自身免疫性疾病是多种因素相互作用的病理过程， T细胞、 B 细胞、树突状细胞，多种细胞因子和一系列基因改变，导致各种先天和适应性的免疫反应失调。因为治疗策略上选择同时靶向多个治病靶点，双特异性抗体是一个近年来迅速发展的药物开发策略，将两个靶向作用的抗体结合在一个分子上，起到同时治疗的目的。
本文介绍的Tibulizumab（LY3090106）是礼来公司开发的四价双特异性抗体，同时靶向B细胞激活因子（BAFF）和IL-17A。
BAFF及IL-17功能简介
Tibulizumab（LY3090106）是礼来公司研发，一种针对自身免疫性疾病的新型双特异性抗体，它不是一种专性双特异性抗体(需要双靶结合才能达到生物活性)，而是由两个独立作用的二价抗体组成的单剂组合。它可以被认为是一个“四头锤”，可以同时敲出两个不同的可溶性配体。这和礼来公司之前的单克隆抗体药物Tabalumab(anti-BAFF) ixekizumab（anti-IL-17）有着显著的不同， 单克隆抗体因为制剂不相容性，所以需要单独依次注射，但是双特异性抗体则可以解决这个问题。
BAFF：参与免疫系统的多个功能，但是最主要的功能是参与B细胞的发育和增殖。最初表达于一些细胞的膜表面，后面剪切下来，成为可溶性片段。BAFF表达失调，引起异常B淋巴细胞活化、增殖、存活和免疫球蛋白分泌，是引起自身免疫性疾病的重要因素。BAFF过表达的小鼠模型中，引起SLE及primary Sjögren’s syndrome (pSS)等自身免疫病。在人类，SLE、RA、PSS、IgA肾病和系统性硬化症患者中报告了血清BAFF水平的升高。因此，BAFF是B细胞驱动的自身免疫性疾病新疗法的合理靶点，BAFF单克隆抗体已经在人类临床试验中进行了测试，包括tabalumab和美国食品和药物管理局(FDA)批准的belimumab（GSK产品，贝利木单抗）。
IL-17细胞因子家族包含6个结构相关的异构体：IL-17A、IL-17b、IL-17c、IL-17d、IL-17e和IL-17F，它们具有不同的同源或异二聚体形成能力，导致特异性和信号强度的差异。这些细胞因子对控制感染，特别是细胞外真菌的感染非常重要。相反，如果不加抑制，它们可能导致自身免疫和慢性炎症的病理过程。这个家族的原型成员是IL-17A，在这里被称为IL-17辅助性细胞17(Th17)是T细胞的一个亚群，其特征是产生细胞因子IL-17.近年来，多项研究证实Th17细胞及其细胞因子IL-17在自身免疫性疾病中的致病作用，包括银屑病、银屑病性关节炎、RA、强直性脊柱炎和多发性硬化。IL-17及其受体均已被FDA批准的治疗性单克隆抗体靶向于几种不同的自身免疫适应症中，其中包括secukinumab, ixekizumab, and brodalumab。
Baff和IL-17以看似独立的方式单独参与了免疫病理。然而，BAFF通过激活B细胞和促进Th17细胞的增殖而影响适应性免疫和天然免疫应答。反过来，IL-17是BAFF介导的促炎作用的中心效应因子.同时中和BAFF和IL-17可能为自身免疫性疾病提供了一种简单的“分而治之”的治疗方式，这些细胞因子之间的交叉观察以及其他支持多个细胞类型的病理轴的研究都证明了这一点。
近年来，人们对多种双特异性抗体格式进行很多研究。尽管设计出了精巧的蛋白质工程解决方案，但链配对和组装、表达和稳定性等固有问题仍然是困难的挑战。单价IgG样双特异形式是最原生的结构，但每个配体只有一个结合位点。在靶向可溶性多聚配体的情况下，如三聚体BAFF和二聚体IL-17，这可能导致结合亲和力降低，并可能需要更高剂量的药物才能达到药物结合的效力。由于粘度和配方问题，这可能会对药物开发构成挑战。四价双特异性抗体设计在这方面具有潜在的优势。
四价双特异性抗体的设计及表征
礼来的这种新的四价双特异性抗体的基因系统生成、表征和蛋白质工程，从一个经典的IgG-单链可变片段(ScFv)格式开始。
IgG-scFv双特性抗体空间构型可以提供一种优势，例如双可变区-IgG，即内结合臂亲和力取决于可变区域配对、定向和连接体长度。稳定的双特异性抗体LY3090106在非人灵长类动物(NHP)中的体内表现出对BAFF和IL-17的中和作用，具有类似IgG的药动学特征。结果表明，蛋白质工程可以缓解溶解度和稳定性问题。
将ixekizumb 中的scFv融合到tabalumabHC的C端，构建了一株IgG-scFv。将ScFv可变重区(VH)和可变kappa区(VK)结构域通过甘氨酸柔性连接到mAb上。该双特异性分子在人胚肾293(HEK-293)细胞中表达，用标准ProteinA-Sepharose和大小排除层析(SEC)两步纯化，去除聚合体(<3%)。经纯化后，用表面等离子体共振(SPR)对其进行了配体结合表征。
如上图所示：双特异性抗体同时与两个配体结合，而与顺序无关BAFF三聚体和IL-17二聚体的化学计量与LY3090106的结合分别为1.1和1.4。这意味着BAFF三聚体主要以二价的形式结合模式，而 IL-17 二聚体结合涉及到单价和二价相互作用。相同的化学计量比是观察每个亲本抗体。纯化的IgG-scFv保存后，用分析SEC(ASEC)观察到随着时间的推移，高分子量组分(%HMW)增多。蛋白质的自组合性和结构完整性表现为浓度、pH和盐的依赖性。在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，当浓度限制在30 mg/ml时，在4°C下保存2d后，样品中的Hmw增加到15%以上，在10 mm柠檬酸盐pH 5配方中相同浓度下，聚集率增加到35%以上，相分离明显。
