theinterleukin-1beta:interleukin-1receptorantagonistbalanceinatherosclerosis.circulationjournal:officialjournalofthejapanesecirculationsociety,.73(8):1531-1536.)。nlrp3炎性小体的异常激活以及由此引起的il-1β和il-18水平的升高将促进泡沫细胞的形成和斑块发展(duewell,p.,etal.,nlrp3inflammasomesarerequiredforatherogenesisandactivatedbycholesterolcrystals.nature,.464(7293):1357-1361)。诺华开发的康纳单抗在其ⅲ期临床研究时的结果表明，中和il-1β可以降低患者心血管事件的复发率(ridker,p.m.,etal.,relationshipofc-reactiveproteinreductiontocardiovasculareventreductionfollowingtreatmentwithcanakinumab:asecondaryanalysisfromthecantosrandomisedcontrolledtrial.lancet,.391(10118):319-328.)，nlrp3/il-1β的激活参与血管炎症并促进动脉粥样硬化的发生。这些结果意味着抑制il-1β或抑制nlrp3可以延缓动脉粥样硬化的发展。目前已经发现几种分子和细胞事件能够触发nlrp3炎性小体的激活，nf-κb是促进各种炎症基因表达上调且参与炎症的关键转录因子之一，它能通过诱导nlrp3和il-1β的转录促进nlrp3炎性体途径(qiao,y.,etal.,tlr-inducednf-kappabactivationregulatesnlrp3expressioninmurinemacrophages.febsletters,.586:1022-1026)。除了转录因子nf-κb之外，mapk(p38，erk和jnk)信号传导途径也是nlrp3炎性小体激活的上游信号，mapk还可以调节il-1β和促炎因子的表达(quintans,j.s.s.,etal.,monoterpenesmodulatingcytokines-areview.foodandchemicaltoxicology,.123,233-257)。此外，炎症还有可能发展为包括癌症在内的其他疾病，因此该化合物也可能在其他方面有应用。
血脂异常是动脉粥样硬化的一个关键的危险因素。越来越多的研究表明高胆固醇血症及变性脂质导致炎症反应，反之炎症反应也会加剧体内脂质代谢紊乱(dejager,s.c.,etal.,crosstalkoflipidsandinflammationinatherosclerosis:theproofpgrn？cardiovascularresearch,.100(1):4-6.)。泡沫细胞分泌促炎因子，促进巨噬细胞及游离血管平滑肌细胞对变性脂质(包括胆固醇)的无限制摄取和血管炎症的发生。atp转运盒转运蛋白a1(abca1)和清道夫受体b类i型(sr-bi)可通过胆固醇逆转运(rct)介导过量的游离胆固醇通过载脂蛋白a-ⅰ(apoa-ⅰ)或高密度脂蛋白(hdl)(zeller,i.,etal.,macrophagefunctionsinatherosclerosis.circulationresearch,.115(12):e83-85.)从泡沫巨噬细胞及血管平滑肌细胞外排。通过这种方式，胆固醇被转运至肝脏进行再循环或以胆酸的形式排泄。abca1基因的启动子区域含有多个转录因子的结合位点，其表达调节主要通过核转录因子【例如过氧化物酶体增殖物激活受体(ppars)、肝x受体(lxr)与类视黄醇x受体(rxr)】与abca1启动子区域的特定反应元件相互作用来实现的(majdalawieh,a.,etal.,ppargamma1andlxralphafaceanewregulatorofmacrophagecholesterolhomeostasisandinflammatoryresponsiveness,aebp1.nuclearreceptorsignaling,.8:e004.)。此外，ampk作为“机体能量调节器”，是调节机体能量稳态的中心环节。有研究表明，激活ampk能够增加abca1基因的蛋白表达，导致胆固醇外流增加(wanx.,etal.,5"-amp-activatedproteinkinase-activatingtranscriptionfactor1cascademodulateshumanmonocyte-derivedmacrophagestoatheroprotectivefunctionsinresponsetohemeormetformin.arteriosclerosis,thrombosis,andvascularbiology,.33:2470-2480.)。综上，血管壁内膜由巨噬细胞、血管平滑肌细胞演变的泡沫细胞及血浆胆固醇脂质的减少以及预防和缓解炎症是动脉粥样硬化治疗的重要方法。
