大家好，这段时间将会和大家分享几篇关于肿瘤新生抗原筛选的技术。今天这篇文章的标题为——Antigen Identification for Orphan T Cell Receptors Expressed onTumor-Infiltrating Lymphocytes。这篇文章是由斯坦福大学医学院分子和细胞生理学和结构生物学系Garcia教授团队于12月21号刊登于《Cell》。这篇文章主要讲述了如何利用酵母表面展示技术设计抗原合成文库。同时对肿瘤患者的TILs测序，使用来自病人体内的TCR受体进行抗原表位的筛选工作。接着依据筛选到的抗原表位，结合human proteome数据库分析预测潜在的自体抗原和突变抗原，并用T细胞免疫反应功能实验进行验证。
研究结果：
1. 多肽文库的建立
用于酵母表面展示的抗原结构包括共价键连接的抗原肽、β2微球蛋白、HLA-A*02:01及Aga2（Fig.1C），由于HLA-A*02:01通常递呈长度为8到11个氨基酸的多肽，因此在HLA-A*02:01和Aga2之间加入tag，标记不同长度的多肽库（Fig. 1F）。
2. 文库功能性验证
已知DMF5-TCR能与源自MART-1的十肽（EAAGIGILTV）特异性结合。由于ELAGIGILTV更有利于与HLA形成稳定的pMHC，因此研究者首先构建用于展示ELAGIGILTV-HLA*0201酵母，且使用多聚DMF5-TCR耦联磁珠筛选酵母，根据流式结果验该pMHC能够正确折叠并展示于酵母表面（Fig. 2A）。
为验证该库可用于鉴定DMF5-TCR的抗原，研究者利用DMF-TCR多聚体在HLA-A*02:01十肽库进行筛选。且对每一轮酵母筛选获得的多肽进行了深度测序，研究者发现在第3轮测序中，集中筛选到68种的多肽，其中前10种肽占文库的91.7%（Fig. 2D），同时利用reverse hamming distance确定这些多肽之间氨基酸匹配数的度量，根据分数将这些多肽主要分为两簇，主要差别体现在P4-P6位置的氨基酸——29个多肽中有一个中心的“gig”基序，32个多肽中有一个中心的“drg”基序（Fig.2E），且这两簇多肽与MART-1 10肽具有相似性。在对第四轮筛选的多肽进行了序列，发现其中进一步验证大部分多肽与MART-1十肽高度相关（Fig. 2C）。
Fig. 2E
为了进一步验证HLA-A*0201文库筛选抗原的有效性，研究者从一名黑色素瘤患者中获得肿瘤组织3种不同TCR（NKI1、NKI2、NKI3），发现NKI2在第二轮就能够与pMHC强结合。因此，研究者首先使用NKI2筛选pHLA多肽文库，筛选出127多肽。同时免疫功能实验显示，所有抗原多肽均可诱导NKI2-TCR+淋巴细胞分泌IFN-γ因子。效果最好的多肽序列ALDSRSEHFM和CDK4蛋白抗原ALDPHSGHFV表现出高度的序列一致性，证实CDK4蛋白确是NKI2-TCR分子的特异性识别配体分子。
3. TILs TCR抗原表位筛选
研究者对两名患有结直肠癌的60多岁的男性患者的肿瘤的组织样本中的709种TCR进行分析,并发现肿瘤组织中TCR与正常组织中的TCR很少有重叠，因此他们认为突变可能会产生肿瘤特异性TCR（Fig. 3A-C）
接着，他们从中筛选出20种候选TCR进行多肽文库筛选，结果显示仅有4种TCR可成功识别pHLA-A*02:01复合体，且在第3轮筛选的多肽存在一定的相似性的。同时，高度相似的2A和3B能够结合多条相同的多肽，与之相反的是1A和4B在第三轮选择时分别选择了15种和61种独特的多肽。
接着研究者进行TCR交叉反应测试，首先根据第3轮筛选结果确定了每个位置上的氨基酸。并观察在肽的特定位置上所选择的耐受氨基酸的宽度，结果显示1A, 3B所识别的抗原表位高度保守，TCR 2A, 4B分子可识别多种抗原多肽。所以，对于适应性细胞疗法而言，pHLA-A*02:01多肽文库可有效筛选并表征TCR的交叉反应能力，在控制自体免疫反应方面可发挥出重要作用。
总结：
酵母展示技术能够实现10^8抗原文库，序列多样性多肽文库不仅可用于鉴定TCR特异性识别的未知内源性或模拟抗原表位，同时也被用于研究已知TCR的交叉反应性。
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