【专家论坛】食管微生物与食管相关疾病研究进展

本文来源：中华肿瘤杂志, ,41(8): 561-564.

人体被大量包括细菌、古生菌、真核生物和病毒等在内的微生物所附殖，其中自然栖息于人体内的微生物约有100万亿，几乎占据了人体包括皮肤、呼吸道、消化道和泌尿生殖道等在内的每一个角落。这些微生物与人体自身细胞组成了一个复杂的生态系统，与人类进化共存，并通过参与人体的消化吸收、调节细胞发育、影响先天免疫等维持人体正常生理活动。尽管微生物群落具有很强的适应性，但如果受到外界因素干扰，如长期不良饮食习惯、过度使用抗生素等，微生物群落及其生存环境的平衡会被打破，从而失去恢复能力，可导致疾病的发生。有研究显示，微生物与包括肥胖、糖尿病等在内的代谢性疾病、炎症性肠病、心血管疾病以及恶性肿瘤等的发生密切相关。因此，阐明微生物群落的结构和功能是了解人类生理和疾病的必要条件。

1．食管微生物群及菌群功能：

人类消化系统由包括口腔、咽、食管、胃和十二指肠在内的上消化道，以及包括空肠、回肠和结直肠在内的下消化道构成，富含大量微生物。其中下消化道附殖了人类身体中最富含活力的微生物群，近10余年来一直广受关注。研究表明，肠道菌群与炎症性肠病的发生和发展密切相关，结肠微生物可能产生致癌毒素或其代谢产物可以直接或间接促进结直肠癌的发生。但关于上消化道微生物，尤其是食管微生物及其与相关疾病关系的研究较少。

食管是肌肉结构管道，长约20～27 cm，连接口腔和胃。早期研究显示，食管内仅存在短暂的一过性微生物群。20世纪80年代，通过传统的分离培养方法证实，食管并不是一个无菌的场所，而有定植微生物存在。之后，人们对食管微生物构成的认识随着微生物检测技术的发展而逐步深入。对食管腔内冲洗物分离培养显示，食管的菌群主要以链球菌属为主，与口腔的菌群构成模式相似。分离培养方法的优势在于可以量化标本中的活体生物，但是它低估了食管微生物群落的复杂性。Pei等首先采用免培养的16S rDNA PCR技术，对4名健康人的食管组织标本进行检测，发现食管中存在140个物种和41个属的微生物，主要由厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门、梭杆菌门和TM7这6大类构成，证实了链球菌属是正常食管中最常见的菌属。随着分子技术的不断发展，16S rDNA PCR与第二代测序技术结合的16S rRNA基因测序技术逐渐广泛应用于人类微生物群的研究。利用该技术，不仅可以定量描述存在于复杂生物混合物中的菌群，还能对整个群落及其组成成分进行研究。在15名健康儿童的食管组织标本中，研究者采用16S rRNA基因测序技术不仅检测到了占主导地位的链球菌属(厚壁菌门)，同时也发现了普氏菌属(拟杆菌门)和韦荣球菌属(厚壁菌门)的富集。而在随后几项样本量较大的研究中，也在正常食管发现了占主导地位的来自厚壁菌门的链球菌属和韦荣球菌属，以及来自拟杆菌门的普氏菌属，同时还在成年人的正常食管中发现了变形菌门的富集。

人体中微生物群落的主要特征参数包括丰富性、多样性和均匀性等。作为被广泛研究的人类肠道菌群，其细菌种类的丰富性和多样性可以作为健康肠道的一个指标。有研究显示，在出现坏死性小肠结肠炎的早产儿排泄物中，观察到了菌群多样性的减少；婴儿时期肠道菌群多样性的降低会增加日后患过敏性疾病的风险。相反，在老年人队列中，较高的菌群丰富性和多样性与良好的营养状态、发病率降低相关。与人类健康胃肠道功能相关的拟杆菌门、双歧杆菌、梭状芽孢杆菌、乳酸菌等，防止体重增加的厌氧大肠杆菌、克罗索菌等，可以通过调节肠道通透性、上皮细胞功能、肠道蠕动和神经传导，介导提高新陈代谢、对抗感染和炎症、抵抗癌症和自身免疫、内分泌信号等效应。