吴茱萸次碱(rutaecarpine，rut)是一种来自吴茱萸提取物的生物碱，具有调节脂质代谢、抗氧化、抗炎和抗动脉粥样硬化的药理作用。我们前期的研究结果表明，rut主要通过上调abca1和清道夫受体sr-bi/cla-1(cd36andlimpiianalogous-1，人sr-bi)的表达来抑制动脉粥样硬化，从而促进rct(xu,y.,etal.,rutaecarpinesuppressesatherosclerosisinapoe-/-micethroughupregulatingabca1andsr-biwithinrct.journaloflipidresearch,.55(8):1634-1647.)，我们还发现rut可以降低高脂饮食(hfd)诱导的apoe-/-小鼠血清中的一些炎症因子水平(zl10067053.1)。然而，rut具有非常低的口服生物利用度，因此我们设计了一系列rut的衍生物(四氢吲哚并喹唑啉类化合物)以改善其体内生物利用度，同时在动物体内维持其抗动脉粥样硬化、抗炎等的作用。
技术实现要素：
本发明首先涉及一组四氢吲哚并喹唑啉类化合物，其结构如通式(ⅰ)所示：
其中，
m为c＝o或ch2；
z为ch或n；
x为ch或c；
y为n、nh、n+、ch、o或n-r8；
r1～r4、r6为h；
r5为h或卤素原子，优选的，所述的卤素原子为f或cl；
r7为h、c1-c4烷基或卤素原子，优选的，所述的c1-c4烷基为甲基，卤素原子为f或cl；
r8为h、c1-c4烷基或卤素取代的乙酰基，优选的，r8为甲基或cocf3。
优选的，所述的化合物为下表所示结构的化合物
本发明还涉及通式(ⅰ)所示的化合物的合成方法，具体的，
化合物tr2和tr3的制备方法为：
(1)将吴茱萸次碱加入到干燥的thf中，在室温下，缓慢加入四氢铝锂，加完后室温搅拌6-12h；
(2)用盐酸淬灭反应，抽滤并用dcm(ch2cl2)、ch3oh洗涤，收集滤液；
(3)滤液蒸出大部分溶剂后，调节ph至8～9，ch2cl2萃取并干燥，将滤液和萃取液合并后浓缩，经硅胶色谱柱分离，得到位于不同分离组分中的tr2和tr3；
化合物tr4的制备方法为
(1)将吴茱萸次碱溶于1,4-二氧六环中，在80℃，滴加溶有ddq(2，3-二氯-5，6-二氰对苯醌)的1,4-二氧六环溶液，反应体系立即变为绿色，回流反应4h后，蒸除溶剂；
(2)用10％氢氧化钾溶液多次洗涤以除去体系中的ddq-2h，过滤后依次用10％盐酸水溶液、纯水洗涤，抽滤干燥后再用二氯甲烷洗涤得tr4；
tr2、tr3、tr4的合成路线如下反应式：
化合物tr6的制备方法为
(1)3-(2-(1h-3-吲哚)乙基)-3h-喹唑啉-4-酮(t-c1)悬浮于乙腈中，在冰水浴条件下滴加三氟乙酸酐的乙腈溶液，反应体系立即成透明溶液，继续反应2h；
(2)过滤得到白色固体，经硅胶层析柱分离后得到纯品tr6；
tr6的合成路线如下反应式：
化合物tr10、tr11、tr12、tr13、tr14和tr16的制备方法为：
反应底物a为8-氯-2,3,4,9-四氢-1h-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-酮
反应底物b为2-氨基苯甲酸时制备得到tr10；
反应底物b为2-氨基烟酸时制备得到tr11、tr12、tr13、tr14；
反应底物b为2-甲胺基苯甲酸时，制备得到tr16；
反应条件为：反应底物a溶于甲苯中，加热至80℃，滴加pocl3并回流30min后，加入反应底物b，反应完成后分离纯化反应产物；
tr10、tr11、tr12、tr13、tr14和tr16的合成路线如下反应式：
化合物ty3的制备方法为：
(1)1-甲基-9h-3,4-二氢吡啶并[3,4-b]吲哚溶于dcm，于0℃加入三乙胺，滴加2-碘代苯甲酰氯，维持此温度反应1h，有固体析出，过滤得固体粗品；
(2)取上述粗品溶于dmf，依次加入醋酸钯，三苯基膦，醋酸钾，四正丁基碘化铵，在n2保护下，回流反应8h；蒸除大部分溶剂，加水后acoet萃取并干燥；
(3)以acoet:pe＝1:3为洗脱剂，经硅胶色谱柱分离得到ty3；
化合物ty4的制备方法为：
(1)ie-1(3,4-二氢-β-卡波林碱)溶于干燥的dcm中，在三乙胺催化下，2-羟基苯甲酰氯滴加到上述体系，室温反应3h；
(2)加水后dcm萃取并干燥，以acoet:pe＝1:3为洗脱剂经硅胶柱色谱分离得ty4
ty3和ty4的合成路线如下反应式：
本发明还涉及通式(ⅰ)所示的四氢吲哚并喹唑啉类化合物的如下应用：
(1)制备治疗心脑血管疾病的药物；
(2)制备提高ampk、abca1、sr-bi的表达的制剂；
(3)制备激活核受体nr活性、抑制nlrp3的活性、il-1β的活性、nf-κb的活性和mapks的活性的制剂；
(4)制备促进细胞胆固醇外流的制剂；
(5)制备抗炎症的药物。
所述的心脑血管类疾病是高脂血症、动脉粥样硬化、心梗或脑中风。
本发明还涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的通式(ⅰ)所示的四氢吲哚并喹唑啉类化合物，以及药学上可接受的一种或多种载体。
附图说明
