by ZYM
原文链接：
/10.1016/j.lfs..04.063
知识点积累
紫杉醇：一种微管稳定剂，常见的化疗药物。ceRNA：竞争性内源性RNA。lncRNA-miRNA-mRNA调控机制假设，即lncRNA充当ceRNA来抑制miRNA的表达和生物学功能，从而抑制miRNA靶点。
实验结果
1.乳腺癌组织和细胞中LINC00511水平上调而miR-29c下调
作者通过RT-qPCR 检测了LINC00511和miR-29c在21份配对的乳腺癌组织和邻近正常组织中的表达（Figure1A and C），发现与邻近正常组织相比，乳腺癌组织中LINC00511表达上调、miR-29c表达下调。此外，作者在细胞系中也进行了RT-qPCR实验，将乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7、HS-578T和T47D与正常乳腺上皮细胞系 MCF-10A进行对比，发现乳腺癌细胞系中LINC00511的表达较高（Figure1B），miR-29c的表达较低（Figure1D），与病理组织中结果相符。TCGA数据库中的数据分析同样支持了这一点（Figure1E）。此外，Pearson 相关分析表明，21份乳腺癌组织中LINC00511与miR-29c表达也呈负相关（Figure1F）。
2.在乳腺癌细胞中miR-29c是LINC00511的靶点
为了确定LINC00511和miR-29c之间的关系，作者使用生物信息数据库starBase预测了可受LINC00511调控的潜在miRNA，发现LINC00511包含了与miR-29c种子区域互补的结合序列（Figure2）。为了进一步验证LINC00511和miR-29c之间的直接结合，作者进行了萤光素酶报告基因测定，结果表明，与对照组共转染WT-LINC00511和miR-29c后，MCF-7细胞中的萤光素酶活性降低了（Figure2B）。此外，与对照组相比，当与对照组共转染MUT-LINC00511和miR-29c时，MCF-7细胞没有观察到显着差异（Figure2B）。此外，RT-qPCR证实了在MCF-7和T47D细胞中，相对于si-NC转染的一组，miR-29c的表达在si-LINC00511转染组中有升高（Figure2C）。这些数据表明LINC00511在乳腺癌细胞中充当miR-29c的分子海绵。
3.敲除LINC00511基因后，miR-29c在乳腺癌细胞中表达上调，增强了紫杉醇的细胞毒性
为了阐明LINC00511在紫杉醇对乳腺癌细胞的毒性作用及其潜在机制，将MCF-7和T47D细胞与si-LINC00511或si-NC和抗miR-NC或抗miR-29c进行共转染，然后用50 nM紫杉醇治疗处理48小时。MTT比色分析提示，紫杉醇诱导的MCF-7（Figure3A）和T47D细胞（Figure3B）的细胞活力，在敲除了LINC00511之后，受到的抑制更明显。这表明LINC00511的敲除增强了紫杉醇在乳腺癌细胞中的细胞毒性。但是，在LINC00511 缺失和miR-29c抑制共同处理后，该效应已基本缓解。同时，流式细胞分析表明，在LINC00511沉默后，紫杉醇暴露导致 MCF-7（Figure3C）和T47D细胞（Figure3D）的凋亡显着增加，这表明LINC00511敲除可以通过促进紫杉醇诱导的乳腺癌细胞凋亡，来增强紫杉醇的细胞毒性。然而，在紫杉醇诱导的MCF-7（Figure3C）和T47D细胞（Figure3D）中，抑制miR-29c则会减弱LINC00511沉默对细胞凋亡的影响。综上，LINC00511敲除可通过上调miR-29c增强乳腺癌细胞中紫杉醇的细胞毒性。
4.CDK6在乳腺癌细胞中上调
