摘要
全基因组关联研究发现单核苷酸多态性 (SNP) rs55958994 是与前列腺癌易感性增加相关的显着变异。然而，这个SNP介导癌症风险增加的机制仍然未知。在这项研究中，我们发现，这种变异体位于前列腺癌细胞中一个活跃的增强子中。从前列腺肿瘤细胞中删除这种增强子会导致肿瘤起始、肿瘤生长和侵袭性迁移的下降，以及干细胞样细胞的丢失。采用捕获染色体构象捕获 (capture-C) 和RNA测序相结合的方法，我们鉴定出相同和不同染色体上的基因作为增强子调控的靶标。此外，我们发现在增强子缺失的细胞系中单个候选靶基因的表达挽救了肿瘤发生的不同方面。
研究结果
图1
图1：含有 rs55958994 的染色质位点是PCa细胞的功能性增强子。
(A) 显示了来自PCa细胞系的H3K27ac ChIP-seq 数据。
(B) 转染了荧光素酶报告基因的22Rv1、C4-2B 和LNCaP细胞中荧光素酶报告基因活性。Ctrl，无插入增强子的荧光素酶报告基因；C，带有 rs55958994 相关增强子区域的荧光素酶报告基因与非风险等位基因“(C)”；T，带有 rs55958994 相关增强子区域的荧光素酶报告基因与风险等位基因 (T)。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。***P < 0.001.
(C) 比较野生型 (WT) 22Rv1 细胞和三种增强子缺失的细胞系的软琼脂克隆形成试验。量化正确。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。***P < 0.001.
(D) WT 22Rv1 细胞和3个增强子缺失细胞株 (KOs 1～3) 的 Transwell 实验。迁移到下层小室的细胞用 0.1% 结晶紫染色。量化正确。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。***P < 0.001.
(E) 荧光激活细胞分选术 (FACS)分析WT 22Rv1 细胞和3种增强子缺失的细胞系 (KOs 1～3) 的细胞表面标志CD44和CD24FITC，异硫氰酸荧光素；PE，藻红蛋白。
图2
图2：rs55958994 相关增强子缺失后的转录组学变化。
(A) 增强子 KO 和 WT 细胞系中基因表达的比较。热图和树状图显示3个KO和4个WT 22Rv1细胞系中差异表达基因的聚类。
(B) 与WT细胞相比，KO中显着下调的基因的注释富集分析（倍数变化 < 1 或 1.5 和调整的 P < 0.1）。
(C) 与 WT 条件相比，KO中显着上调的基因的注释富集分析(fold changes > 1.5 and adjusted P < 0.1)。gtp 酶，鸟苷三磷酸酶。
图3
图3：rs55958994 风险增强子是染色体内和染色体间相互作用的枢纽。
(A) Circos 图显示了从诱饵位点延伸的曲线所指示的全基因组相互作用；染色体内和染色体间的相互作用分别用红色和蓝色表示。至少在两个生物学重复试验中显示了相互作用的重现性。
(B) 基于 RNA-seq 和相应的 Capture-C 信号计数的基因表达倍数变化的比较。共有 2936 个差异表达的基因组位点（调整 P < 0.1）显示在图中。其中，219 个位点既有可重复的相互作用（Capture-C 支持 >1），又有KO和WT之间显着的表达变化（调整后的 P<0.1和log 2倍数变化 >1 或 <-1），以蓝色显示。
(C) 基于增强子缺失 (KO) 细胞中分析的风险增强子潜在靶基因 mRNA（独立 mRNA 文库）水平的 qRT-PCR 分析。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。***P < 0.001，**P < 0.01 与相应的 KO 细胞比较。
图4
图4：在增强子缺失的22Rv1细胞中重新表达候选增强子靶标后拯救致瘤表型。
软琼脂克隆形成定量分析WT 22Rv1细胞，三种增强子缺失的细胞系 (KOs 1-3) 和重新表达 CNTN1 (A)、ITGA5 (B) 或 CDH23 (C) 的KO 细胞。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。***P < 0.001.
(D) WT 22RVv1 细胞、3 个增强子缺失细胞株 (KOs 1～3) 和KO细胞再表达CNTN1的 Transwell 实验定量。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。***P < 0.001.
(E) CD44+CD24-的百分比WT 22Rv1细胞、3 个增强子缺失细胞系 (KOs 1～3) 和CNTN1 中的细胞重新表达 KO 细胞。
图5
图5：22Rv1 细胞 SNP rs55958994 风险等位基因影响CNTN1和CDH23的表达水平。
(A) 22rv1 细胞CRSPR-Cas9 定点突变和 SNP rs55958994 非风险 (C) 和风险 (T) 等位基因测序。
(B) 与具有(C)rs55958994等位基因的 WT 22Rv1 细胞相比，具有(T)rs55958994等位基因的风险细胞中CDH23和CNTN1表达增加，而具有 (T) rs55958994 等位基因的风险细胞中未检测到 ITGA5 表达的显着变化。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。**P < 0.01.n.s.，不显着。
图6
图6：SNP rs55958994 是 22Rv1 细胞的功能性 SNP。
(A) 软琼脂克隆形成试验，比较野生型 22Rv1 细胞与 rs55958994 (C) 等位基因和 22Rv1 细胞与 rs55958994 (T) 等位基因。量化正确。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。*P < 0.05.
(B) 在WT 22Rv1细胞和 (C) rs55958994 等位基因和 22Rv1 细胞和 (T) rs55958994 等位基因的 Transwell 小室试验。迁移到下层小室的细胞用 0.1% 结晶紫染色。量化正确。数据表示三个独立实验的平均值±SEM。*P < 0.05.
(C) 流式细胞仪分析具有rs55958994(C)等位基因的WT 22Rv1 细胞和具有rs55958994 (T)等位基因的22Rv1 细胞表面标志CD44和CD24。
总结
我们的数据表明，rs55958994 相关增强子通过远程染色质相互作用影响多个基因的表达，从而影响前列腺癌的进展。
DOI：10.1126/sciadv.aaw6710
参考文献
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