图1、本发明所述的四氢吲哚并喹唑啉类化合物的合成路线。
图2、tr3可同时激动pparα/γ/δ和lxrα/β。
图3、tr3抑制动脉粥样硬化斑块的形成。
图4、tr3可显著降低apoe-/-小鼠血清中tc、ldl-c和tg的水平。
图5、tr3能降低小鼠血清中il-1β、il-18、il-6和tnf-α的水平。
图6、tr3能显著抑制nlrp3、caspase-1以及il-1β等蛋白的表达。
图7、tr3能够显著抑制apoe-/-小鼠肝脏中p-iκbα和p-p65蛋白的表达。，
图8、tr3还能抑制p-p38、p-erk和p-jnk的表达。
图9、tr3通过mapk信号通路抑制nlrp3炎性小体的激活。
图10、tr3增加apoe-/-小鼠肝脏abca1和sr-bi表达。
图11、tr3在作用细胞后能够显著上调ampk的水平。
具体实施方式
实施例1:tr2和tr3的合成
将吴茱萸次碱(2.0g,7mmol)加入到100ml干燥的thf中，在室温下，分批缓慢加入四氢铝锂(1.06g，28mmol)，加完后室温搅拌8h(反应体系开始呈黄色，颜色逐渐加深变绿，并伴随着发热)。
用1m的盐酸淬灭反应，抽滤并用dcm、ch3oh洗涤，收集滤液。滤液蒸出大部分溶剂后，调节ph至8～9，dcm萃取并干燥。将滤液和萃取液合并后浓缩，以acoet:pe＝1:4为洗脱剂经硅胶色谱柱分离，分别得纯品tr2和tr3。
5,7,8,13,13b,14-六氢吲哚并[2’,3’:3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉(tr2)
tr2(16mg,相对产率3％)，mp181-183℃。ms(esim/z)276.21(m+h)+,1hnmr(400mhz,cd3cocd3)δ10.05(s,1h,13-nh),7.46(d,j＝8.0hz,1h,9-h),7.39(d,j＝8.0hz,1h,12-h),7.09(t,j＝7.2hz,1h,11-h),7.01(t,j＝7.2hz,1h,10-h),6.98-6.95(m,2h,1,2-2h),6.69-6.66(m,2h,3,4-2h),5.09(s,1h,14-nh),4.99(d,j＝4.8hz,1h,13b-h),4.05(d,j＝15.2hz,1h,7-ch2-ha),3.88(d,j＝15.2hz,1h,7-ch2-ha’),3.24-3.19(m,2h,5-ch2),2.89-2.70(m,2h,8-ch2-hband8-ch2-hb’)。
5,7,8,13-四氢吲哚并[2’,3’:3,4]并[2,1-b]喹唑啉(tr3)
tr3(0.52g，相对产率97％)，mp252-254℃。ms(esim/z)274.22(m+h)+,1hnmr(400mhz,cd3cocd3)δ10.51(s,1h,13-nh),7.58-7.55(m,2h,9,12-2h),7.22(t,1h,j＝7.6hz,2-h),7.13(d,1h,j＝7.2hz,4-h),7.07(t,1h,j＝7.6hz,3-h),7.02-6.97(m,3h,1,10,11-3h),4.50(s,2h,5-ch2),3.50(t,j＝6.8hz,2h,7-ch2),3.11(t,j＝6.8hz,2h,8-ch2)。
实施例2:吲哚并[2’,3’:3,4]并[2,1-b]喹唑啉-5(13h)-酮(tr4)的合成
在50℃，将吴茱萸次碱(1.44g,5mmol)溶于1,4-二氧六环(20ml)中，在80℃，滴加溶有ddq(1.14g,5mmol)的1,4-二氧六环溶液(红色)，反应体系立即变为绿色，回流反应4h后，蒸除溶剂。用10％氢氧化钾溶液多次洗涤以除去体系中的ddq-2h，过滤后依次用10％盐酸水溶液、纯水洗涤，抽滤干燥得粗品。粗品再用二氯甲烷洗涤得tr4(0.67g,产率47％)，淡黄色固体，mp282-284℃。ms(esi,m/z)286.17(m+h)+,318.30(m+na)+。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ12.71(s,1h,13-nh),8.64(d,j＝7.6hz,1h,4-h),8.38(dd,j＝1.2,8.0hz,1h,9-h),8.18(d,j＝8.0hz,1h,7-h),7.94(td,1h,j＝1.6,7.6hz,2-h),7.86-7.84(m,2h,1,3-2h),7.69(d,j＝8.0hz,1h,8-h),7.50(qd,2h,j＝1.2,8.0hz,10,12-2h),7.30(dt,1h,j＝0.8,7.6hz,1h,11-h)。
实施例3:14-三氟乙酰基-8,13,13b,14-二氢吲哚并[2’,3’:3,4]并[2,1-b]喹唑啉-5(7h)-酮(tr6)的合成
3-(2-(1h-3-吲哚)乙基)-3h-喹唑啉-4-酮(1.45g,5mmol)悬浮于30ml乙腈中，在冰水浴条件下(温度控制在2℃以下)，滴加三氟乙酸酐(0.7ml,5mmol)的乙腈溶液，反应体系立即成透明溶液，继续反应2h，有白色固体析出。过滤得到白色固体，以acoet:pe＝1:4为洗脱剂经硅胶层析柱分离后得到纯品tr6。
