The American Journal of GASTROENTEROLOGY(IF=10.241)
10位原发性硬化性胆管炎患者的粪便微生物移植：一个试点的临床试验
研究背景
原发性硬化性胆管炎（Primary sclerosing cholangitis，PSC）是慢性胆汁淤积性疾病，其特征为肝内外胆管进行性炎症和纤维化，进而导致多灶性胆管狭窄。大多数患者最终发展为肝硬化、门静脉高压和肝功能失代偿【1,2】。原发性硬化性胆管炎多见于年轻男性，而且往往与炎性肠病（如溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）或克罗恩病（Crohn’s disease，CD）），尤其是UC（80%以上）有关【3】。用于治疗UC的药物尚未有效地降低炎症或缓解PSC的发生发展【4，5】。目前市场上没有药物通过食品和药物管理局（FDA）批准用于PSC治疗。最新研究发现粪便微生物移植（Fecal microbiota transplantation，FMT）改变了复发性艰难梭菌（Clostridioides difficile）感染的范式治疗手段，为其他慢性疾病的微生态治疗提供了思路【6】。此外，已有研究表明PSC与肠道微生物群的紊乱密切相关，因此，本研究旨在评估FMT治疗PSC患者的安全性，及其引起的肝酶表达、微生物群落以及胆汁酸代谢变化。
志愿者招募和粪菌移植
本研究通过Brigham and Women’s Hospital伦理审查委员会的伦理审查，以及社会公开招募并取得志愿者的知情同意（NCT02424175），Brigham and Women’s Hospital临床试验中心一共将10名PSC志愿者纳入FMT干预研究中。PSC患者的临床信息可参考Table 1。PSC志愿者人群都有6个月以上的临床确诊记录以及>1.5X碱性磷酸酶（ALP）表达，并且进行磁共振胰胆管造影确诊无肝硬化疾病。此外，排除4个星期内使用熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）、2个月内使用过抗生素、1个月内使用过益生菌或者益生元以及进行IBD治疗的患者。咪唑硫嘌呤（Azathioprine）和美沙拉嗪（mesalamine/5-ASA）被允许进行协同治疗。
粪菌捐献者筛选主要参考OpenBiome（Somerville）标准从已构建的粪菌库里筛选【7】。简言之，捐献者需要进行传染病、细菌、病毒、真菌和健康调查【8】。最终筛选出一位合格的粪菌捐献者进行粪菌移植。所有人员在FMT前都不能使用抗生素，之后通过结肠镜检查将90 mL 的菌群微生物定植在右结肠。后续分别收集粪菌捐献者baseline、粪菌受试者baseline和FMT治疗后1、4、8、12和24个星期的粪便样本，一方面进行16S rRNA V4区域的宏基因组学检测，另一方面进行胆汁酸非靶向代谢组学检测（55个胆汁酸：36个非结合性胆汁酸、12个牛磺酸结合性胆汁酸和7个甘氨酸结合性胆汁酸（Steraloids, Newport, RI）。
FMT后PSC患者血清肝酶变化
经过FMT粪菌移植后1、4、8、12和24个星期的观察，初期临床结果表明粪菌移植治疗PSC是相对安全的，并无相关不良临床事件发生。如图1所示，30%（3/10）PSC患者都出现了 ≥ 50%的ALP降低，70%（7/10）PSC患者都出现30%的丙氨酸转氨酶（ALT）或者天冬氨酸转氨酶（AST）的降低。后续因为有一患者无法忍受不使用UDCA，为了便于数据解读，将其进行移除。
图1. 每个患者的血清肝脏酶表达情况
A）原始血清肝酶强度；B）同baseline标准化的血清肝酶强度。虚线是 50% baseline的强度线。
FMT后PSC患者菌群变化
通过对粪便进行16S宏基因组学测序发现，如图2A所示，FMT前PSC患者的多样性与捐献者baseline具有显著性差异（P = 0.0058），FMT一周后PSC患者的多样性与捐献者接近而不具有显著性差异（P = 0.053）。此外，PSC受试者在FMT移植后的多样性于24周内稳步保持，并与健康捐献者接近（如图2B和2C）。
图2. FMT改善了PSC患者微生物多样性且与健康捐献者相似
A）PSC受试FMT前后1周alpha多样性变化；B）PSC受试者连续24周alpha多样性变化；C）PSC受试者与捐献者的相似度。
为了区分哪些菌群是FMT移植定植的，作者自定义将移植后的PSC患者粪便菌群分为 control OTUs、rare engrafters、frequent engrafters。control OTUs 是指捐献者粪便中没有但PSC患者粪便中有且在粪菌移植后增加的菌，rare engrafters 是指在少于50%PSC患者中经FMT移植定植的菌群，frequent engrafters 是指至少在50%PSC患者中经FMT移植定植的菌群。如图3所示，一共有2204个OTU属于 engrafter OTUs，其中24个是 frequent engrafters，里面有被报导的菌群，如 Desulfovibrio 和 Faecalibacterium 被发现在PSC患者中缺失【9，10】，而在FMT后显著性增加。此外，如图4所示，frequent engrafters 与ALP含量具有显著性关联性，而且在24个 frequent engrafters 中产短链脂肪酸的菌如属水平的 Odoribacter、 Alistipes和Erysipelotrichaceae incertae sedis【11】与ALP呈现显著性负相关作用。
图3. FMT后PSC患者中24个显著性定植菌群
图4. FMT后菌群与血清ALP的相关性
FMT后PSC患者胆汁酸代谢变化
对PSC患者粪便进行胆汁酸非靶向代谢组学研究，无师监督主成分分析（PCA）发现患者的胆汁酸代谢具有个体特异性（如图5A），并不能按照FMT移植时间周期进行区分（如图5B）。有师监督分析也无法区分开FMT移植时间周期，进一步表明FMT对个体胆汁酸代谢无显著性影响。此外，FMT移植前的PSC患者胆汁酸代谢谱与粪菌捐献者类似（如图5C）。
图5. 胆汁酸代谢的主成分分析（PCA）