目前，食管近端定植微生物群的相关功能研究匮乏。关于远端食管微生物群的研究显示，其菌群多样性相对有限，主要以链球菌的菌属为主。与身体其他部位相比，食管远端微生物多样性的增加反而与慢性炎症以及食管发育异常有关。有限的多样性以及链球菌在内的一些主要菌属的存在，可能是正常食管的重要特征。食管远端检测出的普氏菌、放线菌、乳酸菌和葡萄球菌等菌属，可能对维持食管正常功能和微生态环境的修复发挥了补充作用。

2．食管微生物群与

食管相关疾病：

微生物相关的食管疾病主要有食管炎、巴雷特食管和食管癌，远端食管对胃酸和十二指肠胆汁盐的长期暴露被认为是这些食管疾病发病的主要因素，食管微环境的紊乱可能影响食管菌群的组成，进而促进疾病的发生和发展。

Pei等在12例反流性食管炎患者的食管活检组织中发现了17个细菌物种，主要包括拟杆菌门的真口普氏菌、厚壁菌门的链球菌、变形菌门的假单胞菌和幽门螺杆菌。进一步与正常食管比较显示，正常食管的菌群主要由来自厚壁菌门的革兰氏阳性链球菌构成，而反流性食管炎患者的食管则以拟杆菌门、变形菌门和梭杆菌门的革兰氏阴性厌氧菌和微量需氧菌为主。该结果在另外两项研究中得到验证。

巴雷特食管是食管腺癌重要的癌前病变，因此了解其菌群构成对预防食管腺癌的发生有重要启示作用。Osias等基于分离培养法的研究显示，食管远端菌群数量与食管黏膜的病变程度密切相关，提示食管远端菌群可能与巴雷特食管及其进展为食管上皮低级别或高级别不典型增生有关。之后，其他研究者利用16S rRNA基因测序技术，进一步证实了革兰氏阴性厌氧菌在巴雷特食管患者食管中的富集，其中韦荣球菌、普氏菌、奈瑟氏菌和梭杆菌最为常见。值得关注的是，在一项对12例巴雷特食管患者食管菌群的研究中，观察到了占主导地位的链球菌属和普氏菌属，并且二者的比值与食管腺癌的危险因素(高腰臀比和食管裂孔疝的长度)有关。

目前，食管癌菌群构成的相关研究十分有限。Blackett等采用分离培养的方法，比较了30例食管腺癌、37例胃食管反流病、45例巴雷特食管患者及39名对照食管活检组织的菌群分布，结果显示，除了弯曲杆菌外，其他各类食管微生物群的数量随着疾病的进展呈现下降趋势；而疾病向肿瘤的进展可能是由于宿主微生物群变化导致了食管上皮结构发生改变。Elliott等采用16S rRNA基因测序方法进行的研究结果显示，与健康对照相比，食管腺癌及癌旁正常组织中微生物多样性降低，群落组成发生改变；在食管腺癌的标本中发现了发酵乳杆菌的富集。同时，该研究通过比较非侵入性海绵球法、食管刷取和组织活检3种方法发现，在食管上皮高级别瘤变阶段，食管远端巴雷特食管癌变进程中的微生物群体变化可以采用非侵入性海绵球法检测出来，这为食管癌的早诊提供了可能。