tr6(0.63g)，mp199-201℃。hrms(esim/z)calcd[m+h]+forc20h13o2n3f3384.1033found385.1637。
1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ11.41(s,1h,13-nh),7.90(d,j＝7.5hz,1h,4-h),7.67(t,j＝7.5hz,1h,3-h),7.38(t,j＝7.5hz,2h,2,9-2h),7.29(d,j＝8.0hz,1h,12-h),7.09(td,j＝1.0,7.5hz,2h,10,11-h),6.98(td,j＝1.0,7.5hz,1h,1-h),4.71(dd,j＝5.0,13.5hz,1h,ch2a),3.76(m,1h,ch2a’),2.98(m,1h,ch2b),2.64(dd,j＝5.0,16.0hz,1h,ch2b’)。
实施例4:12-氯-8,13-二氢吲哚并[2",3":3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-5(7h)-酮(tr10)
以8-氯-2,3,4,9-四氢-1h-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-酮(0.44g,2mmol)和2-氨基苯甲酸(0.27g,2mmol)为反应物得到纯品，再经分离纯化得到纯品tr10(0.28g,产率44％)，mp205-208℃。ms(esim/z)322.18(m+h)+。
1hnmr(400mhz,cd3cocd3)δ10.97(s,1h,13-nh),8.22(dd,j＝1.2,8.0hz,1h,4-h),7.78(td,j＝1.6,7.6hz,1h,3-h),7.69(d,j＝8.0hz,1h,1-h),7.62(d,j＝8.0hz,1h,9-h),7.47(td,1h,j＝1.2,8.0hz,2-h),7.37(d,j＝7.6hz,1h,11-h),7.16(t,j＝8.0hz,1h,10-h),4.55(t,j＝6.8hz,2h,7-ch2),3.28(t,j＝6.8hz,2h,8-ch2)。
实施例5:12-氯-8,13-二氢吲哚并[2”,3”:4",5"]嘧啶并[1",2":1,2]吡啶并[3,4-b]吲哚-5(7h)-酮(tr11)的合成
以8-氯-2,3,4,9-四氢-1h-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-酮(0.40g,1.8mmol)和2-氨基烟酸(0.25g,1.8mmol)为反应物得到粗品，再经纯化后得到纯品tr11(0.29g,产率50％)，mp>280℃。ms(esim/z)323.14(m+h)+。
1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ12.37(s,1h,13-h),8.98(dd,j＝2.07,4.49hz,1h,2-h),8.62(dd,j＝1.96,7.80hz,1h,4-h),7.71(d,j＝8.05hz,1h,9-h),7.56(td,j＝3.86,7.56hz,1h,3-h),7.41(d,j＝7.48hz,1h,11-h),7.15(t,j＝7.52hz,1h,10-h),4.48(t,j＝6.91hz,2h,7-ch2),3.24(t,j＝6.86hz,2h,8-ch2)。
实施例6:12-甲基-8,13-二氢吲哚并[2”,3”:4",5"]嘧啶并[1",2":1,2]吡啶并[3,4-b]吲哚-5(7h)-酮(tr12)的合成
以8-甲基-2,3,4,9-四氢-1h-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-酮(0.30g,1.5mmol)和2-氨基烟酸(0.25g,1.8mmol)为反应物得到粗品，粗品经纯化后得到纯品tr12(0.17g,产率37％)，mp>280℃。ms(esim/z)303.14(m+h)+。
1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ11.95(s,1h,13-nh),8.95(dd,j＝2.06,4.59hz,1h,2-h),8.54(dd,j＝2.01,7.85hz,1h,4-h),7.54–7.46(m,2h,3,9-h),7.11(d,j＝6.93hz,1h,11-h),7.04(t,j＝7.48hz,1h,10-h),4.47(t,j＝6.93hz,2h,7-ch2),3.21(t,j＝6.89hz,2h,8-ch2),2.60(s,3h,ch3)。
实施例7:12-氟-8,13-二氢吲哚并[2”,3”:4",5"]嘧啶并[1",2":1,2]吡啶并[3,4-b]吲哚-5(7h)-酮(tr13)的合成
以8-氟-2,3,4,9-四氢-1h-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-酮(0.41g,2mmol)和2-氨基烟酸(0.28g,2mmol)为反应物得到粗产物，粗品经纯化后得到纯品tr13(0.17g,产率28％)，mp>280℃。ms(esim/z)307.18(m+h)+。