CDK6是CDK家族的成员，先前已证明是miR-29c在膀胱癌和胃癌中的直接靶标。此外，有人提出针对CDK4 / 6的新药物为耐药性乳腺癌提供了新的方向。因此，作者猜测miR-29c是否可以直接靶向乳腺癌中的CDK6。作者首先通过RT-qPCR检测到CDK6在乳腺癌组织中的表达。如图所示（Figure4A），CDK6 mRNA的表达在乳腺癌组织中相对于在相邻正常组织中增加。同时，作者发现相比正常乳腺细胞系MCF-10A，乳腺癌细胞系如MDA-MB-231，MCF-7，Hs-578T和T47D，CDK6在mRNA（Figure4B）和蛋白（Figure4C）上均为高表达。有趣的是，TCGA数据集和Pearson相关分析均显示乳腺癌组织中miR-29c和CDK6表达之间呈负相关（Figure4DE）。
5.CDK6是miR-29c在乳腺癌细胞中的靶标
生物信息学数据库TargetScan显示CDK6被预测在其3"UTR区存在miR-29c的结合序列（Figure5A）。为了证实CDK6和miR-29c之间的直接相互作用，作者构建了在miR-29c的结合位点内包含WT或MUT CDK6 3"UTR片段的荧光素酶报告载体。萤光素酶报告基因试验证明，在两组共转染的MCF-7细胞中，miR-29c和WT-CDK6组显示的荧光素酶活性比miR-NC和WT-CDK6组低（Figure5 B）。进一步实验，用miR-29c 转染MCF-7和T47D细胞，通过RT-qPCR和western blot分析显示，CDK6的mRNA和蛋白表达受到抑制（Figure5C和D）。因此，作者得出结论，CDK6是乳腺癌细胞中miR-29c的靶标。
6.敲除CDK6后，miR-29c的抑制作用被减弱，紫杉醇对乳腺癌细胞的细胞毒性作用受到了抑制
为了研究miR-29c是否通过CDK6依赖性方式调节乳腺癌细胞中紫杉醇的细胞毒性，将MCF-7和T47D细胞与抗miR-NC或抗miR-29c和si-CDK6或si-NC共转染，然后用50 nM紫杉醇处理48小时。MTT分析显示，紫杉醇治疗可显着抑制MCF-7和T47D细胞的细胞活力，而miR-29c抑制作用可减弱紫杉醇诱导对细胞活力的降低作用（Figure6A和B）。然而，在紫杉醇影响下，CDK6的敲除，有效地消除了抗miR-29c对MCF-7和T47D细胞中细胞活力的影响（Figure6A和B）。流式细胞仪分析进一步提示，抗miR-29c转染细胞后可显着减少紫杉醇诱导的MCF-7和T47D细胞凋亡，在再次引入si-CDK6后可逆转上述过程（Figure6C和D）。总之，这些数据表明，miR-29c抑制作用通过上调CDK6来降低紫杉醇对乳腺癌细胞的细胞毒性作用。
7. LINC00511正向调节乳腺癌细胞中CDK6的表达
作者进一步研究了LINC00511对乳腺癌细胞CDK6表达的影响。RT-qPCR的和Western blot证明，将si-LINC00511引入MCF-7（降低Figure7A）和T47D细胞（Figure7B）后，mRNA和蛋白水平的CDK6表达减少。对starBase的TCGA数据集分析，发现LINC00511表达与1104个乳腺癌样本中的CDK6表达呈正相关（Figure7C）。而且，Pearson相关分析也提示了LINC00511与21个乳腺癌组织中的CDK6表达呈正相关（Figure7D）。这些结果证明了LINC00511对乳腺癌细胞中的CDK6表达呈正向调节作用。
总结与思考
在当下这个免疫治疗最火热的时代，化疗在肿瘤治疗中的地位仍无法被撼动。其中化疗耐药仍然是临床上亟需解决的难题。lncRNA在其中起到的作用越来越受到重视。这篇文章的整体思路比较清晰，和之前看到过的ncRNA的文章类似。LINC00511是一种新发现的致癌lncRNA，已经有文章证实其在乳腺癌中的高表达并有助于肿瘤的发生和发展。但是其中的具体作用暂时未知。作者通过生信分析的方法，证实了miR-29c是LINC00511的作用靶点，LINC00511在乳腺癌细胞中充当了miR-29c的分子海绵。进一步的实验验证了CDK6、LINC00511和乳腺癌细胞的紫杉醇细胞毒性之间的关系。并最终证明了，在细胞层面上（未进行小鼠等体内实验），LINC00511敲除可以通过调节miR-29c/CDK6轴来增强紫杉醇对乳腺癌细胞的细胞毒性作用。如果能够有进一步的体内实验会更加完整。但是对紫杉醇耐药逆转的研究还有很长的路要走。
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