3．食管菌群采样方法的研究进展

以及微生物代谢组学：

与下消化道相比，从食管获取样品相对困难，在一定程度上限制了对食管菌群的研究，探索适宜的食管菌群采样方法成为食管微生物研究的重要环节。

目前，食管菌群的采样方法尚缺乏统一标准。现有的采样方法主要为基于组织活检和基于细胞学两大类，其中组织活检方法被认为是金标准。由于活检会在食管上皮形成创口，造成出血，并且抓取的组织标本主要是人体DNA，增加了菌群检测的难度，因此探索侵入性小且相对准确的基于细胞学的采样方法是目前的研究热点。基于细胞学的采样方法包括食管刷、食管吞线试验和海绵球。其中食管刷法是经内镜，通过前端锯齿状刷对食管黏膜进行画圈式采样，从而获得食管表面脱落细胞的方法。该方法虽然解决了创口形成的问题，但仍无法摆脱需要经食管内镜的侵入性缺点。而食管吞线试验和海绵球法，则只需受检者吞入一个含有尼龙线或海绵的胶囊(胶囊一端带有可供拉出的线)，待胶囊外壳在胃中溶解后利用线头将线或海绵拉出，即可获得食管脱落细胞。吞线试验和海绵球法虽然在一定程度上克服了组织活检和食管刷两种采样方法的侵入性缺点，但作为一类食管全段的采样方法，易受到胃部、咽部和口腔部位菌群的污染，获取的标本量也较少。

目前基于不同采样方法的比较研究较少。初步研究显示，食管吞线试验和食管刷法与基于活检组织的菌群丰度相近，海绵球法较组织活检和食管刷法能富集更多来自口腔和胃的菌属。但由于上述研究样本量均较小，不同采样方法的优缺点及其对探讨食管微生物与食管不同疾病关系的影响仍有待深入研究。

微生物代谢组学诞生于1992年，相对于动植物代谢组学，其微生物培养基中有限的细胞数和浓度不足的代谢产物使得检测存在困难，加上灭活时分离细胞内外代谢产物的方法尚无标准，使得微生物代谢组学的发展长期以来一直受限。与高等生物相比，微生物具有简单的结构和丰富的基因数据，关于基因调控微生物代谢网络和生理特性的信息也更易获得，因此探索代谢组学在微生物领域的作用也同样重要。目前，微生物代谢组学已广泛应用于微生物学的多种领域，如微生物鉴定、突变筛选、功能性基因研究、代谢通路鉴定和微生物工程等。

微生物代谢组学研究主要包括样本采集、检测和数据分析。微生物代谢物对分析微生物代谢和致病过程等有极高的应用价值。微生物代谢组由复杂的混合代谢产物组成，同时也与代谢途径和信号转导通路联系密切。作为目前研究较广泛的多菌种领域，肠道微生物组学是系统生物学和代谢组学关注的焦点之一。叶央芳等对标准结肠埃希菌菌株HB101的代谢产物进行结构分析，确定了氨基酸、有机羧酸、糖类和核苷及其衍生物等内源性代谢产物约40种，其中葡萄糖最为丰富，其次是谷氨酸、甜菜碱等，而其他代谢产物含量相对较低。Marchesi等通过研究粪便微生物代谢组学特性，揭示了代谢组学在胃肠道疾病无创诊断中的潜力。张泽等的研究显示，肠道微生物组不仅影响机体代谢，而且肠道微生态的失衡与多种疾病密切相关。

不可否认，微生物代谢组学在过去的几十年取得了丰硕成果，但依然面临巨大挑战。首先，微生物细胞代谢对环境变化异常敏感，同时仍缺乏统一且标准化的方法用以快速灭活微生物和提取代谢物。其次，大量微生物代谢组数据库的陆续涌现为研究提供了数据支持，但其涵盖范围有局限性，仍缺少不同微生物代谢数据的有效整合。第三，目前微生物代谢组学研究仅注重代谢产物本身，缺乏对其来源的思考。最后，如何有效整合代谢组学、转录组学、蛋白质组学等各类组学数据，并给出具有说服力的生物学功能诠释，仍然任重道远。

总之，微生物在人类健康和疾病，包括癌症中扮演着至关重要的角色。我国是食管癌的高发国家，深入研究食管菌群对食管癌形成的影响，可能为发展新的食管癌预防和治疗策略提供线索。

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