1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ12.68(s,1h,13-nh),8.96(dd,j＝2.00,4.87hz,1h,2-h),8.58-8.51(m,1h,4-h),7.56–7.46(m,2h,3,9-h),7.18–7.06(m,2h,10,11-h),4.48(t,j＝6.94hz,2h,7-ch2),3.27–3.16(m,2h,8-ch2)。
实施例8:10-氯-8,13-二氢吲哚并[2”,3”:4",5"]嘧啶并[1",2":1,2]吡啶并[3,4-b]吲哚-5(7h)-酮(tr14)
以6-氯-2,3,4,9-四氢-1h-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-酮(0.44g,2mmol)和2-氨基烟酸(0.28g,2mmol)为反应物得到粗产物，粗品经纯化后得到纯品tr14(0.06g,产率9.3％)，mp>280℃。ms(esim/z)321.07(m+h)+。
1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ12.38(s,1h,13-nh),8.96(dd,j＝2.02,4.58hz,1h,2-h),8.55(dd,j＝2.03,7.87hz,1h,4-h),7.80(d,j＝1.98hz,1h,9-h),7.55–7.47(m,2h,3,12-h),7.31(dd,j＝2.06,8.74hz,1h,11-h),4.46(t,j＝6.93hz,2h,ch2n-),3.22(t,j＝7.03hz,2h,ch2)。
实施例9:14-甲基-10-氯-8,13-二氢吲哚并[2",3":3,4]吡啶并[2,1-b]喹唑啉-5(7h)-酮(tr16)的合成
以8-氯-2,3,4,9-四氢-1h-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-酮(0.33g,1.5mmol)和2-甲胺基苯甲酸(0.227g,1.5mmol)为反应物得到固体粗品，用甲醇重结晶后得纯品tr16(0.144g,产率29％)，mp242-245℃。ms(esi,m/z)336.05(m+h)+。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ12.73(brs,1h,13-nh),8.36(dd,j＝1.2,8.0hz,1h,1-h),8.20(d,j＝8.0hz,1h,4-h),8.14(td,j＝1.2,8.0hz,1h,3-h),8.03(d,j＝2.0hz,1h,9-h),7.82(t,j＝8.0hz,1h,2-h),7.71(d,j＝8.8hz,1h,12-h),7.52(dd,j＝2.0,8.8hz,1h,11-h),4.46(t,j＝7.2hz,2h,7-ch2),4.36(s,3h,ch3),3.31(t,j＝7.2hz,2h,8-ch2)。
13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ158.18(qc),150.09(qc),139.58(qc),139.48(qc),136.78(ch),129.12(ch),128.91(ch),128.69(qc),127.76(ch),126.10(qc),124.16(qc),121.43(qc),120.75(ch),118.81(qc),118.69(ch),115.33(ch),42.19(ch2),40.95(ch3),18.41(ch2)。
实施例10:8,13-二氢-13h-吲哚并[2",3":3,4]吡啶并[1,2-b]异喹啉-5(7h)-酮(ty3)的合成
1-甲基-9h-3,4-二氢吡啶并[3,4-b]吲哚(0.75g,4mmol)溶于dcm(30ml)，于0℃加入三乙胺(0.6ml,4.3mmol)，滴加2-碘代苯甲酰氯(0.6ml,4mmol)，维持此温度反应1h，有固体析出，过滤得固体，干燥并称重得1.8g粗品。取上述粗品(0.8g,2mmol)溶于dmf，依次加入醋酸钯(30mg,0.15mmol)，三苯基膦(100mg,0.4mmol)，醋酸钾(0.78g,8mmol)，四正丁基碘化铵(0.8g,2mmol)，在n2保护下，回流反应8h。蒸除大部分溶剂，加水后acoet萃取并干燥。以acoet:pe＝1:3为洗脱剂，经硅胶色谱柱分离得到ty3(60mg,产率11％)，mp307-310℃。ms(esim/z)287.16(m+h)+,284.96(m-h)+。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.70(s,1h,13-nh),8.25(d,j＝8.0hz,1h,1-h),7.72(td,j＝1.2,8.0hz,1h,2-h),7.64-7.59(m,2h,9-hand4-h),7.49-7.43(m,2h,12-hand14-h),7.22(td,j＝0.8,8.0hz,1h,3-h),7.10-7.06(m,2h,10,11-2h),4.41(t,j＝6.8hz,2h,7-ch2),3.10(t,j＝6.8hz,2h,8-ch2)。