为了研究血清中ALP含量与胆汁酸的关联：（1）使用多元回归分析PLS表明ALP含量与代谢物具有显著性关联（P<0.0001）；（2）使用斯皮尔曼关联分析，发现UDCA与肝酶具有显著性负相关作用（r = -0.423 for ALP, r = -0.53 for AST, r = -0.61 for ALT），三级胆汁酸（指从初级胆汁酸通过微生物代谢修饰形成的胆汁酸，如7α/β-异构化的鹅去氧胆酸形成UDCA）也与肝酶具有显著负相关作用（r = -0.40 for ALP, r = -0.56 for AST, r = -0.61 for ALT），而氨基结合性胆汁酸与肝酶具有显著性正相关作用（r = 0.39 for ALP, r = 0.41 for AST, and r = 0.43 for ALT）；（3）使用线性拟合模型发现ALP与三级胆汁酸显著性负相关（P = 0.0028，如图6A），ALP与牛磺胆汁酸和甘氨胆汁酸显著性正相关（P = 0.01，如图6B；P = 0.0004，如图6C）。
图6. 粪便胆汁酸与ALP的线性拟合分析
综上所述，该研究是全球第一个人体粪菌移植FMT进行PSC患者干预治疗的试验。研究初步表明FMT在PSC人群中治疗相对安全，但是仍然需要更多的人群进行随机双盲试验进行验证；PSC患者经过FMT移植后菌群多样性增高，定植度高的菌群与血清中降低的ALP具有显著性关联，未来需要对这些定植度高的菌进行分离培养，并解读他们在PSC患者体内的作用机制从而为靶向治疗提供数据支撑。
【参考文献】
1. Tsaitas C, Semertzidou A, Sinakos E. Update on inflammatory bowel disease in patients with primary sclerosing cholangitis. World J Hepatol ;6:178–87.
2. Lazaridis KN, LaRusso NF. Primary sclerosing cholangitis. N Engl J Med ;375:1161–70.
3. Ricciuto A, Kamath BM, Griffiths AM. The IBD and PSC phenotypes of PSC-IBD. Curr Gastroenterol Rep ;20:16.
4. Sinakos E, Marschall HU, Kowdley KV, et al. Bile acid changes after high- dose ursodeoxycholic acid treatment in primary sclerosing cholangitis: Relation to disease progression. Hepatology ;52:197–203.
5. Tabibian JH, O’Hara SP, Lindor KD. Primary sclerosing cholangitis and the microbiota: Current knowledge and perspectives on etiopathogenesis and emerging therapies. Scand J Gastroenterol ;49:901–8.
6. Kassam Z, Lee CH, Hunt RH. Review of the emerging treatment of Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation and insights into future challenges. Clin Lab Med ;34:787–98.
7. Smith MB, Kassam Z, Burgess J, et al. The international public stool bank: A scalable model for standardized screening and processing of donor stool for fecal microbiota transplantation. Gastroenterology ;148:S-211.
8. Dubois N, Ling K, Osman M, et al. Prospective assessment of donor eligibility for fecal microbiota transplantation at a public stool bank: Results from the evaluation of 1387 candidate donors. Open Forum Infect Dis ;2(Suppl 1):962.
9. Kummen M, Holm K, Anmarkrud JA, et al. The gut microbial profile in patients with primary sclerosing cholangitis is distinct from patients with ulcerative colitis without biliary disease and healthy controls. Gut ; 66:611–9.
10. Bajer L, Kverka M, Kostovcik M, et al. Distinct gut microbiota profiles in patients with primary sclerosing cholangitis and ulcerative colitis. World J Gastroenterol ;23:4548–58.
11. Vital M, Karch A, Pieper DH. Colonic butyrate-producing communities in humans: An overview using omics data. mSystems ;2:e00130–17.
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