此外，在Stress条件下(40°c，1个月)进行的加速稳定性研究表明，化学降解包括scFv相邻系索4%的剪切，13%的scFv重链互补区(CDR)-H2 Met53氧化，12%轻链Cdr-L1 Asn 30(根据Kabat编号)脱氨。对ixekizumab没有观察到这些修饰，表明这些氨基酸在scFv环境中的溶剂暴露或局部环境有差异。进一步开发IgG-scFv分子需要重要通过工艺优化来缓解这些问题。
为了解决这种化学不稳定性问题，我们将不稳定的scFv氨基酸作为随机突变的靶点，并利用捕获转移方法（capture lift assay）筛选噬菌体表达的抗原结合片段(Fabs)。ELISA滴定测定表达。通过SPR检测选择突变，将首选的选择替换入scFv，这样，化学活性的Cdr-H2 met53和CDR-L1 Asn30分别用Thr和Glu替换。蛋白质表面上带相反电荷的残基之间的静电引力可有助于蛋白质的自结合倾向。对亲本scFv的表面电荷分布电位的计算显示了由酸性 Vh patch和碱性Vk patch产生的不同电荷偶极子。Asn30Glu突变消除了化学不稳定的来源，但也在带正电的Vk表面区域引入了一个酸性残留物。在CDR-L1 在 31 号位置包含一个 ASP的Vh.CDR-L 1 中针对主要带负电荷的贴片进行了额外的诱变 。通过诱变和筛选的变体对该氨基酸进行随机化，以在没有成功的情况下鉴定出电荷和亲和中性取代。第二种方法是用Arg或Lys取代相邻的CDR残基。酶联免疫吸附试验显示，Ser28lys的亲和力略有提高，并与Asn30glu相结合，提供了更加平衡的表面静电分布轮廓。
差示扫描量热法(DSC)显示单峰热折叠转变，中点(Tm)为73.1°c。 scFv相对较高的Tm意味着Fv的固有热不稳定性不是观察到蛋白质聚集的根本原因。纯化的scFv分子的浓度依赖性行为随后使用aSEC进行分析。0.55mg/ml的初始纯化scFv在溶液中基本上是单体的。在浓度为5.2mg/ml后，可能二聚的物种通过aSEC变得明显。单链抗体浓度进一步增加至15毫克/毫升，可能反映了二聚体、三聚体和四聚体scFv低聚物。
通过对浓缩样品的稀释，测试了 scfv自结合的可逆性。1∶20稀释导致更高阶物质的几乎完全溶解，这表明在这些条件下基本上可逆的相互作用。综上所述，高tm 和可逆自关联支持一种机制，即 VH / VL 界面的瞬态“呼吸”可以在高浓度下导致相邻分子之间的随机分子间相互作用，这些分子经历了类似于开放的 scFv 结构的转变。应该注意的是，虽然 scfv自聚合最初是可逆的，但长时间的储存最终导致不可逆的聚集形成。
一些工艺和筛选策略提高scFv界面的稳定性。一个解决方案是界面二硫键的工程 一种H44-1100二硫键，并对其进行了纯化和表征。二硫稳定的scFv的DSC曲线. 显示了两个热展开过渡，中点(Tm)为75.3°C和73.3°C，可能是由于单个VH和VK域的展开。因此，二硫键稳定化对单个fv结构域的温度诱导展开影响最小。显示了由aSEC表征的H44-L100scFv的浓度依赖性蛋白质自缔合。与亲本分子相反，二硫键稳定的scFv在浓度高达71mg/ml时没有显示出更高级别分子的可检测的形成，并且仍然是单体。优化后的IgGscFv的DSC曲线显示出一次热转变，中点为66.6°c，类似于tabalumab母体Mab。因此，我们得出的结论是，优化的scFv在双特异性抗体中有一个Tm大于或等于这个温度。
上表：体外亲和力检测
上图：体外中和实验
上图：体内中和实验
药物代谢动力学
体内B细胞抑制实验
结语
稳定的IgG-scFv(LY 3090106)在配体结合和靶中和的功能测试中有非常好的反应。同时结合两个配体BAFF和IL-17，拮抗B细胞增殖和IL-17诱导的趋化因子分泌。野生型和人BAFF转基因小鼠体内PD模型显示，LY 3090106具有亲本样IL-17和BAFF配体中和活性。猴体内功能完整，半衰期与标准单抗一致，未见抗药物抗体应答。此外，LY 3090106结合的半胱氨酸BAFF和IL-17表明，在体内两种水平的提高，测量到的药物耐受性靶标接触试验。最后，LY 3090106诱导B细胞数量呈剂量依赖性减少，提示体内BAFF中和作用。这些结果共同证明了LY 3090106是一个高强度和稳定双特异性抗体。
参考文献：
LY 3090106正在进行的临床试验：A Multiple Ascending Dose Study to Evaluate the Safety, Tolerability, Pharmacokinetics, and Pharmacodynamics ofSjögren’s Syndrome” (ClinicalTrials.govIdentifier: NCT02614716).
Development of tibulizumab, a tetravalent bispecific antibody targeting BAFF and IL-17A for the treatment of autoimmune disease，Robert J. Benschop, etc.MABS，,Eli Lilly and Company Corporate Center.
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