实施例11:7,8,13,13b-四氢-5h-苯并[5",6"][1,3]噁嗪并[3",2":1,2]吡啶并[3,4-b]吲哚-5-酮(ty4)的合成
ie-1(0.34g,2mmol)溶于干燥的dcm中，在三乙胺(0.50ml,2mmol)催化下，2-羟基苯甲酰氯(0.40g,2.6mmol)滴加到上述体系，室温反应3h，加水后dcm萃取并干燥，以acoet:pe＝1:3经硅胶柱色谱分离得ty4(0.12g,产率20.7％)，mp228-229℃。ms(esim/z)291.12(m+h)+,313.06(m+na)+。
1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ11.52(s,1h,13-h),7.92(d,j＝7.5hz,1h,1-h),7.62-7.58(m,2h,9-hand2-h),7.44(d,j＝8.5hz,1h,4-h),7.25-7.19(m,2h,11,12-2h)7.15(d,j＝8.0hz,1h,3-h),7.08(t,j＝7.5hz,1h,10-h),6.69(s,1h,13b-h),4.74(dd,j＝4.0,13.0hz,1h,7-ch2-ha),3.23(td,1h,j＝4.0,12.0hz,7-ch2-ha’),2.97-2.83(m,2h,ch2)。
实施例12、本发明所述化合物对abca1和sr-bi的上调作用
本发明化合物进行药理学上提高abca1和sr-bi表达活性的实验，是将消化对数生长期的abca1p-luchepg2或sr-bi-luchepg2细胞，用培养基稀释并细胞计数，控制细胞浓度为约5×105个/ml，96孔板接种，每孔加入100μl单细胞悬液。约6h待细胞充分贴壁后，移去含血清的培养基，用pbs轻轻漂洗细胞一次，每个实验孔加入不含血清的mem-ebss培养基200μl，再分别加入2μl待测的化合物样品(终浓度10μg/ml)，同时对照孔加入相应浓度的dmso。18-24h后移去培养基，按照luciferaseassaysystem中所述的方法测定细胞荧光素酶活性。通过对筛选过程中dmso的终浓度、样品作用于细胞的时间以及每孔接种的细胞数等条件进行优化，最终确定筛选条件如下：每孔接种5×104个细胞，dmso终浓度0.1％，样品作用时间为18h。
用如下方程计算待测样品对荧光素酶活性的改变率：
改变率(％)＝a/b×100
其中，a为加入待测样品后测定的细胞荧光素酶活性(rlu)，b为加入空白对照样品(dmso)后测定的细胞荧光素酶活性(rlu)，测定各孔细胞的荧光素酶活性，分析样品浓度与荧光素酶活性的改变率之间的量效关系，计算ec50。
表1化合物对abca1和sr-bi表达活性
实施例13、核受体报告基因(pbind-hppars/lxrs-lbd)瞬时转染活性检测
消化对数生长期的hepg2细胞，以5×104个/孔/100μl密度接种至白色透明底96孔板。待细胞生长至90％左右汇合度且生长状态良好时，按照25μl/孔空白培养基稀释0.5μl脂质体
对abca1活性较好化合物进行了lxrα/β激动活性测定，结果显示，化合物tr3、tr4、tr6在两个亚型上均有激动活性。根据这些化合物在abca1上调剂模型上的ec50和最大上调倍数，初步判断，tr3、tr4、tr6可能对两个亚型都有作用，结果如表2所示。
表2活性化合物对lxrα/β的激动活性
对tr3化合物(图中标记为r3)的活性进一步的测试结果如图2所示，tr3在一定程度上可同时激动pparα/γ/δ和lxrα/β。但当加入化合物r3的同时，加入任一种核受体的抑制剂时(pparα抑制剂为mk886，pparγ抑制剂为gw9662，pparδ抑制剂为gsk3787，lxrα/β抑制剂为ggpp)时，显著抑制了tr3对abca1转录活性应有的上调作用。
实施例14、化合物tr3抑制高脂饮食的apoe-/-小鼠动脉粥样硬化的发展
1、apoe-/-小鼠动脉粥样硬化模型的构建、给药及标本采集
apoe-/-小鼠6周龄，雄性，普通饲料喂养一周。根据apoe-/-小鼠体重，随机分成3组(空白对照组、高脂模型组、给药组)，每组12只。从7周龄开始，模型组和给药组喂养高脂饲料，空白对照组继续喂养普通饲料。给药组r3(tr3)(5mg/kg)灌胃给药，空白对照组和高脂模型组灌胃给羧甲基纤维素钠(cmc-na)溶液。将给药12周的apoe-/-小鼠禁食过夜。摘眼球取血，收集于ep管中，2500rmp离心15min，将离心好的上层血清转移至新的ep管中(分装成两份)，置于-20℃保存。固定小鼠，用手术剪沿着腹部的正中线剪开皮肤直至颈部，剪开腹腔，先留取新鲜的肝脏组织，分3管放入冻存管中，再立即放入液氮，用于后续检测肝脏血脂指标以及提取rna和蛋白。剪开胸腔，暴露心脏，立即用pbs10ml进行心脏灌流，并继续用4％的多聚甲醛溶液灌流进行固定，直至肝脏变白后停止灌流。取出固定后的肝脏，放入盛有4％的多聚甲醛溶液的六孔板中，继续固定。分离主动脉至髂骨总分支的动脉全长，将其放入盛有4％的多聚甲醛溶液的六孔板中。主动脉在4％的多聚甲醛溶液中固定过夜后，放入20％的蔗糖溶液中，4℃保存。
2、apoe-/-小鼠主动脉剥离及油红染色
将主动脉从20％蔗糖溶液中取出，pbs漂洗，然后在解剖显微镜下将主动脉周围的脂肪组织及其他肌肉组织小心的去除干净，并将其纵向剪开。用pbs漂洗，后放入60％异丙醇中浸泡2min，进行同步化。将同步化好的血管放入现配的油红工作液中，浸泡15min。放入60％异丙醇中分色1min，后放入pbs溶液中。将主动脉平铺于载玻片上，并放置于解剖镜显微镜下将其完整摊开，后即可进行显微镜拍照。
结果如图3所示，通过主动脉的油红染色可以看出，模型组与空白组相比较，斑块面积明显增加，说明造模成功。与模型组相比，tr3给药组可明显减少主动脉中硬化斑块的面积，以上结果说明tr3对抑制动脉粥样硬化斑块的形成有良好的效果，具有深入研究并发展成为新型抗动脉粥样硬化候选药物的良好前景。
3、apoe-/-小鼠血清中血脂水平的测定
利用中生北控公司各项指标的测定试剂盒，使用全自动生化分析仪器进行测定。结果如图4所示，tr3可显著降低apoe-/-小鼠血清中tc、ldl-c和tg的水平，表明r3对apoe-/-小鼠高脂血症具有明显的缓解作用。
4、apoe-/-小鼠血清中炎症因子水平的测定
采用森贝伽生物科技有限公司elisa试剂盒测定小鼠血清中il-1β、il-18、il-6、tnf-α、il-10的含量。标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，将标准品进行梯度稀释稀释。加样：分别设空白孔、待测样品孔。在酶标包被板上测样品孔中先加样品稀释液40μl，再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板底部，尽量不要触及孔壁，轻轻晃动混匀。温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，重复5次，拍干。加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。温育：同步骤3。洗涤：同步骤5。显色：每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。终止：每孔加入终止液50μl，终止反应(蓝色变为黄色)。检测：以空白孔调零，450nm波长下一次测量各孔的吸光度，该过程要在加入终止液15min内进行。
结果如图5显示，tr3能显著降低小鼠血清中il-1β、il-18和il-6的水平，轻微降低tnf-α的水平，表明其可以抑制炎症因子水平。
5、apoe-/-小鼠肝组织蛋白的测定
动物组织进行蛋白样品制备时，首先需将组织在ripa裂解液中进行匀浆破碎，裂解，后续步骤则与细胞的蛋白样品制备相同。细胞上清蛋白样品制备时，需先将上清进行冷冻干燥，再用普利莱生物公司的液体样本总蛋白抽提试剂盒对其进行蛋白提取，然后进行蛋白免疫印迹(western-blot)分析。
采用western-blot法检测tr3对apoe-/-小鼠肝脏以及j774a.1细胞中nlrp3炎性小体激活等相关蛋白的影响，结果如图6所示，tr3能显著抑制nlrp3、caspase-1以及il-1β等蛋白的表达。
我们还检测了tr3对apoe-/-小鼠体内nf-κb以及mapk信号通路的影响，结果如图7、8所示，tr3能够显著抑制apoe-/-小鼠肝脏中p-iκbα和p-p65蛋白的表达，表明其可以抑制nf-κb信号通路。同时，tr3还能抑制p-p38、p-erk和p-jnk的表达，表明其可以抑制mapk信号通路。
我们尝试在j774a.1细胞中加入mapk信号通路激活剂anisomycin和tr3，结果如图9所示，tr3对nlrp3、caspase-1、以及il-1β的抑制作用有所减弱，表明化合物tr3在j774a.1细胞中是通过mapk信号通路抑制nlrp3炎性小体的激活。
综上，化合物tr3显著抑制apoe-/-小鼠肝脏nlrp3炎性小体激活，从而减少il-1β的产生；tr3能抑制apoe-/-小鼠肝脏炎症通路nf-κb、mapks发挥抗炎作用。此外，化合物tr3增加apoe-/-小鼠肝脏abca1和sr-bi表达(图10)。
实施例15、化合物tr3激活ampk
小鼠巨噬细胞raw264.7，约48h传代一次。待细胞长满后，弃旧培养基，用pbs漂洗细胞后弃掉，之后加适量胰酶，室温下消化约2min，弃掉消化液，立即加入含10％fbs的rpmi-1640完全培养基，以抑制胰蛋白酶活力，用弯头吸管反复轻轻吹打培养瓶内细胞，使细胞完全脱离瓶底且吹打使之分散为单个细胞悬液。再按1:4-1:6比例接种细胞悬液于新的细胞瓶内，然后补加适量完全培养基，放入培养箱继续培养。培养条件：37℃，5％co2。si-ampk预处理raw264.7细胞24h，然后加入化合物tr3(1μm)24h，利用wb方法检测abca1、ampk的表达。
利用westernblot方法检测tr3对ampk的作用，结果如图11所示，tr3在作用细胞18-24h后能够显著上调ampk的水平，说明其能激活ampk。加入化合物tr3时，abca1表达明显上调，但加入干扰rna(si-ampk)后，抑制了原来tr3对abca1产生的上调作用。
最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用作限定本发明的保护范围。
技术特征：
1.一组四氢吲哚并喹唑啉类化合物，其结构如通式(ⅰ)所示：
其中，
m为c＝o或ch2；
z为ch或n；
x为ch或c；
y为n、nh、n+、ch、o或n-r8；
r1～r4、r6为h；
r5为h或卤素原子，优选的，所述的卤素原子为f或cl；
r7为h、c1-c4烷基或卤素原子，优选的，所述的c1-c4烷基为甲基，卤素原子为f或cl；
r8为h、c1-c4烷基或卤素取代的乙酰基，优选的，r8为甲基或cocf3。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述的化合物为下表所示结构的化合物：
3.权利要求2所述化合物的制备方法，其特征在于，
所述的化合物tr2和tr3的制备方法为：
(1)将吴茱萸次碱加入到干燥的thf中，在室温下，缓慢加入四氢铝锂，加完后室温搅拌6-12h；
(2)用盐酸淬灭反应，抽滤并用dcm、ch3oh洗涤，收集滤液；
(3)滤液蒸出大部分溶剂后，调节ph至8～9，dcm萃取并干燥，将滤液和萃取液合并后浓缩，经硅胶色谱柱分离，得到位于不同分离组分中的tr2和tr3；
所述的化合物tr4的制备方法为：
(1)将吴茱萸次碱溶于1,4-二氧六环中，在80℃，滴加溶有ddq(2，3-二氯-5，6-二氰对苯醌)的1,4-二氧六环溶液，反应体系立即变为绿色，回流反应4h后，蒸除溶剂；
(2)用10％氢氧化钾溶液多次洗涤以除去体系中的ddq-2h，过滤后依次用10％盐酸水溶液、纯水洗涤，抽滤干燥后再用二氯甲烷洗涤得tr4；
所述的化合物tr6的制备方法为
(1)3-(2-(1h-3-吲哚)乙基)-3h-喹唑啉-4-酮(t-c1)悬浮于乙腈中，在冰水浴条件下滴加三氟乙酸酐的乙腈溶液，反应体系立即成透明溶液，继续反应2h；
(2)过滤得到白色固体，经硅胶层析柱分离后得到纯品tr6；
所述的化合物tr10、tr11、tr12、tr13、tr14和tr16的制备方法为：
反应底物a为8-氯-2,3,4,9-四氢-1h-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-酮
反应底物b为2-氨基苯甲酸时制备得到tr10；
反应底物b为2-氨基烟酸时制备得到tr11、tr12、tr13、tr14；
反应底物b为2-甲胺基苯甲酸时制备得到tr16；
反应条件为：反应底物a溶于甲苯中，加热至80℃，滴加pocl3并回流30min后，加入反应底物b，反应完成后分离纯化反应产物；
所述的化合物ty3的制备方法为：
(1)1-甲基-9h-3,4-二氢吡啶并[3,4-b]吲哚溶于dcm，于0℃加入三乙胺，滴加2-碘代苯甲酰氯，维持此温度反应1h，有固体析出，过滤得固体粗品；
(2)取上述粗品溶于dmf，依次加入醋酸钯，三苯基膦，醋酸钾，四正丁基碘化铵，在n2保护下，回流反应8h；蒸除大部分溶剂，加水后acoet萃取并干燥；
(3)以acoet:pe＝1:3为洗脱剂，经硅胶色谱柱分离得到ty3；
化合物ty4的制备方法为：
(1)ie-1(3,4-二氢-β-卡波林碱)溶于干燥的dcm中，在三乙胺催化下，2-羟基苯甲酰氯滴加到上述体系，室温反应3h；
(2)加水后dcm萃取并干燥，以acoet:pe＝1:3为洗脱剂经硅胶柱色谱分离得ty4。
4.权利要求1或2所述的化合物的如下应用：
(1)制备治疗心脑血管疾病的药物；
(2)制备提高ampk、abca1、sr-bi的表达的制剂；
(3)制备激活核受体nr活性、抑制nlrp3的活性、il-1β的活性、nf-κb的活性和mapks的活性的制剂；
(4)制备促进细胞胆固醇外流的制剂；
(5)制备抗炎症的药物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的心脑血管类疾病是高脂血症、动脉粥样硬化、心梗或脑中风。
6.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1或2所述的化合物，以及药学上可接受的一种或多种载体。
技术总结
本发明涉及一组四氢吲哚并喹唑啉类化合物及其应用，所述四氢吲哚并喹唑啉类化合物结构如通式(Ⅰ)所示：其应用为：(1)制备治疗心脑血管疾病的药物；(2)制备提高AMPK、ABCA1、SR‑BI的表达的制剂；(3)制备激活核受体NR活性、抑制NLRP3的活性、IL‑1β的活性、NF‑κB的活性和MAPKs的活性的制剂；(4)制备促进细胞胆固醇外流的制剂；(5)制备抗炎症的药物。
技术研发人员：司书毅;许艳妮;王潇;罗金雀;李永臻;刘超;姜新海;李依宁;韩小婉;李妍;陈明华;张晶;甄心
受保护的技术使用者：中国医学科学院医药生物技术研究所
技术研发日：.10.08
技术公布日：.02.14
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